本方案描述了去硫代生物素、链霉亲和素和APTES系统的可定制化表面功能化方法，以分离特定的目标细胞类型。此外，本文还涵盖了该方法的应用、优化及验证过程。
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摘要
摘要
阻碍个体化医学发展和应用的因素之一，是缺乏能够检测患者之间基因表达个体差异的诊断工具。目前试图通过细胞分离来填补这一空白的技术方法，往往会导致生理状态下表达模式的破坏，从而使分离技术无法作为有效的诊断工具。在本实验方案中，我们描述了一种用于细胞捕获与释放的功能化表面的构建及其优化过程。该功能化表面将生物素化抗体与经氨基硅烷（APTES）、脱硫生物素（desthiobiotin）和链霉亲和素修饰的玻璃表面相结合。通过引入生物素实现细胞的释放，从而可回收并纯化被该表面捕获的细胞。这种释放机制靶向作用于次级组分脱硫生物素，因而实现了更为温和的细胞释放模式。由于减少了剧烈试剂的使用以及剪切力的影响，细胞表达的变化得以显著降低。该功能化表面在单细胞混合物中可捕获高达80%的细胞，在双细胞混合物中亦实现了50%的捕获效率。本文还探讨了该技术在异种移植模型及癌症细胞分离研究中的应用。同时介绍了用于表面验证的定量分析方法，如酶标仪和ImageJ图像分析技术。
引言
目前的台式细胞分离方法（例如，荧光激活细胞分选1、激光捕获显微切割2、免疫磁珠分离1）通常需要数小时的准备和分选时间。如此长的时间尺度可能影响细胞的生理反应和表达水平，导致分析结果不能真实反映生理状态3。因此，亟需开发能够快速高效地分离特定细胞类型、同时不破坏细胞表面受体水平的系统，以提升细胞分离与富集效果，满足生物医学应用的需求。基于此，本方法的设计理念是建立一种温和的细胞分离技术。
这 "芯片实验室" 该概念有望将细胞分离速度提高数个数量级（从小时级缩短至分钟级），通常涉及将细胞捕获到表面，再通过物理方式释放细胞或其胞内成分4,5 或化学方法6尽管这些方法具有一些优势，例如能够鉴定蛋白质7,8 表达，鉴定RNA表达9-11，甚至为细胞提供 体外 培养12,13，许多此类技术由于所处的非生理环境，无法应用于细胞受体谱分析等诊断领域。此外，胶原酶等酶解消化试剂也可能影响这些受体的数量14,15，这意味着使用这些解离试剂的细胞受体定量技术将无法获得准确的生理学数据。细胞裂解会阻碍区分天然存在于细胞表面的受体与先前已被内化的受体16本方案描述了一种快速且温和的细胞分离方法。
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方案
1. 清洁玻璃表面并准备试剂
- 将玻璃表面放入氧气等离子体机中，在50%功率下处理5分钟以进行清洁。
- 在锥形管中加入50 µl APTES和2.45 ml乙醇，配制2.5 ml 2%的重悬(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）溶液。
2. APTES 和 DSB 功能化
- 将APTES溶液加入表面。对于8孔板，每孔加入150 µl；对于24孔板，每孔加入100 µl；对于60 × 15 mm玻璃培养皿，加入1.1 ml。覆盖表面以防止APTES溶液蒸发和分布不均。将表面置于摇床平台上，在室温下震荡50分钟，以形成均匀的APTES层。
注意：APTES是一种氨基硅烷，可形成表面的第一层。若使用其他类型的表面，请根据经验确定覆盖该表面所需的溶液体积。 - 在表面震荡的同时设定烘箱温度：8孔板和24孔板在55 °C下加热2小时；仅含玻璃的培养皿则在90 °C下加热1小时。
- 用乙醇冲洗表面。
- 根据所用表面类型，加入相应体积的乙醇。对于8孔板，每孔加入150 µl乙醇；对于24孔板，每孔加入125 µl乙醇；对于玻璃培养皿，加入1.1 ml乙醇。
- 通过从固定点（如孔的角落）反复排液和吸液的方式冲洗表面。将移液器保持约70°角，使枪头不直接对准表面。再用乙醇重复冲洗两次。
注意：若任何玻璃底孔板中....
