测量体外的酶学性质ATP酶活性

ATP 酶是所有生命界中许多过程中不可或缺的酶。ATP 酶充当分子马达，利用 ATP 水解的能量为蛋白质运输、去折叠和组装等各种反应提供动力;复制和转录;细胞代谢;肌肉运动;细胞运动;和离子泵^{送 1-3}。一些 ATP 酶是参与跨膜运输溶质的跨膜蛋白，其他 ATP 酶是细胞质的，可能与生物膜（如质膜或细胞器的质膜）相关。

AAA+ ATP 酶（与各种细胞活动相关的 ATP 酶）构成了一大类 ATP 酶，它们具有一定的序列和结构保守性。这些蛋白包含保守的核苷酸结合基序，如 Walker-A 和 -B 框，并在其活性状态下形成寡聚体（通常为六聚体）¹。这些蛋白质在核苷酸结合后的巨大构象变化已在 AAA+ 家族的不同成员中得到表征。EpsE 是一种 AAA+ ATP 酶，是 NTP 酶^4-6 细菌 II/IV 型分泌亚家族的成员。EpsE 为霍乱弧菌的 II 型分泌 （T2S） 提供动力，霍乱弧菌是霍乱的病原体。T2S 系统负责分泌多种蛋白质，例如毒力因子霍乱毒素，当霍乱弧菌定植于人类小肠时，它会引起大量水样腹泻⁷。

定量体外 ATP 酶活性的技术多种多样，但通常使用比色、荧光或放射性底物来测量磷酸盐释放^8-11。我们描述了一种使用基于市售含孔雀石绿底物的比色测定法测定纯化蛋白质的体外 ATP 酶活性的基本方法，该底物测量释放的无机磷酸盐 （Pi）。在低 pH 值下，孔雀石绿钼酸盐与 Pi 形成络合物，可以在 650 nm 处测量络合物形成的水平。这种简单而灵敏的测定可用于对新的 ATP 酶进行功能表征，并评估潜在激活剂或抑制剂的作用，确定结构域和/或特定残基的重要性，或评估特定处理对酶活性的影响。

1.执行与纯蛋白水解ATP反应

1. 备齐试剂的股票与纯蛋白孵化。
   1. 制备含有100mM HEPES pH 8.5的65毫摩尔NaCl和5％甘油（或其它测定缓冲液适当）5倍的HEPES /氯化钠/甘油（HNG）缓冲器。
   2. 制备的100mM的MgCl _2（或其他金属，如果ATP酶是金属依赖性）的水。
   3. 准备新鲜的100毫米ATP在200毫米的Tris基地使用高纯度的ATP（不进一步调整pH值）。等分试样并储存的ATP库存在-20℃下不超过几个星期长，作为ATP的会分解随着时间的推移，从冷冻和解冻的ATP库存避免。
   4. 预混物的MgCl ₂和ATP在1:1的比例只是之前设置ATP的水解反应。
2. 准备和标记1.5毫升管的定期整个反应过程中采集样品。准备在试管时间0和时间15，30收集样品，45和60分钟。
   注意:作为替代，只在时间0和端点收集样品。
   1. 添加245微升1×HNG缓冲向每个管中以稀释来自ATP的水解反应1时50收集的样品。
3. 制备干冰和乙醇的浴快速冷冻样品，使反应停止。在橡胶冰桶或其他安全的（非塑料）容器中，加几片干冰和精心浇足70-100％的乙醇覆盖干冰。
4. 稀释纯化的蛋白质在1X HNG缓冲，适当（一般为5-10μM），并保持在冰上。
5. 成立了ATP水解反应。
   1. 在单独0.5毫升管每个样品中，添加以下试剂（按顺序）:H ₂ O（最多30微升的最终体积），6微升的5倍的HNG或其他缓冲液，3微升100mM的MgCl ₂ -ATP混合物和0.25-5μM蛋白质。
   2. 包括一个缓冲器只阴性对照，其中不加入蛋白的条件。
6. 在时间0除去从反应5微升，在含有245微升的HNG缓冲液中制备的1.5毫升管稀释1:50，并立即冷冻在干冰/乙醇浴中的样品。
7. 孵育在37℃下反应以允许发生1小时ATP水解。在每个时间间隔（15，30，45，和60分钟），从反应除去5微升等份，并加入到含有HNG缓冲如在步骤1.6标记的样品管中。
8. 在ATP水解反应结束时，将稀释的样品到-80℃冷冻贮存。为了确保所有的样品完全冷冻，等待出发前至少10分钟。

