单细胞分辨率下透明化胚胎及出生后心脏的成像

摘要

我们介绍一种用于对完整胚胎期和出生后心脏内部标记有荧光蛋白的细胞进行三维成像的实验方案。通过结合组织透明化方法与整体染色技术，可清晰、准确地成像胚胎期或出生后心脏内部的单个荧光蛋白标记细胞。

摘要

在全心脏水平上进行单克隆谱系示踪与分析，可确定心脏发育过程中心脏前体细胞的行为及其分化特征，并有助于研究正常与异常心脏形态发生过程中的细胞与分子基础。近年来新兴的回顾性单克隆分析技术，使得在单细胞分辨率下研究心脏形态发生成为可能。然而，随着成像深度的增加，心脏组织的不透明性及光散射问题限制了在单细胞分辨率下对全心脏进行成像。为克服这些障碍，必须开发一种能够使胚胎整体透明化的清除技术，以显著提高心脏在照明与检测方面的通透性。幸运的是，在过去数年中，已有多项全生物体透明化方法被报道，包括CLARITY、Scale、SeeDB、ClearT、3DISCO、CUBIC、DBE、BABB和PACT等。本实验室致力于研究心脏形态发生的细胞与分子机制。近期，我们利用ROSA26-Cre^ERT2；ROSA26-Confetti系统实现了单细胞谱系示踪，可在心脏发育过程中稀疏地标记细胞。我们整合了多种胚胎整体透明化方法（包括Scale和CUBIC（clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis，透明无阻脑成像试剂与计算分析）），结合整体染色技术，以实现对心脏内单个克隆的成像。最终成功在单细胞分辨率下对心脏进行了成像。我们发现，Scale可有效清除胚胎心脏，但无法有效清除出生后心脏；而CUBIC虽可清除出生后心脏，却会因溶解组织而损伤胚胎心脏。本文所述方法将有助于在单克隆分辨率下研究心脏形态发生过程中基因的功能，进而揭示先天性心脏病的细胞与分子基础。

引言

心脏形态发生是一个连续的过程，需要将四种不同类型的心脏前体细胞在时空上有序地组织到心脏的不同区域，同时还需要多个遗传调控网络协调这一过程，以形成具有功能的心脏^1,2。心脏的特化、分化、模式形成以及心腔成熟均受到心脏发生相关转录因子的调控³。这些因子在心脏前体细胞中若发生基因突变或转录后异常，可能导致胚胎致死或先天性心脏病（CHD）⁴。对心脏形态发生的研究需要深入理解其三维（3D）结构的内在细节，而对心脏发育过程中单个标记的心脏前体细胞谱系进行追踪，将有助于加深对心脏形态发生的认识。过去几十年中，已发展出多种基于高分辨率切片的断层成像技术用于器官结构成像^5,6；然而，这些方法需要昂贵且专用的仪器，工作量大，并且在最终重建的三维图像中缺乏单细胞分辨率下的精细结构信息^7,8。

在单细胞水平上进行三维体成像为研究前体细胞分化及细胞行为提供了有效手段 体内⁷然而，组织的光散射仍然是对完整心脏内部深层三维结构中的细胞和组织进行成像的主要障碍。脂质是光散射的主要来源，去除脂质和/或调节脂质与其周围区域之间的折射率差异，是提高组织透明度的潜在策略。⁸近年来，已开发出多种组织透明化方法，可降低组织不透明度和光散射，例如 BABB（苯甲醇与苯甲酸苄酯混合物）和 DBE（四氢呋喃与二苄基醚）；但在这些方法中，荧光淬灭问题仍然存在^8-10基于溶剂的亲水性方法（如 SeeDB（果糖/硫甘油）和 3DISCO（二氯甲烷/二苄醚））能够保留荧光信号，但无法使整个器官达到透明。^7,8,11相比之下，CLARITY 组织透明化方法可使器官透明，但需要使用专门的电泳装置来去除脂质^8,12，PACT（被动透明化技术）也是如此，该技术同样需要水凝胶包埋^7,13有关所有可用组织透明化方法的详细信息，请参阅 表1 在理查德森和利希特曼， 等⁷.