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结果
通过本方案，我们展示了MCF7GFP细胞的捕获（图3A）和释放（图3C），以及活细胞对照结果（图4）。我们对细胞捕获效率进行了量化，结果显示捕获率为60%，其中80%的细胞被成功释放（图3C）。当我们将该方法应用于RAW 264.7巨噬细胞与MCF7GFP细胞的混合体系时，50%的RAW巨噬细胞被捕获（图3D），在使用20 mM生物素后，80%的RAW巨噬细胞被释放（图3B）。由于过量抗体可能降低细胞捕获效率，我们通过滴定0–10,000 nM的HLA抗体进行优化，发现最佳抗体浓度范围为100–1,000 mM（图1）。类似地，我们确定可有效捕获的细胞最佳浓度范围为1 × 105至1 × 106，因为当细胞数量低于该范围时，检测值低于背景水平17（图2
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讨论
细胞分离技术的进步推动了神经科学中结构与功能关系的科学研究18，再生生物学中的干细胞编程，以及血管生物学中的血管生成信号传导19确实，原代细胞培养20 (例如，血管内皮细胞（HUVECs）在血管生物学中的研究主要通过细胞分离技术实现。近期，细胞分离技术还被用于血浆膜受体的定量流式（qFlow）细胞术分析3,14,15,19,21然而，现有的细胞分离方法会影响细胞表面受体水平，且在人力和试剂方面成本较高。我们提出了一种改进的表面功能化方法17，可实现从多种细胞类型的混合物中可重复地轻柔捕获单一细胞类型，从而弥补上述不足。该技术可整合为一个迭代系统，通过使用特异性抗体分阶段捕获不同细胞类型。为进一步阐明该操作流程，以下提供若干常见问题及解决方案：
功能化优化：已对功能化过程进行优化，以提高MCF7gfp细胞捕获的均匀性和富集效率。本方案也可根据任何细胞类型和抗体组合进行优化和定制。这可通过调整捕获表面中基础组分的浓度，或改变抗.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢美国癌症协会伊利诺伊分会（282802）和美国国家科学基金会CBET（1512598）提供的资金支持。我们还要感谢伊利诺伊大学贝克曼研究所的Dianwen Zhang博士在显微镜技术培训方面的指导。最后，感谢Jared Weddell、Stacie Chen和Spencer Mamer提出的富有见地的讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷 (APTES) | Acros Organics | 919-30-2 | 用于配制 2% APTES 溶液 |
| Plasma Cleaner Pico | Diener | Model 1 | 用于清洁表面，并实现 PDMS 与玻璃之间的键合 |
| d-脱硫生物素 (DSB) | Sigma | D20655 | 作为细胞捕获表面的释放机制使用 |
| 二甲基亚砜 (DMSO) | British Drug Houses (BDH) | BDH1115-1LP | 用于将 DSB 溶解于溶液中 |
| 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺 (EDC) | Thermo-Scientific | 5g: 22980 25g: 22981 | 活化羧酸，使蛋白质能够结合到玻璃表面 |
| 未包被 8 孔培养板 | BD Falcon | 24 个/箱：354118 96 个/箱：354108 | 用于涉及 Zeiss 荧光显微镜的细胞实验，如初始捕获和释放定量实验 |
| 玻璃底 24 孔板 | MatTek | P24G-0-13-F | 用于涉及酶标仪的细胞实验，如抗体和细胞滴定实验 |
| 巯基乙醇 | Science Lab | 60-24-2 | 用于淬灭 EDC 与 DSB 之间的反应 |
| 4-吗啉乙磺酸一水合物 (MES 一水合物，99%) | Fisher Scientific | AC172590250 | 用于配制 0.1 M MES 缓冲液，供 EDC 反应使用 |
| Precision Oven | Thermo Scientific | 11-475-153 | 用于 PDMS 和 APTES 层的固化 |
| Titramax 1000 摇床 | Heidolph | 13-889-420 | 确保 APTES 在表面均匀分布 |
| 1× 链霉亲和素 5 mg [e7105-5mg] | Proteo Chem | 9013-20-1 | 生物素结合蛋白，可能引起刺激 |
