我们介绍了利用显微注射和电穿孔技术在Ciona intestinalis（一种与脊椎动物互为姐妹群的脊索动物）中实现瞬时转基因和基因敲降的方法。这些方法有助于在此类结构简单的无脊椎动物中开展功能基因组学研究，该生物具有脊椎动物的一些基本特征，包括脊索和头部感觉上皮，并含有大量与人类疾病相关基因的直系同源物。
本文内容
摘要
摘要
简单的模式生物对于 体内 发育与细胞分化过程的研究。目前，传统的无脊椎动物模型系统与人类之间的进化距离，以及脊椎动物基因组的复杂性，为模拟人类正常及病理状态带来了关键挑战。脊索动物 Ciona intestinalis 是一种无脊椎动物脊索动物，起源于与脊椎动物的共同祖先，可能代表了无脊椎动物与脊椎动物之间的过渡特征。其共有的身体结构具有更为简单的细胞和基因组构成，有助于揭示基因调控网络（GRN）的关联性以及功能基因组学的响应机制，从而解释脊椎动物状态下的相关现象。该物种紧凑的基因组 海鞘，其具有固定的胚胎细胞谱系、细胞分裂次数少且细胞较大，结合多功能的社群工具，使得对该生物进行高效的基因功能分析成为可能。本文介绍了这种极具前景的模式生物的多种关键实验方法，该生物属于与脊椎动物亲缘关系最近的姊妹类群。我们提供了通过电穿孔实现瞬时转基因以及通过显微注射介导基因敲降的技术方案，二者结合可有效研究基因功能及基因组调控元件。我们还拓展了相关实验方案，介绍了如何利用社群数据库 计算机模拟 基因调控或基因功能实验的设计。一项示例研究展示了如何获得并量化在选定神经因子之间保守的相互作用的新信息 海鞘 以及人类。此外，我们展示了在胚胎细胞中通过DNA电穿孔后，亚细胞定位差异的示例。 海鞘 受精卵。最后，我们讨论了这些方案与新兴基因编辑技术相结合，用于组织特异性基因干扰的潜在应用前景。 体内 方法在 海鞘 克服经典模式生物在揭示脊索动物发育程序中保守机制方面的重大缺陷，这些机制与干细胞研究、药物发现及后续临床应用密切相关。
引言
近年来，多种模式生物的基因组序列和转录基因目录已陆续获得。然而，确定基因之间的功能关联，以及这些关联如何在DNA中被固化以在胚胎发育的时空过程中调控转录活性，仍然是一个重大挑战，尤其是在脊椎动物中。调控相互作用的复杂性与基因组的复杂性1,2尤其是在脊椎动物中，会降低在DNA水平上进行高效功能分析的效率 体内事实上，目前还没有基因调控网络（GRN）被从受精开始一直分析到发育生物体最终的终末分化状态。
海鞘 C. intestinalis 是一种可能实现此类完整基因调控网络（GRN）分析的模式生物。它具有无基因组重复的典型无脊椎动物基因组，基因冗余极少。相比之下，脊椎动物经历了两轮基因组复制，导致基因家族扩大和功能多样化，但也产生了旁系同源基因之间的冗余。C. intestinalis 紧凑的 cis-调控序列（GRN 的控制单元）以及细胞数量少且胚胎谱系恒定的特点，与 C. elegans 相似。此外，作为脊索动物门中脊椎动物的无脊椎近亲类群，它独特的系统发育位置使得能够在细胞分辨率水平上观察脊索动物体轴模式的发育过程3-6。
确保模式生物功能基因组学未来成功的关键问题在于为定量研究产生大量胚胎 体内 扰动。显微注射技术的发展在 海鞘 卵7，以及通过瞬时转基因技术快速获得大量转基因动物的可能性 体内 电穿孔在数百个 海鞘 受精卵8,9 已取得突破性进展 海鞘 功能基因组学。本文首先介绍一种较为费力的显微注射技术，该技术可用于靶向单个基因，目前仍是反义吗啉环寡核苷酸（morpholino, MO）介导基因敲降的首选方法，尤其适用于母源转录本的敲降。MO 寡核苷酸通常靶向 RNA 的起始密码子 ATG 或剪接位点，从而干扰蛋白质的翻译过程。随后，我们展示了如何在受精卵中通过电穿孔技术实现 海鞘 可对大量胚胎进行定量分析，从而为高效分析增强子开辟了途径 体内 以及组织特异性功能获得或功能缺失方法的应用，可实现同步操作与分析。我们进一步展示了如何 海鞘 社区工具被用于 计算机模拟 调控区域的预测以及将完整的开放阅读框（ORFs）高效克隆至表达载体中。最后，我们通过电穿孔过表达，展示了荧光标记或荧光标记蛋白的差异性亚细胞定位。
方案
1. Ciona 卵细胞和合子显微注射与电穿孔的准备工作
- 准备10 L含HEPES的人工海水（ASWH）用于胚胎培养。将420 mM NaCl、9 mM KCl、10 mM CaCl2·2H2O、24.5 mM MgCl2·6H2O、25.5 mM MgSO4·7H2O和2.15 mM NaHCO3溶于双蒸水（ddH2O）中，搅拌过夜。加入5 mM HEPES（pH 8.0），并验证或调节pH至8.0。将ASWH储存于4 °C。使用前升温至18 °C，并用滤纸过滤。
- 制备20倍浓缩的灭活去壳溶液：20%硫代乙醇酸钠，1%蛋白酶，溶于ASWH中。将500 µl分装后储存于-20 °C，使用前稀释至最终体积10 ml ASWH。
- 准备15至20个培养皿用于卵/胚胎培养。将融化的1%琼脂糖ASWH溶液倒入3.5、5、9或15 cm的培养皿中，形成1–2 mm厚的薄层。待琼脂糖凝固后，用ASWH覆盖培养皿。最多可在4 °C储存1–2周。使用前更换ASWH。
