测量 体外 用于酶学表征的ATP酶活性

摘要

我们描述了一种用于定量的基本实验方案 体外 ATP酶活性。本方案可根据特定纯化ATP酶的活性水平和实验需求进行优化。

摘要

三磷酸腺苷水解酶（ATPases）在多种细胞功能中发挥关键作用。这些动态蛋白能够为机械功提供能量，例如蛋白质转运与降解、溶质运输以及细胞运动。本文所述方案是一种用于测定ATP酶活性的基本检测方法。 体外 用于功能表征的纯化ATP酶活性检测。蛋白质在反应中水解ATP并释放无机磷酸盐，随后通过比色法测定所释放磷酸盐的量。该实验方案具有高度可调性，可调整用于动力学或终点法测定ATP酶活性。本文提供了一个代表性实验方案，基于EpsE的活性与需求，EpsE是参与细菌II型分泌系统的AAA+ ATP酶 霍乱弧菌纯化蛋白的用量、测定活性所需的反应时间、取样间隔的时间点及次数、缓冲液和盐的组成、温度、辅因子、刺激物（如有） 等等。 可能与本文所述情况存在差异，因此可能需要进行一些优化。本方案为ATP酶的表征提供了基本框架，可快速实施，并可根据需要轻松调整。

引言

ATP酶是生命所有界别中多种生理过程的关键酶类。ATP酶作为分子马达，利用ATP水解产生的能量驱动多种反应，包括蛋白质的转运、去折叠和组装；复制与转录；细胞代谢；肌肉收缩；细胞运动以及离子泵送^1-3。部分ATP酶为跨膜蛋白，参与溶质跨膜运输；另一些则位于细胞质中，可能与质膜或细胞器膜等生物膜相关联。

AAA+ ATP酶（与多种细胞活动相关的ATP酶）是一大类具有部分序列和结构保守性的ATP酶。这些蛋白质含有保守的核苷酸结合基序，如Walker-A和Walker-B盒，并在其活性状态下形成寡聚体（通常为六聚体）。¹AAA+ 蛋白家族中不同成员在结合核苷酸后会发生显著的构象变化。EpsE 是一种 AAA+ ATP 酶，属于细菌 II/IV 型分泌系统的 NTP 酶亚家族^4-6EpsE 为 II 型分泌（T2S）提供动力 霍乱弧菌，霍乱的致病因子。T2S系统负责分泌多种蛋白质，例如毒力因子霍乱毒素，该毒素可引发严重的水样腹泻 V. cholerae 定植于人体小肠⁷.

定量技术 体外 ATP酶活性的测定方法多样，但通常使用比色法、荧光法或放射性标记底物来检测磷酸盐的释放^8-11. 我们描述了一种用于确定的基本方法 体外 使用基于市售含孔雀绿钼酸盐底物的比色法检测纯化蛋白的ATP酶活性，该方法通过测定释放的无机磷酸盐（Pi）含量来反映酶活性。在低pH条件下，孔雀绿钼酸盐与Pi形成复合物，其生成量可在650 nm处测定。该方法操作简便且灵敏度高，可用于新ATP酶的功能表征，评估潜在激活剂或抑制剂的作用，确定功能结构域或特定氨基酸残基的重要性，或分析特定处理对酶活性的影响。