2011年，Hama 等 偶然发现了一种亲水性混合物“Scale（尿素、甘油和Triton X-100混合物），可使小鼠大脑和胚胎透明化，同时完全保留标记克隆的荧光信号¹⁴。这使得能够在数毫米深度对完整大脑进行成像，并以亚细胞分辨率大规模重建神经元群体及其投射。Susaki 等人进一步改进了 Scale 通过添加氨基醇，开发了“CUBIC”（透明、无阻碍的脑成像试剂与计算分析）组织透明化方法，该方法增强了磷脂的溶解性，缩短了透明化时间，并实现了多色荧光成像⁸在本研究中，利用Scale 以及CUBIC组织透明化技术与高分辨率三维光学切片，对心脏发生过程中心内的单个克隆进行了示踪 Rosa26Cre^{ERT2 15}, R26R-Confetti¹⁶αMHC-Cre¹⁷, cTnT-Cre¹⁸, Nfatc1-Cre¹⁹, 和 Rosa26-mTmG (mTmG)²⁰ 小鼠品系。结合先前开发的全胚染色（WMS）方法^21,22 通过组织透明化方法，可对已标记的克隆进行其他蛋白质的染色，并在三维体积环境中研究其行为。组织透明化与WMS技术的结合，有助于更深入理解不同基因和蛋白质在心脏发育过程中的作用，以及先天性心脏缺陷的病因。该方案可应用于研究发育过程中其他前体细胞的分化、细胞行为及器官形态发生事件。

方案

所有动物实验均经奥尔巴尼医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并依照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》进行。

1. 溶液配制

注意： Rosa26Cre^{ERT2 15}, R26R-Confetti¹⁶αMHC-Cre¹⁷,和 Rosa26-mTmG (mTmG)²⁰ 小鼠品系为商业购买。 cTnT-Cre¹⁸ 由阿拉巴马大学Jiao博士惠赠。 Nfatc1-Cre 由阿尔伯特·爱因斯坦医学院 Bin Zhou 博士惠赠¹⁹小鼠在密闭容器中通过吸入二氧化碳实施安乐死，持续至少60秒，随后采用双侧开胸、断头或颈椎脱位等物理方法确认死亡。

1. 制备他莫昔芬。将10 mg他莫昔芬溶解于10 ml葵花籽油中。完全溶解后，分装并保存于-20 °C。
2. 制备磷酸盐缓冲液（PBS）。将Na₂HPO₄（1.41960 g）、KH₂PO₄（0.24496 g）、NaCl（8.0669 g）和KCl（0.20129 g）溶于1 L蒸馏水中，并调节pH至7.4。
3. 制备含0.1% Tween-20的PBS溶液（PBST）：将100 μl Tween-20溶解于100 ml PBS中。
4. 制备封闭缓冲液。将3 g牛血清白蛋白（BSA）溶解于100 ml含0.2% Tween-20的PBST中，配制成3% BSA封闭溶液。
5. 制备CUBIC-1（试剂1）。将25 wt%尿素、25 wt% N, N, N', N'-四(2-羟丙基)乙二胺和15 wt% Triton X-100溶于dH₂O中混合。
6. 制备CUBIC-2（试剂2）。将50 wt%蔗糖、25 wt%尿素、10 wt% 2, 2′, 2′′-三羟乙基胺和0.1%（v/v）Triton X-100溶于dH₂O中混合。
7. 制备Scale A2：将4 M尿素、10% w/v甘油和0.1% w/v Triton X-100溶于dH₂O中，调节pH至7.7。
8. 制备Scale B4：将8 M尿素和0.1% w/v Triton X-100溶于dH₂O中，调节pH至8.7。
9. 制备Scale 70：将4 M尿素、70% w/v甘油和0.1% w/v Triton X-100溶于dH₂O中。

2. 他莫昔芬诱导、胚胎分离与固定

1. 他莫昔芬诱导与胚胎分离
   1. 使用经批准的弯曲喂食管方案（ACUP 13-12007），在胚胎发育第7.75天（E7.75）³³，以10 µg/g剂量对R26Cre^ERT2 Confetti雌性小鼠（由R26Cre^ERT2雄性小鼠交配形成受精栓）进行灌胃给药。在胚胎第9.5天（E9.5）或E10.5时，采用CO₂吸入结合颈椎脱位法处死雌性小鼠。
   2. 确认小鼠死亡后（见第1节注释），用剪刀打开小鼠腹腔，取出子宫角，借助剪刀和镊子去除子宫管层，并将胚胎从子宫管中释放出来^23,24。
      1. 将胚胎转移至含有PBS（pH 7.4）的培养皿中。在解剖显微镜下，使用镊子去除非胚胎组织层（绒毛膜、卵黄囊和羊膜）。
   3. 使用镊子和剪刀采集雌性小鼠及胚胎尾部样本用于基因分型，方法如前所述²²。使用塑料移液管将每个胚胎转移至含有1 ml 1× PBS的48孔板中的单个孔内。
   4. 在荧光显微镜下，通过带相机的倒置显微镜识别GFP/RFP/CFP阳性胚胎。使用镊子剥离心包膜，并借助弯头镊子旋转心脏/胚胎，利用GFP/RFP/CFP滤光片确定心脏两侧的荧光克隆数量。无需进行切开操作。
2. 识别出GFP/RFP/CFP阳性胚胎后，在室温（RT）下于48孔板中用1× PBS快速洗涤胚胎两次，每次2分钟，置于摇床上操作。此步骤可去除多余血液。
3. 使用4%多聚甲醛（PFA）在室温（RT）下固定胚胎/胚胎心脏。固定时间取决于胚胎发育阶段和组织大小。对于E9.5胚胎，室温固定2小时。晚期胚胎阶段的样本需要更长的固定时间，出生后心脏甚至可延长至24小时。
   注意：多聚甲醛具有毒性，避免接触皮肤、眼睛和黏膜。
4. 固定完成后，在室温下于48孔板中用1× PBS在摇床上洗涤胚胎/心脏两次，每次10分钟，以去除残留的PFA。随后对胚胎进行整体染色和组织透明化处理。