- 制备特殊注射用培养皿。
- 在5 cm培养皿中倒入5–7 mm厚的融化的1%琼脂糖，将模具（如粘在塑料盖玻片上的密封夹）放置于琼脂糖上，待其凝固后形成可容纳卵的凹槽。制备4至5个注射用培养皿，并用ASWH覆盖。储存于4 °C，使用前更换新鲜ASWH。仅使用新鲜制备的培养皿进行注射（最多不超过一天）。
- 制备β-半乳糖苷酶（LacZ）染色缓冲液：在含Tween的磷酸盐缓冲液（PBT）（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4、0.05% Tween）中加入1 mM MgCl2·6H2O、3 mM K4[Fe(CN)6]·3H2O和3 mM K3[Fe(CN)6]。避光保存于4 °C。将底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷（X-gal，10 U/ml）以40 mg/ml溶于二甲基甲酰胺（DMF）中，分装后储存于-20 °C备用。
- 将巴斯德吸管浸泡于自来水中过夜，以防止胚胎粘附。
- 制备注射针。
- 设置微量移液器拉制仪参数，例如加热温度425，拉力75，速度75，时间200（基于415的灯丝斜坡测试）。
- 拉制4至5根含灯丝的玻璃毛细管，以获得8至10根细长、尖端通常闭合的注射针。将针头储存在无尘的针头盒中，用双面胶带固定在抬高的支架上，以避免针尖断裂，并便于填充针头。
注：通过向数个卵中注射绿色活体染料（如第6节所述）测试所制针头，并根据6.6节所述调整拉针条件，以获得适合精细且重复注射的针尖形状。
- 制备注射溶液。准备4 µl注射溶液，例如，由1 µl 2 mM MO、2 µl 10 µg/µl绿色活体染料和1 µl ddH2O组成。根据实验需求，加入终浓度为0.05–0.5 µg/µl的加帽mRNA或20 ng/µl质粒DNA。充分混匀。若溶液含mRNA，则需置于冰上保存。
2. 配子的收集
- 在18 °C的冷却胚胎操作室中解剖Ciona成体。使用小型剪刀，从与出水（较短）虹吸管相对的一端开始，该侧下方有输卵管和输精管走行。
- 暴露输卵管，用剪刀尖在其上轻轻剪开一个小口。通过闭合的剪刀轻压输卵管，将流出的卵子直接挤入含有ASWH的6孔板中，以剥离卵子。用预先用ASWH冲洗过的巴斯德吸管转移残留的卵子。
- 将不同个体的卵子分别置于不同的孔中，并在解剖显微镜下观察卵子质量。
注意：发育良好的卵子呈圆形，颜色为粉红色至微黄色。卵子周围包被着非细胞结构的卵黄膜（即绒毛膜），形成界限清晰的卵周隙。绒毛膜内侧附有被膜细胞，外侧附有星状的滤泡细胞。质量较差的卵子常缺乏卵周隙或滤泡细胞，形态不够圆整，颗粒感更强，或颜色异常。未成熟的卵母细胞体积较小，呈银白色。 - 用剪刀剪断输精管，使用另一支巴斯德吸管将浓缩的精子收集至1.5 ml离心管中。将来自不同个体（至少两个）的精子汇集于同一管中。精子可在4 °C下保存数天。
3. 受精
- 按照步骤2所述，在18 °C下收集精子和卵子。
- 激活精子。
- 在1.5 ml离心管中加入1 ml人工海水（ASWH），并加入50 µl的1 M Tris（pH 9.5）混匀。然后加入20 µl浓缩精子，通过轻轻颠倒离心管进行温和混匀。
- 取一滴精子悬液置于小型培养皿盖或载玻片上，在解剖显微镜下观察精子激活情况。精子应呈剧烈游动状态。
- 向每孔卵子（每孔含100至1,000个卵子）中加入100–200 µl激活后的精子溶液，用移液器反复吹打混匀，使卵子悬浮于液体中。静置10分钟，期间勿移动胚胎。
4. 卵和胚胎的去卵膜处理
- 将20倍脱膜液的500 µl等分试样用ASWH稀释至10 ml。通过逐滴加入200 µl的2.5 M NaOH至10 ml的1倍脱膜液中以激活脱膜液。此时会形成乳白色沉淀。通过轻轻倒置试管进行温和混匀。
- 使用巴斯德吸管将卵子或合子（在步骤3.3等待10分钟后）收集至玻璃管中。将2至3只动物的卵子汇集于同一管中（约1,000–5,000个卵/管）。用手动离心机以高速（1,200 × g）离心约20秒，使胚胎沉淀至管底。缓慢停止离心，然后用巴斯德吸管吸除ASWH。
- 向每管已沉淀的卵子/合子中加入4 ml已激活的脱膜液。使用经自来水处理并连接小橡胶吸头的巴斯德吸管，通过轻柔吹打使卵子/合子重悬。溶液应在1–3分钟内变为淡黄色。
- 取少量脱膜过程中的卵/合子悬液，用巴斯德吸管转移至载玻片上，在解剖显微镜下观察脱膜进程。持续轻柔吹打卵/合子，并每隔20–30秒检查一次。
注意：首先卵泡细胞脱落，随后卵膜变黄且不透明，最终从合子上脱离。脱膜完成后的粉红色卵/合子会沉降至玻璃管底部。脱膜过程不应超过最长5分钟。 - 当50%的卵/合子完成脱膜后，向管中加满ASWH。
注意：以极低速度（约8 × g）非常轻柔地离心约10–15秒，仅足以使脱膜后的卵/胚胎沉淀即可。缓慢停止离心，避免扰动管底的卵/合子沉淀。 - 用巴斯德吸管几乎完全移除玻璃管中的液体，包括含有未完全脱膜卵/合子的漂浮物，并更换为ASWH。轻柔吹打洗涤，然后如步骤4.2再次进行轻柔离心。或者，也可让合子依靠重力自然沉降。重复洗涤一次，直至无任何卵膜碎片残留。