方案

1. 使用纯化蛋白进行ATP水解反应

1. 准备孵育纯化蛋白所需的所有试剂储备液。
   1. 配制5倍浓度的HEPES/NaCl/甘油（HNG）缓冲液，包含100 mM HEPES（pH 8.5）、65 mM NaCl和5%甘油（或根据实验需要选择其他缓冲液）。
   2. 将100 mM MgCl₂（或其他金属离子，若ATP酶依赖金属离子）溶于水中。
   3. 使用高纯度ATP，将其溶于200 mM Tris碱液中，新鲜配制100 mM ATP溶液（不再调节pH）。分装后于-20 °C保存，保存时间不超过数周，因ATP会随时间降解，避免反复冻融ATP储备液。
   4. 在开始ATP水解反应前，立即将MgCl₂与ATP按1:1比例预混。
2. 准备并标记若干1.5 ml离心管，用于在反应过程中定期取样。准备在0、15、30、45和60分钟时间点收集样品的离心管。
   注意：也可仅在0分钟和反应终点取样。
   1. 向每管中加入245 µl 1倍浓度HNG缓冲液，以便将ATP水解反应中采集的样品稀释50倍。
3. 准备干冰与乙醇混合浴，用于快速冷冻样品以终止反应。在橡胶冰桶或其他安全（非塑料）容器中加入数块干冰，并小心倒入足量70–100%乙醇，直至完全覆盖干冰。
4. 根据需要（通常为5–10 µM），用1倍浓度HNG缓冲液稀释纯化蛋白，并置于冰上保存。
5. 设置ATP水解反应体系。
   1. 在每个样品对应的0.5 ml离心管中，依次加入以下试剂：H₂O（补至终体积30 µl）、6 µl 5倍浓度HNG缓冲液（或其他缓冲液）、3 µl 100 mM MgCl₂-ATP混合液，以及0.25–5 µM蛋白。
   2. 设置仅含缓冲液的阴性对照组，不添加蛋白。
6. 在反应开始时（0分钟）取出5 µl反应液，加入预先准备的含245 µl HNG缓冲液的1.5 ml离心管中，使样品稀释50倍，立即放入干冰/乙醇浴中速冻。
7. 将反应体系在37 °C孵育1小时，以进行ATP水解。在每个时间点（15、30、45和60分钟），从反应体系中取出5 µl等分试样，加入已标记并含有HNG缓冲液的样品管中（同步骤1.6）。
8. ATP水解反应结束后，将稀释后的样品转移至-80 °C超低温冰箱中保存。为确保所有样品完全冻结，至少等待10分钟后继续后续操作。

2. 将含有游离 Pi 的样品与检测试剂孵育

1. 在室温下解冻含有各时间点ATP水解反应等分试样的稀释样品（来自步骤1.6和1.7）。
2. 设置一个96孔板，其中包含样品和磷酸盐标准品。
   1. 在0.5 ml离心管中，通过将5.5 µl的800 µM磷酸盐标准品（随Pi检测试剂提供）加入104.5 µl HNG缓冲液中，将其稀释至40 µM。充分混匀后，取100 µl该40 µM Pi标准品加入96孔板的A1孔中。
   2. 向B1至H1孔各加入50 µl HNG缓冲液，用于Pi标准品的1:1系列稀释。
   3. 从A1孔中移取50 µl 40 µM Pi加入B1孔的50 µl检测缓冲液中，混匀；再从B1孔移取50 µl至C1孔，继续依次稀释至G1孔。混匀后从G1孔弃去50 µl，以确保每孔体积一致。H1孔仅含缓冲液，从而建立从40 µM到0 µM的Pi标准曲线。
      注意：如果样品中添加了其他因素（如抑制剂），应制备含有该因素的标准曲线，以校正在此条件下磷酸盐释放或吸光度的变化。
   4. 将每个样品取50 µl重复加样至孔板中。同一时间点的样品按列垂直排列（例如：样品1，时间0 = A2、A3；样品2，时间0 = B2、B3），不同时间点则按行水平排列。此布局每块板最多可容纳8个样品和5个时间点。
3. 使用无菌移液器吸取足量的孔雀绿/钼酸盐Pi检测试剂，按每孔100 µl加入含样品和标准品的各孔（所需试剂体积（ml）= 0.1 × 样品与标准品总数），并将试剂加入一个培养皿中，以便使用多通道移液器操作。切勿直接将检测试剂倾倒至培养皿中，以防发生Pi污染。
4. 使用多通道移液器向每孔加入100 µl Pi检测试剂，并通过上下吹打相同次数的方式小心混匀，避免产生气泡，建议按照从最后时间点到最初时间点的顺序进行操作。
5. 将板在室温下孵育25分钟，或根据试剂生产商的说明进行操作。