3. 整体染色

注意：PFA 固定后，胚胎/心脏按如下步骤进行整体染色。

1. 在48孔板中使用1 ml 0.1% PBST，在室温下于板式摇床上孵育2小时，对胚胎/心脏进行通透处理。
2. 通透处理后，将胚胎/心脏浸入1 ml封闭缓冲液中，在4 ºC下于板式摇床上孵育2小时或过夜。
3. 将胚胎/心脏浸入内皮细胞特异性抗体PECAM（CD31）中，用0.3 ml封闭缓冲液按1:100稀释，于4 ºC下在板式摇床上孵育48小时。
4. 用PBST在室温下于板式摇床上清洗胚胎/心脏5次，每次30分钟，以去除组织中非特异性结合的过量一抗。
5. 将胚胎/心脏浸入Alexa Fluor 647标记的山羊抗大鼠二抗中，用1 ml封闭缓冲液按1:1,000稀释，于4 ºC下在板式摇床上孵育48小时。
6. 重复步骤3.4，以清洗未结合的二抗。
7. 在室温下于板式摇床上用4% PFA对胚胎/心脏后固定1小时，并用PBS清洗两次，每次5分钟。
8. 在室温下于板式摇床上用核染料4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色10分钟（DAPI用PBST稀释至浓度0.01 mg/mL），随后用PBS清洗两次，每次5分钟。

4. 使用 Scale 或 CUBIC 方法进行胚胎/心脏组织透明化

注意：整体染色后，胚胎/心脏需进行 Scale 或 CUBIC 组织透明化处理。方法的选择取决于组织大小和胚胎发育时期。对于 E11.5 或更早期的胚胎，应采用 Scale 组织透明化方法；而对于较晚期胚胎或出生后心脏，则优先使用 CUBIC 组织透明化方法。

1. 组织透明化技术
   1. 将胚胎/心脏与1 ml Sca共同孵育l在4 °C下，将A2溶液置于闪烁瓶中（用铝箔包裹），偶尔轻轻手动摇晃，孵育48小时。
   2. Sca 之后le A2 孵育，将胚胎/心脏与 1 mL Sca 共同孵育l在4 °C下，于同一小瓶中用e B4溶液继续孵育48小时，期间偶尔轻轻摇动。
   3. 将胚胎/心脏继续孵育48小时，加入1 ml Scal在4°C下轻轻振荡孵育70分钟。使用90%甘油封片（见第5.1节）。
2. CUBIC 组织透明化方法
   1. 对于整体胚胎/心脏的CUBIC透明化处理，将每个胚胎/心脏浸入1 ml CUBIC-1溶液中，在37 ºC下偶尔轻柔振荡孵育48小时⁷48小时后，将溶液更换为相同体积的新鲜CUBIC试剂1，在37 °C继续孵育样品额外48小时，期间偶尔手动振荡。
   2. 用1× PBS在室温下轻轻手动振荡，多次清洗经CUBIC-1处理的心脏/胚胎，以去除残留的CUBIC-1溶液。
   3. 用 PBS 洗去 CUBIC-1 后，将胚胎/心脏浸入 CUBIC-2 溶液中（每胚胎/心脏 1 g），在 37 ºC 下孵育 48 小时，期间偶尔手动轻轻振荡。此步骤在使用甘油进行胚胎/心脏封片后进行（见第 5.2 节）。

5. 样品安装与成像

注意：Sca 中已透明化的胚胎或器官le 70 或 CUBIC-2 溶液可分别直接使用 Scale 70 和 CUBIC-2 溶液作为成像介质进行成像。然而，考虑到胚胎样本对透明化试剂较为敏感，若样本不立即成像而需长期保存，请按照以下方案将其保存于 90% 甘油中。

