本文介绍了一种用于检测多达100只醋蝇（Drosophila melanogaster）嗅觉反应的行为学实验装置及数据分析方法。该系统可应用于单一或多种嗅觉刺激，并可适用于对神经元亚群进行光遗传学激活或抑制。
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本文内容
摘要
摘要
神经生物学的一个关键挑战是理解神经回路如何发挥作用以引导动物产生适当的行为。 黑腹果蝇 因其复杂的行为、强大的遗传学技术手段以及紧凑的神经系统，是开展此类研究的极佳模式系统。实验室行为检测已长期应用于 黑腹果蝇 以模拟自然环境的特性，并研究相应行为背后的神经机制（例如 趋光性，趋化性，感觉学习与记忆1-3. 随着近期大量转基因品系的可获得性 果蝇 用于标记特定神经元亚群的品系，行为检测在将神经元与行为关联方面已发挥出重要作用4-11多功能且可重复的实验范式，以及用于数据分析的底层计算程序，对于快速测试具有不同基因型的果蝇品系至关重要。尤其有价值的是那些在测试动物数量、实验持续时间以及所呈现刺激的性质方面具有灵活性的实验装置。所选用的检测方法还应能产生可重复、易于获取和分析的数据。本文详细介绍了一种用于检测果蝇行为反应的系统及实验方案。 果蝇 在大型四区域实验 arena 中观察果蝇行为。该装置在此用于检测果蝇对单一嗅觉刺激的反应；然而，相同装置可经修改以测试多种嗅觉、视觉或光遗传学刺激，或其组合。嗅觉仪装置记录果蝇群体对气味刺激的活动，通过计算分析方法对果蝇行为进行量化。所收集的数据经分析后可快速获得单次实验的读数，这对于高效数据采集和优化实验条件至关重要。
引言
适应并响应外部环境的能力对所有动物的生存至关重要。动物需要躲避危险、寻找食物和配偶，并从以往经历中学习。感觉系统的作用是接收多种刺激，例如视觉、化学和机械感觉刺激，并将这些信号传递至中枢神经系统进行解释和解码。随后，大脑根据所感知的环境指挥适当的动作行为，例如觅食或逃避捕食者。理解感觉系统如何探测外部世界，以及大脑如何解码信息并做出决策，是神经生物学领域的主要挑战之一。
黑腹果蝇 是研究神经回路如何调控行为的有力模型系统。除了结构简单且维护成本低廉之外， 黑腹果蝇 表现出多种多样且复杂的刻板行为，却仅依靠约10万个神经元组成的紧凑神经系统。目前已存在强大的遗传学技术，可用于操控 黑腹果蝇 基因组，并已生成数千个转基因品系，这些品系能够选择性且可重复地标记相同的神经元亚群10-13这些转基因品系可用于选择性地调控标记神经元的活动（激活或抑制），并通过这些调控手段来研究神经功能如何引导行为。
已开发出多种行为学实验方法用于研究各种 果蝇 行为。 黑腹果蝇与许多动物一样，利用嗅觉来指导多种行为选择，例如寻找食物、寻找配偶以及躲避危险。因此，嗅觉是研究动物神经系统如何检测和解读外部刺激以引导适当行为选择的一个良好感觉系统。为此，已开发出多种用于研究幼虫和成体嗅觉行为的实验方法。传统上，嗅觉行为研究在 果蝇
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方案
1. 装置组装
- 根据提供的图纸（补充材料，SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf），使用聚四氟乙烯（PTFE）制造星形实验 arena（19.5 cm × 19.5 cm × 0.7 cm）。该 arena 可由商业机构或定制加工单位制造。
- 获取两块玻璃板（20.25 cm × 20.25 cm，厚度为 2 mm），使用金刚石涂层钻头在其中一块玻璃板的正中心精确钻一个直径约 0.7 cm 的孔。
- 为行为实验 arena 制作一个避光行为箱。同时根据提供的图纸（补充材料，SupplementalSketch_LightTightBox.pdf）为红外 CCD 视频摄像机制作一个避光相机箱。这些箱子可由商业机构或定制加工单位制造。
- 将空调单元安装在行为箱的后壁，将 LED 阵列安装在行为箱的侧壁。通过侧壁上的孔将温度探头置入行为箱内，以实现温度的实时反馈与调节（详见图 1和图 2）。
- 将红外滤光片和圆形偏振镜安装到摄像机上，并将组件固定至相机箱中。行为箱与相机箱之间由一块玻璃窗隔开，以更好地控制行为箱内的温度（详见图 1和图 2）。
- 将红外 CCD 摄像机连接至摄像机适配器，再将摄像机适配器连接至 USB 转换器，最后将 USB 转换器连接至....
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结果
四象限嗅觉仪实验可记录并分析大量果蝇在广阔行为空间中的行走活动。可将气味物质引入进入一个、两个、三个或全部四个象限的气流中。在无气味刺激时，果蝇会在四个象限之间自由移动。观察该行为至关重要，因为它表明实验中未引入非预期的偏差。这些偏差可能包括光照、温度波动、气流差异或气味污染物。图3B展示了25只雄性与25只雌性果蝇在四象限嗅觉仪中对干燥空气的行为反应。采集数据中的一条单个果蝇轨迹也在图3B中被突出显示，表明该果蝇探索了整个行为区域。在5分钟测试期间，所有分析轨迹的吸引指数（AI）接近于0，表明果蝇对气味象限无吸引倾向。同样，该实验的百分比指数（PI）为0.24，表明在5分钟测试期间，果蝇在四个象限中的分布较为均匀。
四区域对吸引性气味物质的行为反应如图所示 图3C将苹果醋引入气流中 将6.25%稀释的苹果醋溶液置于测.......