- 使用巴斯德吸管将卵/合子转移至新冲洗过的培养皿中。将合子（而非未受精卵）以低密度（约每10 cm培养皿200个胚胎）培养，以避免相互粘连。在13至20 °C温度范围内将胚胎培养至所需发育阶段。或者，可对合子进行电穿孔（步骤5）或对未受精卵进行显微注射（步骤6）。
5. 电穿孔
- 在18 °C下按照第3和第4节的方法对卵子进行受精，并去除合子的卵膜。每次电穿孔样品提供50至400个卵子。
- 在1.5 ml离心管中准备50 µl质粒DNA（最多100 µg质粒DNA溶于50 µl ddH2O），加入200 µl 0.95 M甘露醇。使用涡旋振荡器充分混匀。
- 将去卵膜的合子分装至硅化处理的1.5 ml离心管中，依靠重力沉降。吸除ASWH，保留管壁上标记为100 µl的液面位置。
- 对每管合子依次进行如下操作：使用巴斯德吸管加入DNA/甘露醇溶液。轻柔混匀合子，立即吸取DNA/甘露醇/合子悬浮液，并转移至4 mm电穿孔比色皿中。
- 立即将比色皿放入电穿孔仪的电击槽中，施加一次16毫秒、50 V的电脉冲。
- 使用同一根巴斯德吸管将合子从比色皿中取出，铺种于含有新鲜过滤ASWH的培养皿中。在18 °C条件下，于受精后约1小时（hpf）合子开始卵裂前完成吸管操作。
- 在不同样品之间，将吸管在盛有ASWH的烧杯中冲洗。
- 在15–20 °C下培养合子，培养密度应足够低（每10 cm培养皿约200个胚胎），以避免胚胎相互粘连。
6. 显微注射
- 准备去壳卵用于注射。
- 按照第4节所述方法，分别从2-4只动物中获取去壳卵。将未受精的去壳卵分别置于小型琼脂糖包被的培养皿中。在培养皿中多次清洗卵子以去除碎片。
- 对每只个体来源的去壳卵进行小批量试受精（约50个卵）。每个批次使用单独的5 cm培养皿，并加入2 µl活化精子（步骤3.2）。通过轻轻旋转培养皿充分混匀，并通过横向移动培养皿使卵子分散。将精子与卵子共孵育约10分钟，期间避免移动。
- 尽可能去除多余的精子：将已受精的卵转移至新的培养皿，或用新鲜人工海水（ASWH）冲洗两次。将正在分裂的胚胎保持静止状态，直至发育至32细胞期（在18 °C下约受精后3小时）。选择发育最佳批次的卵（受精率最高且卵裂模式最规则）用于显微注射。
- 准备注射针。
- 将4根注射针垂直放置进行后向填充，以便液体在重力作用下沿毛细管内纤维流动。在针尾（针尖朝下）加入0.5 µl含有绿色活性染料的注射溶液（步骤1.8）。等待液体自然流至针尖底部。
- 将注射针转为水平位置，使用细长的金属或塑料移液器头加入石蜡油。缓慢地将石蜡油覆盖在注射液上方，同时排出所有气泡，直至针管完全充满。
- 在18 °C的低温室内设置显微操作仪。
- 将持针器的塑料管连接至装有石蜡油的10 ml玻璃注射器。用油填充管道和持针器，并排出所有气泡。
- 将注射针插入持针器，并将持针器固定在显微操作仪上。
- 调整持针器沿与表面成45°角的直线方向移动。
- 将去壳卵沿注射培养皿中的琼脂糖凹槽排列，以便在解剖显微镜下逐个进行注射。
- 如有必要，可通过轻轻推动针尖接触琼脂糖或置于琼脂糖上的盖玻片边缘来折断针尖。轻微推动注射器旋钮以确认针尖通畅（绿色内容物应被推出）。
- 逐个注射未受精卵：首先将针插入卵内，轻微抽吸以破坏卵膜，随后进行注射。将绿色注射液注入卵的中央区域，注射体积最多不超过卵细胞直径的1/3（对于直径为140 µm的卵，相当于约30 pl）。
- 将注射后的未受精卵转移至新的培养皿中，在15–18 °C条件下孵育直至受精。
- 使用新鲜活化的精子对注射后的卵进行受精，方法同试受精（步骤6.1.2）。通过将合子转移至新的培养皿尽可能去除多余精子。将胚胎分散开，在卵裂阶段（直至32细胞期）避免扰动。
- 在13–20 °C温度范围内将胚胎培养至所需发育阶段。
- 通过旋转培养皿将胚胎聚集至中央，然后转移至硅化处理的1.5 ml离心管中。进行固定与染色，或直接封片（步骤7和8）。
- 将获得的表型与对照组注射胚胎进行比较。
注意：针对同一转录本注射第二种不重叠的吗啉代寡核苷酸（MO），应产生相同的表型。使用编码目标蛋白但不被MO识别的修饰mRNA来挽救特异性MO引起的表型。同时注射一种不产生表型的对照MO。
7. LacZ 染色
- 在硅化处理的 1.5 ml 离心管中收集处于所需发育阶段的胚胎，并在 1 ml ASWH 中加入 0.2% 戊二醛固定 15 至 30 分钟，最长不超过 30 分钟。
- 用 1 ml 1× PBT 洗涤 2 次，每次 10 分钟。
- 用 500 µl LacZ 染色缓冲液冲洗一次。更换为含有 X-Gal 底物的 1 ml 染色缓冲液（使用 40 mg/ml X-Gal 储存液，按 10 µl/ml 添加）。将胚胎转移至 12 孔板中，以便更好地观察染色情况。
- 避光孵育。根据驱动 LacZ 表达的启动子强度，孵育时间可在 0.5 小时至过夜之间调整，温度可选择 4 °C、室温或 37 °C。