| 5 cm 玻璃培养皿 | Fisher Scientific | 08748A | 用于 HUVEC 研究以及未来的分析研究 |
| 14 cm 带盖培养皿 | Sigma-Aldrich | Z717231 | 用于盛放正在功能化的样品并进行转移 |
| MCF7-GFP 细胞 | Cell Biolabs | AKR211 | 保存于液氮中 |
| RAW264.7 小鼠巨噬细胞 | ATCC | TIB-71 | 由伊利诺伊大学 Smith 实验室赠予，保存于液氮中 |
| TrypLE | Life Technologies | 12605036 | 以 100 ml 规格室温保存 |
| Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基 | 伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校化学科学学院细胞培养基中心 | 50003PC | 供应商：Corning |
| 非必需氨基酸 | 伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校化学科学学院细胞培养基中心 | 25-025-CI | 已由该中心加入 DMEM 中，供应商：Corning |
| 细胞刮刀 | Fisher Scientific | 12-565-58 | 小型 23 cm，50 个/包 |
| 细胞解离液 | Corning | MT-25-056CI | 用于非酶法解离细胞，以用于细胞实验 |
| 血细胞计数板 | Hausser | 02-671-54 | 用于细胞计数，以定量细胞悬液浓度及评估捕获与释放效率 |
| 生物素 | Amresco | 58-85-5 | 用于从表面释放细胞 |
| HBSS | 按配方配制 | N/A | 用于维持悬浮状态下的细胞活性，并清洗表面的非特异性结合。配方改编自 Cold Spring Harbor 实验方案：在 500 ml 水中加入 4 g NaCl、0.2 g KCl、0.0402 g Na2PO4•7H2O、0.03 g KH2PO4 和 0.5 g 葡萄糖。加去离子水至 500 ml，过滤后冷藏保存 |
| HLA-ABC 抗体 | BioLegend | 311402 | 用于捕获 MCF7gfp 细胞的抗体 |
| hIgG 抗体 | BioLegend | HP6017 | 用于捕获 MCF7gfp 细胞的抗体 |
| MCF7 GFP 细胞 | Cell Biolabs | AKR-211 | 经绿色荧光蛋白转染的管腔型乳腺癌细胞系 |
| 各种锥形离心管 | Thermo-Scientific | 15 mL：12-565-268 | 50 mL/15 mL 塑料锥形管，用于储存溶液和分装样品 |
| 小型管式旋转混合器（翻转混合器） | Fisher Scientific | 05-450-127 | 用于孵育抗体及混合其他细胞溶液 |
| Axiovert 200M（荧光显微镜） | Zeiss | N/A | Zeiss Axiovert 200 M 倒置荧光显微镜 |
| Zeba 脱盐柱 | Thermo-Scientific | PI-87770 | 用于在使用生物素化试剂盒后纯化新生物素化的抗体。操作说明见：http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf |
| EZ Link Sulfo NHS 小分子量生物素化试剂盒 | Thermo- Scientific | 用于对抗体进行生物素化，使其能够整合至捕获表面 | |
| 酶标仪 | BioTek | Synergy HTX 多功能酶标仪 | 用于在滴定实验中定量测定荧光强度 |
参考文献
- Erdbruegger, U., Haubitz, M., Woywodt, A. Circulating endothelial cells: a novel marker of endothelial damage. Clin. Chim. Acta. 373 (1-2), 17-26 (2006).
- De Spiegelaere, W., Cornillie, P., Van Poucke, M., Peelman, L., Burvenich, C., Van den Broeck, W.
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重印与许可
