测量 体外 用于酶学表征的ATP酶活性

摘要

我们描述了一种用于定量的基本实验方案 体外 ATP酶活性。本方案可根据特定纯化ATP酶的活性水平和实验需求进行优化。

摘要

三磷酸腺苷水解酶（ATPases）在多种细胞功能中发挥关键作用。这些动态蛋白能够为机械功提供能量，例如蛋白质转运与降解、溶质运输以及细胞运动。本文所述方案是一种用于测定ATP酶活性的基本检测方法。 体外 用于功能表征的纯化ATP酶活性检测。蛋白质在反应中水解ATP并释放无机磷酸盐，随后通过比色法测定所释放磷酸盐的量。该实验方案具有高度可调性，可调整用于动力学或终点法测定ATP酶活性。本文提供了一个代表性实验方案，基于EpsE的活性与需求，EpsE是参与细菌II型分泌系统的AAA+ ATP酶 霍乱弧菌纯化蛋白的用量、测定活性所需的反应时间、取样间隔的时间点及次数、缓冲液和盐的组成、温度、辅因子、刺激物（如有） 等等。 可能与本文所述情况存在差异，因此可能需要进行一些优化。本方案为ATP酶的表征提供了基本框架，可快速实施，并可根据需要轻松调整。

引言

ATP酶是生命所有界别中多种生理过程的关键酶类。ATP酶作为分子马达，利用ATP水解产生的能量驱动多种反应，包括蛋白质的转运、去折叠和组装；复制与转录；细胞代谢；肌肉收缩；细胞运动以及离子泵送^1-3。部分ATP酶为跨膜蛋白，参与溶质跨膜运输；另一些则位于细胞质中，可能与质膜或细胞器膜等生物膜相关联。

AAA+ ATP酶（与多种细胞活动相关的ATP酶）是一大类具有部分序列和结构保守性的ATP酶。这些蛋白质含有保守的核苷酸结合基序，如Walker-A和Walker-B盒，并在其活性状态下形成寡聚体（通常为六聚体）。¹AAA+ 蛋白家族中不同成员在结合核苷酸后会发生显著的构象变化。EpsE 是一种 AAA+ ATP 酶，属于细菌 II/IV 型分泌系统的 NTP 酶亚家族^4-6EpsE 为 II 型分泌（T2S）提供动力 霍乱弧菌，霍乱的致病因子。T2S系统负责分泌多种蛋白质，例如毒力因子霍乱毒素，该毒素可引发严重的水样腹泻 V. cholerae 定植于人体小肠⁷.

定量技术 体外 ATP酶活性的测定方法多样，但通常使用比色法、荧光法或放射性标记底物来检测磷酸盐的释放^8-11. 我们描述了一种用于确定的基本方法 体外 使用基于市售含孔雀绿钼酸盐....

方案

1. 使用纯化蛋白进行ATP水解反应

1. 准备孵育纯化蛋白所需的所有试剂储备液。
   1. 配制5倍浓度的HEPES/NaCl/甘油（HNG）缓冲液，包含100 mM HEPES（pH 8.5）、65 mM NaCl和5%甘油（或根据实验需要选择其他缓冲液）。
   2. 将100 mM MgCl₂（或其他金属离子，若ATP酶依赖金属离子）溶于水中。
   3. 使用高纯度ATP，将其溶于200 mM Tris碱液中，新鲜配制100 mM ATP溶液（不再调节pH）。分装后于-20 °C保存，保存时间不超过数周，因ATP会随时间降解，避免反复冻融ATP储备液。
   4. 在开始ATP水解反应前，立即将MgCl₂与ATP按1:1比例预混。
2. 准备并标记若干1.5 ml离心管，用于在反应过程中定期取样。准备在0、15、30、45和60分钟时间点收集样品的离心管。
   注意：也可仅在0分钟和反应终点取样。
   1. 向每管中加入245 µl 1倍浓度HNG缓冲液，以便将ATP水解反应中采集的样品稀释50倍。
3. 准备干冰与乙醇混合浴，用于快速冷冻样品以终止反应。在橡胶冰桶或其他安全（非塑料）容器中加入数块干冰，并小心倒入足量70–100%乙醇，直至完全覆盖干冰。
4. 根据需要（通常为5–10 µM），....

结果

的 体外 T2S ATP酶EpsE的活性可通过与EpsL的胞质结构域（EpsE-cytoEpsL）共纯化并添加酸性磷脂心磷脂而得到增强¹²还可以通过该检测方法比较野生型（WT）与蛋白质变体形式的活性，来确定特定EpsE残基在ATP水解中的作用。此处通过比较纯化的野生型EpsE-cytoEpsL与EpsE K417AK419A-cytoEpsL变体的ATP酶活性，测定EpsE锌结合结构域中两个赖氨酸残基替换所产生的影响。在 图1在1小时的动力学测定过程中，磷酸盐的释放呈线性进行，这是准确量化动力学ATP酶活性的必要条件。 图2 显示来自相同纯化蛋白质样品的数据，如 图1 经重复三次双样本测定，并以磷酸盐释放的平均速率进行定量。这些数据表明，K417 和 K419 对 EpsE ATPase 活性似乎具有重要作用。然而，未刺激条件下（无心磷脂）ATPase 活性速率的比较（图3) 表明 K417 和 K.......

讨论

这是一种用于测量的通用方案 体外 纯化蛋白的ATP酶活性测定用于生化表征。该方法易于优化，例如通过调整蛋白用量、缓冲液和盐的组成、反应温度，以及改变检测时长和时间间隔（包括增加总间隔数），可提高活性定量的准确性。市面上可购得的基于孔雀绿的试剂具有高灵敏度，可检测微量游离磷酸盐（在100 µl体系中约50 pmol）。由于该检测方法灵敏度高，必须使用一次性塑料器皿、超纯水以及不含磷酸盐污染的缓冲液和试剂。蛋白纯化后，建议采用尺寸排阻或离子交换色谱进一步提高蛋白纯度并去除污染物。

对于表现出弱信号的蛋白质 体外 ATP酶活性，可向反应体系中添加刺激物以增强酶活性。许多能够刺激ATP酶活性的因素已被明确。例如心磷脂及其他膜脂类、分子伴侣（如Hsp90）的客户蛋白，以及其他参与维持ATP酶发挥功能所需特定构象或环境的蛋白质^13-15我们实验室首次通过纯化单体对 EpsE 进行了表征，其 ATP 酶活性较同源 ATP 酶较弱⁶. 我们随后发现，当EpsE与T2S系统中的跨膜蛋白EpsL的胞质结构域共纯化时，向反应.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HEPES 缓冲液	Fisher	BP310-500
氯化钠	Fisher	BP358-212
氯化镁	Fisher	BP214-500
三磷酸腺苷（ATP）	Fisher	BP41325
96 孔板（透明，平底）	VWR	82050-760
BIOMOL Green	Enzo Life Sciences	BML-AK111	推荐的磷酸盐检测试剂。注意：有刺激性。
酶标仪			BioTek Synergy 或同类设备
Prism 5	GraphPad Software