- 用 1 ml 1× PBT 最多洗涤 4 次，以去除残留的染色缓冲液。
- 为便于染色胚胎的后续观察与成像，使用含 2% 多聚甲醛（PFA）的 1 ml 1× PBT 或含 0.2% 戊二醛的 1 ml 1× PBT 在室温下进行后固定，时间 10 分钟。
8. 荧光标记胚胎的封片
- 将所需发育阶段的胚胎置于1 ml ASWH中，用2% PFA固定20分钟。
- 用1 ml 1× PBT洗涤胚胎两次。操作过程中避免光照，保持胚胎处于避光条件下。
- 将最多50个胚胎转移至一张载玻片上。先用移液器尽可能吸除PBT，再用纸巾小心吸净残留液体。
- 加入20–25 µl封片介质。
- 将盖玻片以倾斜角度（先从一侧）放置，并用尖头物体（如针头、镊子或移液器吸头）缓慢放下，避免产生气泡，直至完全覆盖样品。用透明指甲油在盖玻片边缘点涂固定。
- 待指甲油干燥后，用指甲油将整个盖玻片边缘密封。于-20 °C避光保存。
结果
用于基因调控网络研究的显微注射
海鞘的胚胎 柄海鞘 非常适合在细胞谱系水平上以单细胞分辨率进行基因功能或基因调控研究。可在未受精卵或受精后的单个卵裂球中显微注射 mRNA、吗啉代寡核苷酸（MO）或标记物。第6步描述了利用显微注射技术进行MO介导的基因敲低。MO特异性靶向所选基因的mRNA，阻止其翻译为蛋白质。MO介导的发育相关基因功能丧失（LOF）会改变大量下游基因的表达，从而整体揭示胚胎基因调控网络（GRN）的部分特征10此类分析在 海鞘 提供了后生动物首个全胚胎的调控蓝图11. 图1 展示了一个利用显微注射技术研究保守基因表达上游调控机制的实例 Ci-髓鞘转录因子（Ci原肠胚阶段的 -MYT） 海鞘 胚胎。通过监测 原位 原位杂交（ISH），内源性表达（图1a，示意图如 图1a'在6行神经板前体细胞中观察到该现象，尤其是脑部（第III/IV行，红色）和脊髓（第I行，绿色）。此外， Ci通过显微注射MO（吗啉寡核苷酸）靶向分析MYT上游调控，所靶向因子为在神经前体细胞或其邻近区域表达的多个因子，分析时间点为神经前体细胞分化之前 Ci-MYT表达起始（图1b-g）。利用吗啉代寡核苷酸（MO）敲低早期胚胎因子，例如叉头框 A-a（FoxA-a）转录因子以及成纤维细胞生长因子 9/16/20（FGF9/16/20）图1b 或 1c分别）消除了总体 Ci-MYT 表达。其他转录因子仅部分影响 Ci-MYT 表达导致部分脑前体细胞中由吗啉寡核苷酸介导的下调（蓝色箭头所示） 图1d, f 和 g。相反， Ci-MYT 表达在 Nodal 下调时被异位激活图 1e，红色箭头），表明 Nodal 通常抑制 Ci- 这些侧向神经索前体细胞中的 MYT 表达。
高效基因功能与增强子研究的电穿孔技术
将质粒 DNA 电穿孔导入 海鞘 受精卵是进行瞬时转基因及后续表型变化观察的有效方法 体内与mRNA显微注射不同，电穿孔技术可实现组织特异性过表达，其中基因编码区（ORF，开放阅读框）在组织特异性启动子的调控下表达。这些启动子通常包括 顺式-已知基因的调控区（例如，用于脊索前体细胞中表达的brachyury增强子）8相反，电穿孔技术对于高效分析新的调控区域具有重要作用，其中报告基因（LacZ 或绿色荧光蛋白，GFP）可揭示这些区域的活性 体内. 这种新型调控区域的鉴定及其后续电穿孔介导分析的工作流程（对于 Ci-MYT) 如图所示 图2.
丰富的文库 海鞘 群落数据，在海鞘特异性基因组浏览器中可轻松获取12,13，例如海鞘原位表达与胚胎学数据网络（ANISEED）23, 进行检查以确认 in silico 调控区域的鉴定（图2A随后通过聚合酶链式反应（PCR）将这些区域克隆至表达载体中，可用于电穿孔介导的功能检测 体内 (图2B）。基因组浏览器的屏幕截图在 图 2A 显示 KH 转录本模型的上游区域 Ci-MYT（前三个外显子以橙色显示，并可见两个内含子）。不同基因组浏览器轨道标注了该区域预测的功能基因组数据，例如染色质免疫沉淀（ChIP）数据14 （此处以 ZicL 为例展示） Ci小脑锌指蛋白L的锌指结构域，两个相关序列间的序列保守性 海鞘 物种15,24 或核小体占位16,17 （从上到下依次为 图 2A）。通常，外显子编码区高度保守（比对轨迹在 图 2A）。在非编码区的上游区域以及第一内含子中也出现了额外的高保守性峰。根据基于序列的算法预测，其中两个区域可能为无核小体区。16,17 （红色框内） 图 2A）表明其可被转录因子接近。事实上，ChIP-on-chip 信号14 用于 Ci-ZicL 转录因子结合（绿色条形表示在 图 2A）在这两个保守区域中富集。此外，使用一个界面25 可搜索潜在转录因子结合位点的工具，我们在基因组序列中标记的区域中鉴定出位于其中的ZIC位点 Ci-ZicL ChIP 簇（橙色箭头及带下划线 ZIC-核心的序列， 图 2A）。结合 Ci-ZicL 转录因子在保守且可预测的核小体缺失调控区域中 Ci-MYT 与下调一致 Ci在针对 ZicL 的 MO 注射介导的基因敲低实验中观察到 MYT 表达图1d).
