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高通量基因标记在Trypanosoma brucei中的应用

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DOI：

10.3791/54342

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2016年8月12日

 ,  , 
1Sir William Dunn School of Pathology, University of Oxford

本文内容

摘要

为蛋白质添加标签是深入了解其功能的有力方法。本文中，我们描述了一种可同时对数百个Trypanosoma brucei蛋白质进行内源性标记的实验方案，从而实现基因组规模的标记。

摘要

质谱技术、测序技术和生物信息学的进步已产生了大量潜在的重要基因数据集。对这些蛋白质进行标记，可通过确定其在细胞内的定位并鉴定其相互作用伙伴，从而揭示其功能。我们近期发表了一种快速且可扩展的方法，用于构建在内源位点表达标记蛋白的Trypanosoma brucei细胞系。该方法基于我们构建的一种质粒，当其与长引物PCR联用时，可用于对基因进行修饰，使其编码的蛋白质在任一末端带有标签。该系统可实现数十个锥虫蛋白的并行标记，有助于大规模验证感兴趣的候选基因。该系统可用于蛋白质定位研究（使用荧光蛋白、表位标签或电镜标签）或生物化学研究（使用可用于纯化的标签，如TAP（串联亲和纯化）标签）。本文中，我们描述了一种在96孔板中进行长引物PCR和电穿孔操作的实验方案，随后在24孔板中完成转基因锥虫的恢复与筛选。通过该工作流程，可实现数百种蛋白质的并行标记，相比我们此前的方法提高了近一个数量级，现已具备全基因组规模进行蛋白标记的能力。

引言

Trypanosoma brucei 是一种引起人类非洲锥虫病和牛 nagana 病的原生动物寄生虫。T. brucei 由于具备高质量基因组、大量蛋白质组学和转录组学数据集以及成熟的分子工具，是研究蛋白质功能的理想生物体1-3。蛋白质组学和测序技术的进步产生了大量数据，揭示了许多潜在的重要基因4-6；然而，现有数据库中许多基因的相关信息仍十分有限。因此，亟需一种高通量方法以辅助蛋白质功能的表征。

表达带有标签的蛋白可为蛋白功能提供多方面的深入信息。例如，用荧光蛋白或表位标签标记的蛋白可通过荧光显微镜进行定位，从而获得该蛋白发挥生物学效应可能所处的位置信息。或者，用TAP 7、HaloTag 8 或 His标签标记的蛋白可用于生化分析，并纯化以鉴定其相互作用蛋白。

我们近期开发了一种高效的T. brucei  9标记方法。该方法采用长引物PCR扩增转染用DNA，可实现数十种蛋白质的并行标记，较现有方案有了显著改进。目前，我们已将该方法在虫媒体形式中的可扩展性提高了近一个数量级。本文中，我们介绍了在96孔板中进行PCR和转染操作，并在24孔板中完成细胞复苏与筛选的实验流程。由于现在可同时对数百种蛋白质进行标记，该方法为实现整个锥虫基因组蛋白质的标记提供了一种经济且可行的策略。

方案

1. 96孔长引物PCR

  1. 将96孔PCR冷却板预先置于-80 °C冰箱中冷冻。
  2. 在10 ml离心管中配制主混合液A：2,100 µl去离子水（ddH2O）、105 µl PCR级DMSO、105 µl 10 mM dNTPs、105 µl pPOT模板（25 ng/µl）9，总体积为每板2,415 µl。
  3. 用多通道移液器将23 µl主混合液A分装至96孔PCR板的每个孔中。
  4. 使用P20 12通道多通道移液器向每孔加入2 µl 100 µM的混合引物。用封板膜密封后，将PCR板放置于预冷的PCR冷却板上，并在-80 °C条件下冷冻至少20分钟。
  5. 在10 ml离心管中配制主混合液B：2,048 µl去离子水（ddH2O）、525 µl 10×缓冲液、52.5 µl聚合酶，总体积为每板2,626 µl。
  6. 从-80 °C冰箱中取出PCR板和PCR冷却板。
  7. 保持PCR板置于PCR冷却板上，迅速向每个含有已冻结主混合液A的孔中加入25 µl主混合液B，使总反应体积达到50 µl。此步骤需快速完成，以确保主混合液A在加样过程中不融化。加样完成后用封板膜密封PCR板。
  8. 设定PCR仪程序如下：94 °C预变性10分钟，随后进行30个循环（94 °C变性15秒、65 °C退火30秒、72 °C延伸2分钟），最后在72 °C延伸7分钟。
  9. 待PCR仪模块温度升至94 °C后，将PCR板放入仪器中开始扩增。