1. 将Scale透明化处理的样本直接浸入1 ml 90%甘油中，于4 °C保存直至成像。
2. 用1× PBS清洗CUBIC处理的样本两次，每次5分钟；随后依次将样本置于1 ml 30%、50%、70%和90%甘油溶液中，每种浓度孵育30分钟。
3. 成像时，将样本转移至含少量90%甘油的玻璃底培养皿中，使用配备双光子功能的共聚焦显微镜对克隆进行成像。
4. 在甘油中使用10X/0.3 NA、25X/0.8 NA浸没式或40X/1.2 NA水校正物镜对心脏或胚胎进行成像。使用相干钛：蓝宝石Chameleon激光器通过双光子激发成像DAPI。显微镜和物镜的选择取决于实验目的，例如，如需超分辨率成像，可采用光片荧光显微镜。

结果

成像透明化处理的胚胎心脏

脊椎动物心脏的形成是一个受时空调控的形态发生过程，依赖于来自四个不同来源的前体细胞的组织与分化¹。心脏新月区第一心场的细胞将向腹侧中线折叠，形成线性心脏管。第二心场的细胞最初位于第一心场的背内侧，随后迁移至咽部和脏壁中胚层，并由此迁移至已存在的线性心脏管支架。第二心场的细胞将贡献于右心室、流出道（OFT）心肌以及部分心内膜^25-28。起源于耳后菱脑节6、7和8的心脏神经嵴细胞（CNCC）将迁移至尾部咽区，显著参与流出道平滑肌层和心内膜垫的形成，同时也参与动脉干隔膜的形成^29,30。第四类细胞群为来自前心外膜器官（PEO）的心外膜细胞，可分化为成纤维细胞、平滑肌细胞以及潜在的其他心脏细胞类型³¹。心外膜调控冠状血管发育、心脏生长及形态发生²¹。

讨论

胚胎分离是一个非常关键的步骤。E9.5时期的胚胎非常脆弱且体积微小，因此在分离过程中需格外小心，避免损伤胚胎或心脏结构。在对整个胚胎进行成像时，应仔细去除包裹胚胎或心脏的非胚胎性外层组织。这有助于抗体和透明化混合液充分渗透至胚胎组织内部，同时也有助于在成像时减少背景信号。我们检测了多种抗体，包括针对PECAM、乙酰化α-微管蛋白和整合素β1的抗体，均成功检测到目标信号（数据未显示）³³。这表明，在此透明化过程中，分子完整性、细胞完整性以及抗原的兼容性均未受到破坏。

使用宽口移液管（剪去管尖）转移胚胎/心脏，以避免操作过程中造成损伤。应仔细记录心脏中GFP/YFP/RFP/CFP的表达模式及克隆数量，以确定标记每个心脏（或其他器官）仅含一个克隆的合适剂量。由于他莫昔芬剂量较低（10 μg/g），有时心脏中可能不含任何克隆，或难以检测到克隆。因此，建议利用卵黄囊来判断胚胎是否含有GFP/YFP/RFP/CFP标记的克隆。

胚胎或心脏固定是关键步骤，过度固定会导致背景信号过高，而固定不足则会导致染色效果差。建议...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,2′,2′’三乙醇胺	Sigma Aldrich	90279
PBS 中的 4% 多聚甲醛	Affymetrix	19943
BSA	Fischer Scientific	BP16000
N,N,N’，N’四(2-羟丙基)乙二胺	Sigma Aldrich	122262
磷酸盐缓冲液	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
尿素	Sigma Aldrich	U-1250
蔗糖	Sigma Aldrich	84097
甘油	Sigma Aldrich	G8773
他莫昔芬	Sigma Aldrich	T5648
葵花籽油	Sigma Aldrich	S5007
Tween 20	Sigma Aldrich	P1379
PECAM（CD31）	BD Pharmingen	550274
Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21247
DAPI 核染色	Sigma Aldrich	D9542
37oC 型培养箱	赛默飞世尔 Fischer	Heratherm，紧凑型微生物培养箱
48 孔板	细胞治疗	229148
分析天平	梅特勒-托利多	PB153-S/FACT
共聚焦显微镜	Zeiss	Zeiss 510 共聚焦显微镜
体视显微镜	Unitron	Z850
荧光显微镜	Zeiss	观察者。Z1
Germinator 500 玻璃珠灭菌器	CellPoint Scientific	GER-5287-120V
光源	SCHOTT	ACE I
剪刀	Fine Science Tools	14084-08
直径60 mm × 高15 mm的培养皿	TPP Techno Plastic Products AG	93060
Rocker II  平台摇床	博克尔科学公司	260350
闪烁管	Fischer Scientific	03-337-26
移液管	萨姆科科学公司	202
镊子	Fine Science Tools	11251-20