在确定潜在的 顺式-调控区域 计算机模拟 用于 Ci-MYT 表达，这些通过 PCR 从 海鞘 基因组DNA并通过重组克隆插入LacZ报告质粒19将构建体电转染至受精卵中 海鞘 卵（图2B）并通过LacZ染色分析其活性（图3).
图3 表明通过这种方法 in silico 通过该方法，能够识别出两个独立的 顺式-能够重现的调控序列 Ci-MYT mRNA 表达区域（比较） 图1a）。通常，通过质粒DNA电穿孔获得的瞬时转基因胚胎仅在整合了DNA的细胞中呈现嵌合表达。因此，嵌合的LacZ表达由 pmyt-R3 并且存在于所有同样表达这些前体的细胞中 Ci-MYT mRNA，即原肠胚和早期神经胚阶段的后部第一排以及前部第三/四排神经板前体细胞图3a，b，分别为紫色和红色箭头所示）。相比之下， pmyt-R5 仅在后部（第 I 行）神经板前体细胞中活跃，并从晚期神经胚阶段开始（图3c，红色箭头头）。这两个区域因此编码了两个独立的空间和时间特征 Ci-myt 基因调控。有趣的是，这两个调控区域还在原位杂交（ISH）中未观察到的其他前体细胞中产生染色，特别是在前部和外侧神经板以及肌肉中。图3a, b，分别用粉色、白色和黄色箭头标示）。这种更广泛的表达可能表明存在未被包含在分离的调控片段中的抑制性元件（例如 Nodal 抑制侧部神经命运的情况，参见 图1e）或因LacZ酶信号累积而检测到的低表达水平。
除了增强子研究外，电穿孔在 海鞘 也有助于功能分析 海鞘 通过过表达对编码基因进行分类。大量的 海鞘 全长ORF已向科研社区开放，并进一步注释了人类直系同源基因，包括与疾病相关的基因18. 该重组克隆兼容的全长 ORF cDNA 文库中的单个基因或基因群（图2B）可轻松转入含有适当启动子的目的载体中，以在胚胎中表达。所获得的表达克隆还可与 顺式-调控报告基因构建体以验证其在增强子激活中的假设作用。 图 2B 展示了转录因子全长ORF克隆的分离方法 Ci-ZicL 和 Ci-GATAa 及其重组到可能含有翻译标签的适应性目的载体中19 (例如 绿色荧光Venus或病毒血凝素（HA）标签）以及组织特异性驱动元件，例如Gata调节区的伴侣（Friend Of Gata regulatory region）pfog 用于早期泛外胚层表达的驱动因子15 本研究中使用。其对 Ci-ZicL 在外胚层和神经外胚层组织中的过表达通过共电穿孔进行分析 pmyt-R3>LacZ 和 pmyt-R5>LacZ 报告基因（图3b' （空） 和 c', c''，分别）。我们的电穿孔分析表明 Ci-ZicL 可能激活 Ci-MYT 表达通过 pmyt-R3 和 pmyt-R5 增强子区域，因为两种报告基因构建体均在外胚层区域显示出异位的LacZ表达（绿色箭头所示） 图3b', （空） 和 c', c''，如图所示 图3d电穿孔法将质粒DNA转入数百个 海鞘 卵的使用能够实现对表达变化的统计学相关量化，此处以异位表达为例进行说明 pmyt-R3>浓度依赖性泛外胚层LacZ表达 Ci-ZicL 表达。
电穿孔技术用于 体内 亚细胞定位
图4 描绘了通过电穿孔在动物极细胞中表达带有标签的转录因子时，利用改造后的表达载体（示意图如 图2B）。通过在转录因子（如 Ci-GATAa）带有Venus标签（图4b）或 HA 标签（图 4c）并在外胚层组织中过表达这些基因（pfog）我们可以观察到 体内，'Ci-GATAa 主要定位于细胞核，这符合转录因子的预期定位特征，而 Venus 的表达则普遍存在，包括细胞质。可通过类似的实验研究单个或多个转录因子在不同时间点的亚细胞定位动态变化，可能揭示其与不同标签蛋白的共定位情况。
图 1：通过显微注射评估 Ci-MYT 在 Ciona 卵中的调控作用。 Ci-MYT mRNA 在野生型（WT）和 Morpholino（MO）注射胚胎中的表达。(a) Ci-MYT 在神经板中的野生型表达模式。(a') 神经板（NP）中染色前体细胞的示意图。第 I/II 行：后部神经命运；第 III/IV 行：前部神经命运；第 V/VI 行：触手命运。(b-g) 注射不同 MO 后 Ci-MYT 的表达情况，这些 MO 用于敲低参与早期 Ciona 基因调控网络（GRN）的相关基因（图片改编自 Imai et al., 2006）11。Ci-MYT，Ci-髓鞘转录因子；WT，野生型；蓝色箭头：Ci-MYT 信号缺失；红色箭头：异位的 Ci-MYT 信号。比例尺 = 100 µm，适用于所有图像。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：工作流程 计算机模拟 增强子区域搜索与重组克隆结合电穿孔法实现瞬时转基因 海鞘 胚胎 (A) ANISEED 中的一个快照23 海鞘基因组浏览器识别上游调控序列 Ci-myt红色框标出两个潜在的 顺式-调控区， pmyt-R3 （scaffold_196:76883..77079）和 pmyt-R5 （scaffold_196:75856..76041）通过电穿孔法筛选用于分析。轨道名称：ZicL 探针：ChIP-on-Chip 数据14；KH2012 转录本： Ciona intestinalis 转录本模型；比对得分 Cs/Ci LastZ：序列保守性 Ciona savignyi (铯)/Ciona intestinalis (Ci)15,24; Segal 2006 预测核小体占位版本 1：经鸡源数据训练的计算算法，由 Segal 提出 等, 200616 应用于 Ci 如 Khoueiry 所述 等, 201017绿色条形： Ci-ZicL ChIP 峰14；橙色箭头：预测的ZIC结合位点；GCTG：ZIC核心结合序列。