通过整株植物热烫或提取物热处理比较烟草宿主细胞蛋白去除方法

摘要

本文介绍了三种热沉淀方法，可在进行任何其他纯化步骤之前，有效去除烟草提取物中超过90%的宿主细胞蛋白（HCPs）。植物HCPs在温度高于60 °C时会发生不可逆聚集。

摘要

植物不仅为人类提供食物、饲料和原材料，还被开发为一种经济的生物制药蛋白生产系统，例如抗体、疫苗候选物和酶。这些蛋白必须从植物生物量中纯化，但植物提取物中高浓度的宿主细胞蛋白（HCPs）会阻碍层析步骤的进行。然而，大多数HCPs在温度高于60 °C时会发生不可逆聚集，从而有利于目标蛋白的后续纯化。本文介绍了三种在完整叶片或提取物中实现烟草HCP热沉淀的方法。对完整叶片进行烫漂处理可轻松整合到现有工艺中，但可能对后续过滤步骤产生不利影响。而在搅拌容器中对叶片提取物进行热沉淀则相反，尽管需要对工艺设备设计（如匀浆器几何结构）进行较大改动，但可改善下游操作的性能。最后，换热器装置在传热条件方面具有良好的可表征性且易于放大，但清洗可能较为困难，并可能对过滤能力产生负面影响。通过实验设计方法可确定影响HCP去除和产物回收率的最关键工艺参数。这有助于将每种方法应用于其他表达平台，并为特定纯化策略选择最合适的方法。

引言

现代医疗系统日益依赖生物制药蛋白¹。与传统的表达系统相比，利用植物生产这些蛋白具有病原体负担低和可扩展性更强的优势^2-4。然而，植物源性药品的下游加工（DSP）可能面临挑战，因为破坏性的提取过程会产生大量颗粒，浊度超过5,000散射浊度单位（NTUs），且宿主细胞蛋白（HCP）浓度通常超过95% [m/m]^5,6。

去除分散的颗粒需要复杂的澄清步骤^7-9，但如果在早期步骤中能有效去除宿主细胞蛋白（HCP），则在初始产物回收阶段，亲和-洗脱模式下的色谱设备运行成本更低^10,11。这可以通过絮凝剂¹²或低pH值^13,14使目标蛋白沉淀来实现，也可以通过促使HCP聚集来完成。通过添加聚乙二醇可促进核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）的选择性聚集，该蛋白是烟草（Nicotiana tabacum）等绿色植物中最丰富的HCP¹⁵，但该方法成本较高，且不适用于大规模生产。热处理已被证明可使超过95%的烟草HCP变性并沉淀，而诸如Vax8等蛋白质疟疾候选疫苗在溶液中仍能保持稳定^16-18。

采用三种不同方法实现烟草HCPs的热诱导沉淀：（i）焯烫， 即， 将完整叶片浸入热液体中，(ii)....

方案

1. 培养烟草植株

1. 用 1 至 2 升去离子水冲洗每个岩棉块，随后用 1 升 0.1% [w/v] 营养液冲洗。在每个岩棉块中放入一粒烟草种子，并轻轻加入 0.25 升营养液冲洗，注意不要将种子冲走¹⁶。
2. 在温室中培养烟草植株 7 周，环境条件为 70% 相对湿度，16 小时光照周期（180 µmol sec⁻¹ m⁻²；λ = 400 - 700 nm），昼夜温度设定为 25/22 °C。
3. 收获所有叶片，仅保留位于茎基部的四片子叶。

2. 可选：通过焯烫进行热沉淀

注意：请按顺序执行步骤 2.1 至 2.12，以通过热烫法沉淀烟草宿主细胞蛋白（HCP）。如果将使用加热容器（第 4 节）或换热器（第 5 节）进行 HCP 沉淀，则跳过整个第 2 节。

1. 留出 50 g 植物材料，不进行焯烫直接进行提取（第 3 节）。在后续分析中（第 7 节）取此提取物样品作为内参对照。
2. 准备一个 8 L 工作体积的水浴装置，例如，50 × 40 × 40 cm，置于隔热的聚苯乙烯泡沫桶或类似容器中。将可调恒温器安装在水浴装置上，用于后续的温度控制（步骤 2.7）。
3. 将整个装....