2. 96孔长引物PCR的验证

  1. 制备一块1% (w/v) 琼脂糖凝胶，使用Tris乙酸盐EDTA (TAE) 电泳缓冲液，并插入4个28孔梳子，形成4排加样孔。将多通道移液器的12个吸头与梳子的交替齿对齐。加样完成后，小心将凝胶完全浸入TAE电泳缓冲液中。
  2. 将1 kb DNA ladders 加样至1st 和 28th 每行的孔
  3. 使用 P20 12 通道多通道移液器，将 2 µl PCR 产物直接转移至凝胶的每个泳道中（图1A）。操作应迅速，以减少扩增子污染的可能性。
    1. 将PCR板A排的PCR产物加入凝胶第一行的奇数编号加样孔中（A1 - 3号孔，A2 - 5号孔，……，A11 - 23号孔，A12 - 25号孔），并将PCR板B排的PCR产物加入第一行的偶数编号加样孔中st 胶的泳道（B1 - 4号泳道，A2 - 6号泳道 …… B11 - 24号泳道，B12 - 26号泳道）。
    2. 将PCR板中C行和D行的PCR产物按照上述相同模式上样，C行加入奇数编号的泳道，D行加入偶数编号的泳道。持续按此上样模式，直至PCR板的每个孔均已被加载到凝胶上。本凝胶上样无需添加DNA上样缓冲液。
  4. 将凝胶放入电泳槽中，并加入TAE电泳缓冲液至完全浸没凝胶。在100 V条件下电泳30分钟，然后使用紫外透射仪观察结果。参见 图1B 以一个示例凝胶为例。
    注意：PCR产物可在转染前于-20 °C保存数周