3. 使用微孔板读数仪定量结果

1. 使用吸光度酶标仪在 650 nm 处测定各样品的吸光度。
2. 绘制磷酸盐（Pi）标准曲线。利用绘图软件，将 Pi 标准样品的吸光度值对其浓度作图，以获得用于计算各样品中磷酸盐含量的方程。
3. 通过磷酸盐标准品校准，计算每个样品的 ATP 酶活性。释放的磷酸盐量 = (OD₆₅₀ - Y 轴截距) / 斜率。
   1. 取每个样品两个重复测定的总 Pi 值的平均值，从中减去仅含缓冲液对照组的吸光度值，再乘以稀释倍数（本例中为 50）。
   2. 计算每微摩尔蛋白释放的 Pi 纳摩尔数（nmol Pi/µmol 蛋白）。在动力学测定中，将各时间点的这些数值作图应得到线性拟合，相关系数至少达到 R = 0.99（图 1）；若未达到，可调整蛋白用量或孵育时间长短以优化实验。
4. 结果可表示为 nmol Pi/µmol 蛋白/分钟（图 2、图 3），或根据需要表示为 nmol Pi/µg 蛋白/分钟。

结果

通过将T2S ATP酶EpsE与EpsL的胞质结构域（EpsE-cytoEpsL）共纯化，并添加酸性磷脂心磷脂，可刺激EpsE的体外活性¹²。利用该检测方法，还可通过比较野生型（WT）与突变型蛋白的活性，确定特定EpsE残基在ATP水解中的作用。本文通过比较纯化的野生型EpsE-cytoEpsL与EpsE K417AK419A-cytoEpsL突变体的ATP酶活性，检测了EpsE锌结合结构域中两个赖氨酸残基替换的影响。图1显示，在1小时的动力学检测过程中，磷酸盐的释放呈线性增长，这是准确量化动力学ATP酶活性的前提条件。图2展示了与图1相同纯化蛋白样品的数据，每一样品重复检测三次，并以磷酸盐释放的平均速率进行定量分析。这些数据表明，K417和K419对EpsE的ATP酶活性具有重要作用。然而，对未刺激状态（无心磷脂）下ATP酶活性速率的比较（图3）显示，K417和K419并不影响EpsE的基础活性，...

讨论

这是一种用于测量的通用方案 体外 纯化蛋白的ATP酶活性测定用于生化表征。该方法易于优化，例如通过调整蛋白用量、缓冲液和盐的组成、反应温度，以及改变检测时长和时间间隔（包括增加总间隔数），可提高活性定量的准确性。市面上可购得的基于孔雀绿的试剂具有高灵敏度，可检测微量游离磷酸盐（在100 µl体系中约50 pmol）。由于该检测方法灵敏度高，必须使用一次性塑料器皿、超纯水以及不含磷酸盐污染的缓冲液和试剂。蛋白纯化后，建议采用尺寸排阻或离子交换色谱进一步提高蛋白纯度并去除污染物。

对于表现出弱信号的蛋白质 体外 ATP酶活性，可向反应体系中添加刺激物以增强酶活性。许多能够刺激ATP酶活性的因素已被明确。例如心磷脂及其他膜脂类、分子伴侣（如Hsp90）的客户蛋白，以及其他参与维持ATP酶发挥功能所需特定构象或环境的蛋白质^13-15我们实验室首次通过纯化单体对 EpsE 进行了表征，其 ATP 酶活性较同源 ATP 酶较弱⁶. 我们随后发现，当EpsE与T2S系统中的跨膜蛋白EpsL的胞质结构域共纯化时，向反应...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HEPES 缓冲液	Fisher	BP310-500
氯化钠	Fisher	BP358-212
氯化镁	Fisher	BP214-500
三磷酸腺苷（ATP）	Fisher	BP41325
96 孔板（透明，平底）	VWR	82050-760
BIOMOL Green	Enzo Life Sciences	BML-AK111	推荐的磷酸盐检测试剂。注意：有刺激性。
酶标仪			BioTek Synergy 或同类设备
Prism 5	GraphPad Software