B) 过表达载体构建方案 海鞘 全长ORF cDNA文库，重组至含有组织特异性启动子的目的载体中，pfog）以及随后与报告基因构建体（如 pmyt-R3>LacZ 或 pmyt-R5>LacZ) 用于 体内 读数 Ci- MYT Ci-髓鞘转录因子; Ci-ZicL，Ci小脑L型转录因子的锌指结构域 pfog，调控区 CiGATA的伴侣蛋白。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图3：电穿孔处理 海鞘 胚胎显示 Ci-ZicL 可诱导的时空表达 顺式-调控 Ci-MYT 中肠期（mG）/晚肠期（lG）或早期神经胚（eN）阶段经LacZ染色的胚胎图像显示，这些胚胎共同电穿孔了以下物质 pmyt-R3>LacZ 或 pmyt-R5>LacZ 和对照质粒 (pfog>mCherry）或 pfog>ZicL。 pfog 驱动因子19 介导外胚层和神经外胚层中异位（全动物体）ZicL 表达，并导致这些细胞中出现异位 LacZ 染色。a) pmyt-R3 LacZ 活性在 mG/lG 期胚胎中（小箭头，左图）或相应颜色标注的示意图区域（蓝色圆圈，右图）；植物极视角（vg）。第 I/II 行：后部神经命运；第 III/IV 行：前部神经命运；第 V/VI 行：触手命运。b) pmyt-R3 在 a 中所示组织的 eN 阶段的活性。b'异位的 pmyt-R3 活性 upon Ci-ZicL 共电穿孔以绿色箭头标示。（无内容）) 与 b' 中相同的胚胎，动物极朝上（an）排列。c) pmyt-R5 eN 阶段的 LacZ 活性c'异位的 pmyt-R5 活性 upon Ci-ZicL 共电穿孔由绿色箭头指示。c'') 与 c' 中相同的胚胎，但动物极朝上（an）。d代表性实验的定量分析 Ci-ZicL 过度激活 pmyt-R3 在低浓度下。图中显示一个生物学重复。 Ci-MYT, Ci-髓鞘转录因子; Ci-ZicL，Ci小脑L型锌指转录因子； Ci-雾化 Ci-Friend of GATA；WT，野生型；mG，原肠胚中期；lG，原肠胚晚期；eN，神经胚早期；an，动物极视图；vg，植物极视图；nls LacZ，LacZ 的核定位信号。比例尺 = 100 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 4：电穿孔后蛋白质的差异性亚细胞定位。 利用pfog驱动子19在外胚层细胞中过表达的Venus标记或血凝素（HA）标记蛋白的定位情况。(a-c) DIC图像。(a', b') 对应的荧光图像。(c') 使用TRITC进行免疫组织化学标记后的对应荧光图像。比例尺 = 100 µm，适用于所有图像。DIC，微分干涉相差显微镜。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
产生转基因生物主要有两种技术 海鞘 胚胎：RNA或DNA的显微注射及DNA的电穿孔。这些基因扰动技术在 海鞘 胚胎最早在20世纪90年代被使用7,8 并从那时起不断改进，现已应用于 海鞘 （及其他海鞘属）20 全球。
实验方案中的关键步骤
将外源基因成功导入易于从成体动物中收集的Ciona配子，依赖于多个关键因素。配子的质量取决于产卵季节（通常在北 大西洋地区为5月至12月，随水温和溶氧量变化）、养殖水族箱中海水的质量（在适宜盐度下，成体可保持健康状态2至4周），以及从成体中取出配子后的正确处理方式，具体操作步骤如下文所述。
在准备步骤中，将巴斯德移液管与自来水孵育可防止胚胎粘连，而将琼脂糖包被的培养皿与海水预孵育可去除琼脂糖释放的有毒物质。通常，培养皿可在使用前最多提前两周制备，储存于 4 °C 以避免细菌生长，并在使用前新鲜冲洗。用于显微注射时，使用存放一天的小型培养皿效果最佳。
脱膜的效率和时长是本实验方案中的关键步骤，因为对卵/胚胎进行过长时间的处理会损害其发育。通过仔细配制（避免振荡）和正确储存（4 °C下最多保存一周），可保持脱膜液的质量。若在配制过程中剧烈混合，或长时间存放（尤其是在室温下放置数小时至数天），溶液中的蛋白酶活性会下降。我们通过使用新鲜的脱膜液优化了这一关键步骤，该脱膜液由冷冻保存的20x母液分装 aliquot 便捷配制而成。
正确处理去壳的脆弱卵/胚胎至关重要，移液过程中若对胚胎造成剪切或穿刺损伤将产生不利影响。移液时应尽可能使胚胎保持悬浮状态（通过轻轻“吹打”液体使其旋转悬浮，随后平稳而迅速地进行移液），同时将玻璃移液管保持垂直而非水平方向。在固定前后，进行洗涤、重悬以及将卵/胚胎转移进出离心管、比色皿或培养板等所有移液操作步骤中均需遵循此类操作规范。固定后，还应特别注意区分用于活体胚胎和固定后胚胎的移液工具，以避免固定剂残留带来的任何毒性影响。
由于 Ciona 卵/胚胎体积较小，且卵黄膜具有较强韧性，显微注射操作较为困难。该操作高度依赖于优化的注射针尖尺寸、精确的注射角度（针头沿卵细胞半径方向直线运动），以及通过精细手动控制在注射前抽吸时轻柔击破卵黄膜。后者只有在注射管路中完全排除气泡的情况下才可实现，而管路中用于平稳抽吸/注射压力的石蜡油必须无任何气泡。此外，微小的灰尘或卵碎片极易堵塞针头，因此在卵转移至注射培养皿前，通过洁净的操作环境和充分的清洗步骤可有效避免此类问题。注射完成后，将卵转移至新的培养皿中，可避免因未存活胚胎死亡所导致的毒性影响。
问题排查
实验过程中可能出现的问题可通过以下方案解决。受精率低可能源于精子激活不足、卵子洁净度低或受精体积过大。应使用新鲜混合且稀释度较低的精子，并在激活后检查精子运动情况。按照步骤4.2所述，在受精前用人工海水（ASWH）清洗卵子。减少受精皿/孔中的水量，并降低每皿/孔的卵子数量。为避免在制备过程中丢失胚胎，可在样品中加入一滴去膜液，以更有效地通过离心沉淀未去膜的卵子/胚胎。去膜时间应优化，因为部分去膜的卵子无法沉淀，而过度去膜则具有毒性，会导致胚胎破裂。