3. 96孔转染

  1. 本实验使用 T. brucei 昆虫型细胞系 SMOXP910，并在含 10% 胎牛血清（FCS）的 SDM-79 培养基中培养10。
  2. 对蛋白 N 末端进行标记时，每次转染使用 1 × 107 个细胞（共需 1.1 × 109 个细胞）；对蛋白 C 末端进行标记时，每次转染使用 2 × 107 个细胞（共需 2.2 × 109 个细胞）。转染前数天内维持细胞处于对数中期（1.2 × 106–1 × 107 个细胞/mL），并在细胞密度为 5–8 × 106 个细胞/mL 时收获用于转染。
  3. 将用于转染的冷冻 PCR 产物在室温下解冻。
  4. 使用血细胞计数板或自动细胞计数器对细胞进行计数。
  5. 将所需数量的细胞分装至多个 50 mL 离心管中，在 800 × g 条件下离心 10 分钟，收集细胞沉淀。
  6. 离心后弃去上清液，每管细胞沉淀用 10 mL 改良细胞素混合液（0.8 mM EGTA、24 mM KCl、0.15 mM CaCl2、10 mM 磷酸钾缓冲液 pH 7.6、25 mM HEPES-KOH pH 7.6、2.6 mM MgCl2、0.5% (w/v) 葡萄糖、100 µg/mL BSA、1 mM 次黄嘌呤、144 mM 蔗糖）重悬。将所有细胞悬液转移至同一离心管中，再次在 800 × g 条件下离心 10 分钟。
  7. 离心后弃去上清液，用 23 mL 改良细胞素混合液重悬细胞，最终细胞浓度为 5 × 107 个细胞/mL。
  8. 在细胞离心过程中，向 4 块 24 孔组织培养板的每孔中加入 1 mL SDM-79 培养基。将培养板标记为 A–D，并用永久性记号笔在每块板的 A1 孔周围画一圈，以帮助确定板的方向。
  9. 将板架连接至电穿孔仪。在电穿孔仪上设置电压为 1,500 V，脉冲时长为 100 µsec，脉冲次数为 12，脉冲间隔为 500 msec。在板架上将脉冲计数设为 1，以确保电穿孔仪对每块电穿孔板的 12 列各施加一次脉冲。
  10. 使用 P200 12 通道多通道移液器，将 PCR 反应产物从 PCR 板转移至 96 孔一次性电穿孔板（4 mm 间隙）中。
  11. 当细胞完成离心并重悬至最终浓度 5 × 107 个细胞/mL（步骤 3.7）后，转移至试剂储液槽中。使用 P200 12 通道多通道移液器，向电穿孔板每孔加入 200 µL 细胞悬液，并通过移液操作与 PCR 产物充分混匀。
  12. 使用组织拭子清除电穿孔板顶部的液滴，以避免短路。
  13. 使用电穿孔板包装中提供的密封膜覆盖电穿孔板顶部，调整位置使每列顶部和底部的电极插孔保持暴露，避免覆盖用于引导密封膜的凸起点。
  14. 将电穿孔板装入板架并关闭盖子。按下电穿孔仪上的“Pulse”按钮。
  15. 电穿孔完成后，迅速将细胞从 96 孔电穿孔板转移至 4 块 24 孔组织培养板中。转移时使用 P200 12 通道多通道移液器，每隔一个吸头移除一个，使剩余的 6 个吸头与 24 孔板的 6 行对齐。按照预定义的模式将电穿孔后的细胞从 96 孔电穿孔板转移至 24 孔组织培养板（图 2A）。
  16. 准备 P200 移液器吸头——每块 96 孔板转染需准备两盒 96 个吸头，每盒中移除每隔一列的吸头。
    1. 将 96 孔电穿孔板中的 A1/A3/A5/A7/A9/A11 孔转移至 24 孔组织培养板 A 的 A 行，B1/B3/B5/B7/B9/B11 转移至 B 行，C1/C3/C5/C7/C9/C11 转移至 C 行，D1/D3/D5/D7/D9/D11 转移至 D 行。每完成一组 6 孔从 96 孔板到 24 孔板的转移后，用 24 孔板对应孔中的培养基清洗 96 孔板中的孔，并将清洗液重新转移回 24 孔板的对应孔中。
    2. 将 96 孔电穿孔板中的 E1/E3/E5/E7/E9/E11 孔转移至 24 孔组织培养板 B 的 A 行，F1/F3/F5/F7/F9/F11 转移至 B 行，G1/G3/G5/G7/G9/G11 转移至 C 行，H1/H3/H5/H7/H9/H11 转移至 D 行。每完成一组 6 孔从 96 孔板到 24 孔板的转移后，用 24 孔板对应孔中的培养基清洗 96 孔板中的孔，并将清洗液重新转移回 24 孔板的对应孔中。
    3. 将 96 孔电穿孔板中的 A2/A4/A6/A8/A10/A12 孔转移至 24 孔组织培养板 C 的 A 行，B2/B4/B6/B8/B10/B12 转移至 B 行，C2/C4/C6/C8/C10/C12 转移至 C 行，D2/D4/D6/D8/D10/D12 转移至 D 行。每完成一组 6 孔从 96 孔板到 24 孔板的转移后，用 24 孔板对应孔中的培养基清洗 96 孔板中的孔，并将清洗液重新转移回 24 孔板的对应孔中。
    4. 将 96 孔电穿孔板中的 E2/E4/E6/E8/E10/E12 孔转移至 24 孔组织培养板 D 的 A 行，F2/F4/F6/F8/F10/F12 转移至 B 行，G2/G4/G6/G8/G10/G12 转移至 C 行，H2/H4/H6/H8/H10/H12 转移至 D 行。每完成一组 6 孔从 96 孔板到 24 孔板的转移后，用 24 孔板对应孔中的培养基清洗 96 孔板中的孔，并将清洗液重新转移回 24 孔板的对应孔中。
  17. 使用倒置相差显微镜检查每列中的一个孔以观察细胞状态。此时可见活细胞与死细胞的混合物，并伴有大量细胞碎片。活细胞在相差显微镜下较明亮且具有运动性，可据此与死细胞区分。
  18. 将 24 孔板放入一个带盖且密封良好的洁净塑料盒中，置于 28 °C 培养箱内培养。
  19. 6–8 小时后，向每孔加入 1 mL 含 10% FCS 和 2 倍浓度选择性抗生素的 SDM-79 培养基。根据经验，基因在 N 末端标记的细胞系对较高浓度的选择性药物具有更强抗性。以杀稻瘟菌素（blasticidin）为例，N 末端标记需终浓度为 20 µg/mL，C 末端标记则需终浓度为 10 µg/mL。
    注意：转基因细胞系通常在转染后 9–10 天可见。
  20. 在进行分析前，需在新鲜药物和培养基中传代至少两次。图 2B 展示了对 96 种不同蛋白在 N 末端进行标记的典型 96 孔转染结果。通过相差显微镜评估每孔，判断其是否含有健康且具药物抗性的细胞。健康的孔中应主要（<95%）为高度活跃、在相差显微镜下明亮的细胞。后续需通过落射荧光显微镜或蛋白质印迹（Western blot）分析，以确认蛋白是否成功标记。

结果

在此代表性转染实验中，引物使用 TagIt perl 脚本 9 设计，并通过商业途径合成。按照所述方法进行 96 孔 PCR 扩增并验证（图 1A）；在此示例中，96 个 PCR 反应中有 95 个成功（图 1B）。根据我们的经验，对失败的反应使用原始引物或重新合成的引物进行重复，均无法获得成功的 PCR 扩增结果。