结果

通过焯烫实现烟草宿主细胞蛋白的热沉淀
第2节所述的漂白程序已成功用于从烟草叶片中沉淀宿主细胞蛋白（HCPs） 70 °C，使总悬浮颗粒物减少96 ± 1%（n = 3），同时回收高达51%的Vax8目标蛋白，从而在色谱分离前将其纯度从0.1%提高至1.2% ¹⁶此外，还可回收83 ± 1%（n = 3）的荧光蛋白DsRed，使其纯度从3.3%提高至64.1%。漂白步骤可轻松整合到标准的提取与澄清流程中，该流程包括生物质洗涤、均质化、袋式过滤和深层过滤。图1) ⁷. 准备漂烫设备（图2加入澄清装置的设置时间约增加了5分钟，而该装置的常规设置时间为20分钟。此外，对完整叶片进行烫漂操作还需额外7分钟，加上常规的提取和澄清时间45分钟。然而，这额外的7分钟中仅有2分钟为实际操作时间。另外，短时间孵育（少于1分钟）也是可行的，可将烫漂时间从7分钟缩短至约3分钟。因此，烫漂不仅可提高粗植物提取物中目标产物的初始纯度，而且可在无需额外工艺设备的情况.......

讨论

上述三种热沉淀方法可在任何色谱纯化步骤之前有效去除烟草宿主细胞蛋白（HCPs） ^16,17它们补充了旨在提高初始产物纯度的其他策略， 例如， 吐水现象 ²⁹，根系分泌物 ³⁰ 或离心萃取 ^31,32，这些方法均仅限于分泌蛋白。然而，基于加热的方法只有在目标蛋白能够耐受约 60 °C 以上的最低沉淀温度持续超过 1 分钟时，才能有意义地使用。因此，这三种方法的第一步均为设计具有足够高熔解温度的目标分子，该策略已应用于多种疟疾疫苗候选蛋白，这些蛋白由来自不同区域的多个结构域组成 恶性疟原虫 抗原 ^16,18,21在已证实目标蛋白的热稳定性后，可根据现有设备与培养基、预期的最终工艺规模以及后续的下游加工（DSP）操作，选择三种方法之一。 ¹⁶.

烫漂是所有方法中速度最快的，且对附加设备的要求极低，因此可轻松整合到现有的实验室规模植物源重组蛋白纯化方案中。充分搅动烫漂液是一个重要的工艺参数，实证数据和理论计算均表明该参数会影.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2100P 便携式浊度计	Hach	4650000	浊度计
胺偶联试剂盒	GE Healthcare	BR100050	SPR 芯片偶联试剂盒
高压灭菌篮	Nalgene	6917-0230	叶片漂烫用篮子
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01	SPR 检测仪
Bio Cell Analyser BCA 003 R&D 带 3D ORM	Sequip	n.a.	粒径分析仪
搅拌机	Waring	800EG	搅拌机
BP-410	Furh	2632410001	袋式过滤器
Centrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	离心机
15 ml 离心管	Labomedic	2017106	反应管
50 ml 自立式离心管	Labomedic	1110504	反应管
CM5 芯片	GE Healthcare	BR100012	SPR 测量用芯片
比色皿 10 × 10 × 45	Sarsted	67.754	Zetasizer Nano ZS 用比色皿
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.	实验设计软件
磷酸氢二钠	Carl Roth GmbH	4984.3	培养基组分
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	肥料
Forma -86C 超低温冰箱	ThermoFisher	88400	冰箱
温室	n.a.	n.a.	用于植物培养
Grodan 岩棉块 10 × 10 cm	Grodan	102446	岩棉块
二十圈热交换器（4.8 m 长）	n.a.（定制设计）	n.a.	热交换器
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	培养基组分
K200P 60D	Pall	5302303	深层过滤层
KS50P 60D	Pall	B12486	深层过滤层
Lauda E300	Lauda Dr Wobser GmbH	Z90010	水浴恒温器
L/S 24	Masterflex	SN-06508-24	管路
mAb 5.2	American Type Culture Collection	HB-9148	Vax8 特异性抗体
Masterflex L/S	Masterflex	HV-77921-75	蠕动泵
Miracloth	Labomedic	475855-1R	滤布
MultiLine Multi 3410 IDS	WTW	WTW_2020	pH 计 / 电导率计
Osram 冷白光 36 W	Osram	4930440	光源
植物生长室	Ilka Zell	n.a.	用于植物培养
亚硫酸钠	Carl Roth GmbH	8554.1	培养基组分
氯化钠	Carl Roth GmbH	P029.2	培养基组分
不锈钢容器；0.7 kg 2.0 L；高 180 mm；直径 120 mm	n.a.（定制设计）	n.a.	热沉淀用容器
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	荧光与光谱酶标仪
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	滤器外壳
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	DLS 粒径分布测量
Zetasizer 软件 v7.11	Malvern	n.a.	用于操作 Zetasizer Nano ZS 设备的软件