异步发育可能源于解剖过程中残留的精子。将不同个体的卵子批次分开，以避免不受控的交叉受精。发育异常可能由多种原因引起。在繁殖季节的初期和末期，在保持不同个体胚胎分离的情况下，可选择发育最佳的批次。受精后10分钟内避免扰动胚胎，以防干扰其卵质分离过程。转移胚胎时需确保其尚未开始分裂，因为移液操作会分离姐妹卵裂球，导致产生部分胚胎。对去壳卵使用较少的精子，以避免多精入卵。使用新鲜制备但已充分洗涤的琼脂糖培养皿。确保移液装置不含固定剂。保留未经去壳处理且未进行电穿孔的对照胚胎，以确定发育中断发生在哪一步骤。若出现污染或分解现象，应向胚胎培养液中添加抗生素。
如果注射装置发生“堵塞”，可通过排出部分染色内容物来确认注射针头开口是否通畅。可通过小心地将针尖在琼脂糖中拖动，以擦去堵塞物。应清除注射管路和/或针头中的气泡。由于针尖在注射过程中可能发生断裂或堵塞，建议更换针头以更好地控制注射体积。如果培养皿中已积累碎屑，应冲洗卵子并将其转移至洁净的注射皿中。在填充新针头前，应对注射溶液进行离心，以沉淀其中可能存在的微小颗粒或晶体。仅使用活性染料进行注射练习也十分有益。可通过比较注射与未注射卵子的受精情况来验证注射技术。最后，向经验丰富的同事咨询有助于改进注射技术。
为了排除脱靶效应的影响，可通过使用第二条非重叠的吗啉代（MO）以及用一条不会被MO识别的修饰mRNA进行挽救实验，从而可靠地排除Ciona中的非特异性表型效应。
显微注射：意义与局限性
显微注射 海鞘 用于生成脊索动物全胚胎基因调控网络（GRN）的首个蓝图11然而，尽管取得了如此显著的成就，显微注射在 海鞘 胚胎具有局限性，由于其相对较小的尺寸（直径为0.14 mm） 海鞘 卵。与其他脊索动物物种通过显微注射引入外源DNA/mRNA的方法相比， 海鞘 卵子相对难以操作，且显微注射的成功率 海鞘 每次实验获得的胚胎数量仍然较少（平均每次实验30至50个胚胎），限制了定量分析的开展。然而，对于干扰母源因子的研究而言 海鞘， 使用吗啉代寡核苷酸（MOs）进行显微注射是研究其在16至32细胞阶段合子发育起始过程中作用的首选方法15此外，尽管难度要大得多，但有可能对多达16至32细胞期的单个卵裂球进行显微注射。最后，对于除少数种类以外的其他尾索动物物种，显微注射仍然是产生转基因胚胎（通过mRNA或DNA注射）最有效的技术。 海鞘，目前尚无完全优化的电穿孔实验方案。
电穿孔：意义与局限性
为了克服显微注射数量少及其他限制，自2004年Zeller et al. 开发并发表优化和标准化的电穿孔质粒DNA方法以来9，大多数Ciona研究群体已采用该技术。实际上，仅用一个50 V、16毫秒的电脉冲，即可在单个电穿孔杯中同时对多达500个胚胎进行处理，一小时内可生成数千个转基因Ciona胚胎。这种大规模生成转基因胚胎的方法在脊索动物模式生物中仍属独特。这也使得Ciona迅速被公认为开展体内分析潜在cis-调控区域以及细胞/亚细胞定位的有力模型系统，本文即为此提供了例证。
尽管在Ciona受精卵中进行电穿孔技术从根本上革新了脊索动物基因调控网络（GRN）的研究领域，但该技术仍存在一些局限性。首先，质粒被短暂地导入Ciona胚胎中，极有可能以染色体外阵列的形式存在，导致电穿孔导入的质粒DNA的稳定性难以确定。此外，几乎无法控制每个受精卵所摄取的质粒拷贝数，从而导致表型出现波动。另一个使电穿孔结果难以解释的问题是所谓的嵌合现象。电穿孔导入的质粒DNA可能在单细胞期胚胎的不同位置被吸收，这决定了受精卵的哪些部分以及多少部分将获得质粒，并由其子代裂球继承。这种变异性显然增加了定量效应解释的难度。然而，通过使用足够数量的生物样本，并对LacZ（或GFP）阳性细胞进行计数和统计分析，大多数由电穿孔变异性引起的问题均可得到解决，而这些数据在单次实验批次中即可轻松获得。
电穿孔在基因工程中的多功能性与应用潜力
电穿孔最终可实现对潜在cis调控区域的中通量筛选，以及将这些区域克隆到报告基因或表达质粒后对基因功能进行定量分析。由于Ciona基因组结构紧凑，识别和克隆潜在调控区域相对简便3。在图2A中展示了利用大量公共数据资源的一种策略。报告基因和基因编码质粒的克隆还可借助专为Ciona优化的、与GATEWAY系统兼容的载体套装19以及相应的全长ORF文库18，从而进一步简化操作。这两类工具均已向科研社区开放，可实现调控元件与编码区之间高效、无需限制性内切酶的重组，如图2B所示。
近年来，电穿孔技术已成功被用于实现基于质粒的组织靶向基因操作，这些质粒可在组织特异性启动子的调控下表达基因编辑工具，例如CRISPR/Cas9组分21,22。此类方法将快速推动我们对基因调控网络（GRNs）动态变化以及潜在保守信号通路机制的理解，包括参与组织形成和逐步退出多能性的转录因子编码机制。此外，利用电穿孔技术实现组织特异性的基因功能缺失或获得（通过CRISPR/Cas9或过表达）将有助于研究与人类疾病相关基因的 Ciona 直系同源基因。事实上，Ciona 中人类疾病基因的直系同源基因目录及其全长ORF编码克隆已可方便地用于 Ciona18 的分析。由于脊椎动物基因组经历了全基因组复制，大多数人基因具有功能冗余的旁系同源基因，这使得基因功能分析变得复杂1。而 Ciona 作为一个结构更简单的系统，其幼虫具有典型的脊索动物组织排列，有助于揭示这些重要且常具功能保守性的基因的基本作用。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由奥地利因斯布鲁克大学和奥地利科学院（ÖAW）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 恒温实验室（约18 °C） | 用于胚胎操作 | ||
| Ciona intestinalis 成体 | UPMC - Station Biologique， 法国罗斯科夫 | 用于采集配子 | |
| NaCl | Roth | 3957.1 | 用于人工海水（ASWH） |