将扩增产物转移至96孔电穿孔板中进行电穿孔（图2A），随后转移至24孔培养板中进行恢复和筛选。在给予足够时间完成筛选后，对各孔的存活情况进行评分，再进行后续分析。本示例中，经过15天筛选后，96个孔中有88个孔（92%）呈阳性。

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图1：长引物PCR的验证。（A）将PCR产物从96孔PCR板转移至琼脂糖凝胶的示意图，用于PCR结果的验证。（B）一个典型的96孔PCR验证凝胶图，用于检测95个基因N端标签的扩增情况，其中1个扩增子不含5'端靶向同源序列，作为转染实验中的阴性对照。样品上样于1%（w/v）琼脂糖凝胶，在100 V条件下电泳30分钟。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：96孔电穿孔与筛选。（A）将电穿孔后的细胞从96孔电穿孔板转移至24孔组织培养板的模式图。（B）在24孔板中筛选15天后典型的活/死评分示意图。绿色表示转染成功，灰色表示仅有死细胞的孔。本示例中，96个孔中有88个孔（92%）含有成功转染的寄生虫。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

在过去的5到10年中，蛋白质组学和转录组学方法的灵敏度得到了显著提升，为数千个基因及其产物提供了宝贵的数据。然而，用于研究这些蛋白质功能的工具却未能同步发展。

标记蛋白质有助于开展多种实验以确定其功能。例如，可将蛋白质与多种不同颜色的荧光蛋白融合，以方便进行定位和共定位研究。用于电子显微镜的标签（如 APEX2 或 miniSOG） 11,12，可实现对标记蛋白的超微结构定位。用于生物化学研究的标签，如TAP标签和ProtC-TEV-ProtA（PTP）标签 7,13 用于纯化与该蛋白相关的复合物，以鉴定其结合伙伴 体外 生化检测

对本实验方案成功至关重要的具体步骤包括：在PCR主混合液1中加入DMSO、在添加主混合液2之前将PCR主混合液1进行冷冻、在主混合液2中使用商用聚合酶，以及对细胞电穿孔缓冲液（cytomix electroporation buffer）进行改良。根据我们的经验，为获得相似比例的阳性孔，C端标记转染所需的细胞数量必须是N端标记转染的两倍。因此，所有步骤均应按照所述方法进行。

该技术仅在转染昆虫媒介中的锥虫前循环型时可能成功。血液循环型的转染效率较低 14，此外，由于与选择性药物无关的密度依赖性毒性，它们在筛选过程中容易死亡。因此，我们此前的实验方案代表了目前对血液循环型锥虫进行标记的最佳技术 9。此外，转染效率可能因具体的锥虫分离株而异。本方案使用927 SMOX前循环型锥虫进行优化——其他菌株可能需要进一步优化。可能提高成功率的措施包括：增加PCR扩增产物的用量，以及增加转染时所用的细胞数量。

我们介绍一种可同时对数百种蛋白质进行标记的方法。该方法将有助于开展大规模的定位与相互作用研究，补充现有的大型数据集，为科研群体提供宝贵的信息。引物模板可应要求提供，质粒模板列表可从以下网址获取：http://www.sdeanresearch.com/

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

SD 得到了亨利·威尔科姆爵士奖学金 [092201/Z/10/Z] 的支持。本工作由凯斯·古尔教授获得的威康信托基金资助 [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z]。我们谨向凯斯·古尔教授致以感谢，感谢他提供的有益讨论和深刻见解。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
寡核苷酸Life technologiesna仅脱盐（不要使用额外纯化）
DMSORoche包含在 Expand HiFi 试剂盒中必须为 PCR 级
dNTP任何知名品牌
Expand HiFi 聚合酶Roche11759078001
BTX ECM830Harvard Apparatus电穿孔仪
HT-200 板式处理器Harvard ApparatusHT-200用于处理 96 孔电穿孔板
MOS 96 ELECTROPLATE 4 mmHarvard Apparatus45-0452用于 96 孔电穿孔的电穿孔板
杀稻瘟菌素 S 盐酸盐Melford3513-03-9
Hygromycin b GoldInvivogenant-hg-1
博来霉素MelfordP0187
225 cm² 组织培养瓶，斜颈，酚盖AppletonwoodsBC006
24 孔培养板AppletonwoodsBC017
Eppendorf® PCR 冷却器，用于 96 孔板和 PCR 管的无冰冷藏系统Sigma AldrichZ606634-1EA
带侧裙边的 96 孔 Multiply® PCR 板Sarstedt72.1979.203

参考文献

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PCR 96 TAP

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