2.样品孵育含有游离皮与检测试剂

1. 在室温（从步骤1.6和1.7获得）包含在每个时间点ATP水解反应等分试样解冻稀释的样品。
2. 建立含有样品和磷酸盐标准的96孔板中。
   1. 在0.5ml的涂是，加入5.5微升800微米标准104.5微升HNG缓冲液稀释800微米至40微米的磷酸盐标准（带有皮检测试剂）。拌匀，并加入100微升此40μM丕标准，做好对A1 96孔板。
   2. 加入50μlHNG缓冲井B1-H1为1:郫县标准的1系列稀释。
   3. 从A1孔中取出50微升40μM丕并加入50微升分析缓冲液中以及B1，混合，并从B1孔取出50微升，并通过精心G1增加以及C1，继续稀释。混合，以保证每口井都有相同的体积后丢弃以及G1 50微升。那么H1应该只包含创建丕标准从40到0μM缓冲区。
      注意:如果一个附加的因子（例如抑制剂）已被添加到样品中，创建包含该因子以控制在这些条件下在磷酸盐释放或吸光度的变化的标准曲线。
   4. 加入50微升每个SAMP的勒式两份的板。和不同的时间点水平;从在列同一时间点垂直（样品2时间0 = B2，B3样品1时间0 = A2，A3）添加样品。这允许多达8个样品，每个板5的时间点。
3. 使用无菌移液管，以除去足够的孔雀石绿/钼酸丕检测试剂至100μl添加至各含有样品和标准孔（试剂需要（毫升）=样品和标准的0.1×数），并加入到便于吸移一个菜使用多通道移液管。不直接倒入检测试剂放入盘中，因为皮污染可能发生。
4. 使用多通道移液管，从最后的时间点添加100微升丕检测试剂至各孔并混合通过小心地上下吹打次数一致的号码而不引入气泡，优选以所述第一时间点。
5. 孵育在室温下25分钟的盘，或根据马nufacturer的指示。

3.定量结果使用酶标仪

1. 使用吸光度酶标仪读取样品的吸光度在650nm处。
2. 做一个皮标准曲线。使用绘图软件，图形，以便找到用于解决磷酸盐的每个样品中的量的方程为PI标准样品与浓度的吸光度值。
3. 通过用磷酸盐标准校准计算各样品的ATP酶活性。磷酸盐释放=（OD ₆₅₀ - Y轴截距）/斜率。
   1. 从每个样品的重复平均总皮。减去这个数字的唯一缓冲控制的吸光度。稀释倍数乘以（在本例中50）。
   2. 确定每个微摩尔蛋白释放纳摩尔皮。在动力学分析作图对于每个时间点，这些值应产生至少R = 0.99（ 图1）的线性拟合;如果n催产素，该测定可以与更多或更少的蛋白质或长或短的孵育时间进行调整。
4. 表示的结果以nmolπ/微摩尔蛋白/分钟（ 图2,3），或以nmolπ/微克蛋白/分钟如果需要的话。

所述T2S ATP酶EPSE 的体外活性可通过EPSE的共纯化与EPSL（EPSE-cytoEpsL）的胞质结构域和另外的酸性磷脂心磷脂12的刺激。另外，也可以通过比较野生型（WT）的活性，使用该测定的蛋白质的变异形式，以确定在ATP水解特定EPSE残基的作用。这里，替换在EPSE锌结合域中的两个赖氨酸残基的作用是通过纯化的WT EPSE-cytoEpsL的ATP酶活性的比较对EPSE K417AK419A-cytoEpsL变体测定的。在图1中 ，磷酸根释放超过1小时的动力学测定法中，用于动力学ATP酶活性的精确定量的要求的过程中直线前进，从同一纯化的蛋白质样品为图1中一式两份测定三次并定量图2显示的数据就......而言磷酸盐释放的平均速率。这些数据表明，K417和K419似乎是EPSE ATP酶活性重要的。然而，未刺激的（无心磷脂）ATP酶活性率的比较（ 图3）表明，K417和K419没有贡献EPSE的基础活性，而是与蛋白质的由心磷脂刺激的能力。在EPSE锌结合结构域的带正电荷的赖氨酸可以直接与带负电荷的磷脂相互作用，从而有利于EPSE ATP酶活性的磷脂介导的刺激。

图1: 磷酸盐是在动力学ATP酶测定线性发行每小时动能心磷脂刺激ATP酶测定0.5μM的WT EPSE-cytoEpsL的磷酸盐释放比较EPSE K417AK419A-cytoEpsL用牛血清白蛋白（BSA）测定为。阴性对照。数据[释放磷酸盐（y轴）对时间（x轴）的量]作图，并进行线性回归分析。斜率表示ATP水解的速率。代表图线性回归方程的三种蛋白质所示。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2: 双赖氨酸突变EPSE锌结合域减少激ATP酶活性的1小时动能心磷脂刺激ATP酶测定法用相同的蛋白质和条件的结果如在图1测定的技术重复的和进行三个独立的倍ATP水解的速率计算为每μMPR每分钟产生纳摩尔磷酸盐 otein利用线性回归方程。与平均值的标准差结果显示， 请点击这里查看该图的放大版本。

图3:EPSE锌结合结构域的双赖氨酸突变不与未刺激的ATP酶活性的干扰隔夜（16小时）端点未刺激（无心磷脂）ATP酶测定5微米WT EPSE-cytoEpsL的活性与BSA比较EPSE K417AK419A-cytoEpsL。作为阴性对照。测定在技术重复进行三次不同的时间，并与标准误差平均值的结果被示出。测定在16小时的时间内未刺激EPSE ATPase活性的基础水平是〜1000倍低于1小时动能心磷脂刺激活性。e.com/files/ftp_upload/54305/54305fig2large.jpg"目标="_空白">点击此处查看该图的放大版本。

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