| KCl | Roth | 6781.1 | 用于人工海水（ASWH） |
| CaCl2x2H2O | Roth | A119.1 | 用于人工海水（ASWH） |
| MgCl2x6H2O | Roth | 2189.1 | 用于人工海水（ASWH） |
| MgS04x7H2O | Roth | P027.2 | 用于人工海水（ASWH） |
| NaHCO3 | Roth | 6885.1 | 用于人工海水（ASWH） |
| Hepes | Roth | HN78.3 | 用于人工海水（ASWH） |
| 硫代乙醇酸钠 | Sigma | MZ-6 | 用于去卵膜 |
| Pronase | Sigma | T0632-100G | 用于去卵膜 |
| D-甘露醇 | Sigma Aldrich | M9546-250G | 用于电穿孔 |
| 质粒DNA（浓度 >1µg/µl） | Macherey-Nagel | 740410.100 | 用于电穿孔或显微注射 |
| 琼脂糖 | 任意供应商 | 用于包被胚胎培养皿 | |
| 塑料培养皿 | VWR | 612-2079 | 用含1%琼脂糖的ASWH包被，并覆盖ASWH |
| 小剪刀 | 任意供应商 | 用于解剖配子 | |
| NaOH | Roth | 6771.1 | 用于激活去卵膜溶液 |
| Tris | Roth | 5429.3 | 1 M pH 9.5，用于精子激活 |
| 巴斯德吸管 | VWR | 612-1701 | 需浸泡于自来水中至少12小时 |
| 手动离心机 | Hettich Zentrifugen | 1011 | 使用玻璃离心管 |
| 1.5 ml Eppendorf管 | Sigma | T3406-250EA | |
| 2 ml Eppendorf管 | Sigma | T3531-200EA | |
| 方波电穿孔仪 | Bio Rad Gene Pulser Xcell | ||
| 4 mm电穿孔杯 | Eurogentec | CE-0004-50 | |
| 盖玻片 | Sto Premium | PR248212600 | |
| 载玻片 | VWR | ECN 613-1551 | |
| 戊二醛 | Sigma | G6257-10ML | 用于LacZ染色中的固定 |
| 多聚甲醛 | Sigma | P6148-500G | 用于荧光样品的固定 |
| Vectashield | Vector | H-1000 | 用于荧光样品的封片 |
| X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-ß-D-半乳糖吡喃苷） | Roth | 2315.2 | LacZ底物；储存液为40 mg/ml DMF（二甲基甲酰胺） |
| K4Fe(CN)6•3H2O | Merck | 4984 | 用于LacZ染色缓冲液 |
| K3Fe(CN)6 | Merck | 4973 | 用于LacZ染色缓冲液 |
| Na22HPO4 | Roth | 4984.2 | 用于PBT缓冲液 |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | 用于PBT缓冲液 |
| Tween | Sigma | SLBJ5103V | 用于PBT缓冲液 |
| 矿物油 | Sigma | M8410 | 经胚胎培养验证 |
| 绿色活性染料 | Fast Green Sigma | F7251 | 用于显微注射；浓度为10µg/µl |
| 微电极拉制仪（Flaming/Brown型） | Sutter Instruments | Model P-97 | 用于拉制注射针 |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 GC100TF-10 | Harvard Apparatus Ltd. UK | 30-0038 | 外径1.0 mm × 内径0.78 mm，含丝状结构，用于显微注射 |
| 显微操作器 | Narishige | MWS-2 | 三轴油压系统；用于注射过程中的三维精细移动 |
| 注射针夹持器 | Narishige | 1M-H1 | 用于固定注射针，整个系统充满矿物油 |
| 全玻璃注射器 | Walter Graf & Co GmbH & Co. KG | No. 95199.10427A4 | 10 ml FortunaOptima；充满矿物油，用于精细调节显微注射压力 |
| Morpholino寡核苷酸 | GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA | 注射浓度为0.25–0.5 mM | |
| 加帽mRNA | Ambion mMessage mMashine试剂盒 | 注射浓度为0.05–0.5µg/µl | |
| 质粒DNA | 注射浓度为20 ng/µl | ||
| 重组克隆试剂盒 | Gateway BP Clonase酶混合物 Invitrogen | 11789-013 | |
| 重组克隆试剂盒 | Gateway LR Clonase酶混合物 Invitrogen | 11791-019 | |
| 抗HA标签抗体 | abcam | ab9110 | 用于免疫荧光，使用比例为1:400（溶于3% BSA/PBT） |
| TRITC标记的山羊抗兔抗体 | Jackson | 111-025-144 | 用于免疫荧光，使用比例为1:300（溶于3% BSA/PBT） |
参考文献
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