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讨论
本文所述的四区嗅觉仪是一种多功能行为学系统，可用于研究大量野生型和突变型Drosophila果蝇的嗅觉反应。每次实验约需1小时（包括准备、实验运行和清洁），每天通常可完成4至6次实验。一次典型的实验使用40至50只果蝇，持续5分钟，可产生约450,000个可追踪的数据点用于分析。所述配置经过轻微修改后，也可用于监测其他昆虫或昆虫幼虫在数分钟至数天时间内对嗅觉或其他感官刺激的运动行为。四象限实验对吸引性和排斥性刺激均具有敏感性。大多数气味物质产生的吸引指数（AI）介于-0.9至+0.9之间（公式1）。AI值在+0.5至+1范围内表示果蝇对刺激物表现出强烈的趋近行为，而AI值在-0.5至-1范围内则由强排斥物引发。一般而言，对照气味（干燥空气、湿润空气、矿物油）引起的中性反应应介于+0.1至-0.1之间。AI值通常在整个测试过程中发生变化，反映出果蝇进入气味羽流所需的时间、对新刺激的初始趋近行为及运动活性增强，以及最终对刺激产生的脱敏反应。实验前的对照运行至关重要，必须仔细执行，以确保在无目标刺激条件下果蝇在实验区域内分布均匀。
导致果蝇在实验区域内出现空间偏好最常见.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益。
致谢
感谢Terry Shelley制造果蝇实验 arena 和避光密闭装置，感谢Liz Marr在果蝇品系维护方面的帮助，感谢Xiaojing Gao和Junjie Luo在用于数据分析的Matlab代码方面的协助。感谢Monell化学感官中心的Johan Lundström演示其气味递送装置。本研究得到了Whitehall基金会（CJP）和美国国立卫生研究院耳聋与其他沟通障碍研究所（NIH NIDCD，项目号R01DC013070，CJP）资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 空气输送系统 | （所需数量） | ||
| 管路与连接件 | |||
| 热塑性NPT(F)歧管 | Cole-Parmer，IL，美国 | R-31522-31 | 1 |
| 六角减压接头 乳头接头（1/4英寸MNPT->1/8MNPT | McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国 | 5232T314 | 1 |
| 管路（内径：1/8） | McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国 | 5108K43 | 50 英尺 |
| 管路（内径：1/16） | McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国 | 52355K41 | 100 英尺 |
| 带倒刺的管路接头 | McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国 | 5117K71 | 1 包 |
| 快接式管路接头 | McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国 | 5779K102 | 4 |
| 带倒刺管接头（1/4MNPT->1/8BF | McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国 | 5463K439 | 1 包（10 个） |
| 带倒刺管接头（1/8MNPT->1/8BF | McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国 | 5463K438 | 2 包（10） |
| 带倒刺管接头（1/8MNPT->1/16BF | McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国 | 5463K4 | 2 包（10） |
| 带倒刺管接头（1/4MNPT->1/4BF | McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国 | 5670K84 | 1 |
| 六角头塞 | McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国 | 48335K152 | 1 |
| 空气压力调节器、空气过滤器和流量计 | （所需数量） | ||
| 实验室气体干燥装置 | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, 美国 | 型号：L68-NP-303；货号 #26840 | 1 |
| 150 mm 流管用多管架 | Cole-Parmer，IL，美国 | R03215-30 | 1 |
| 150 mm 流管用多管架 | Cole-Parmer，伊利诺伊州，美国 | R03215-76 | 1 |
| 150 mm 流管 | Cole-Parmer，IL，美国 | R-03217-15 | 9 |
| 阀体组件 | Cole-Parmer，伊利诺伊州，美国 | R-03218-72 | 9 |
| 精密空气调节器 | McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国 | 6162K13 | 1 |
| 电磁阀 | Automate Scientific，加利福尼亚州伯克利 | 02-10i | 4 |
| 电磁阀控制器 | ValveLink 8.2，Automate Scientific，Berkeley，CA | 01-18 | 1 |
| 电子流量计 | 霍尼韦尔 | AWM3100V | 1 |
| DAQ（NI USB-6009，National Instruments）和一个 | 国家仪器公司 | NI USB-6009 | 1 |
| 电源 | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| 气味室 | |||
| 聚丙烯广口瓶 2 oz；60 ml | Nalgene | 562118-0002 | 每次实验至少需要5个，但每种稀释浓度的每种气味剂都需要一个独立的容器。可于Container Store购买，货号#635114。 |
| 玻璃气味室，0.25 盎司 | 日晕瓶 | LB4B | 每次实验至少需要5个 |
| "在" 气味室阀门 | Smart Products, Inc.，加利福尼亚州，美国 | 214224PB-0011S000-4074 | 每个气味室使用其中1个部件，但该部件需要频繁更换 |
| "出" 气味室阀门 | Smart Products, Inc.，加利福尼亚州，美国 | 224214PB-0011S000-4074 | 每个气味室使用其中1个部件，但该部件需要频繁更换 |
| O型圈 | RT Dygert 国际公司，明尼苏达州，美国 | AS568-029 Buna-N O形圈 | 1 包（100 个） |
| 果蝇实验 arena、相机与行为记录箱 | （所需数量） | ||
| 行为观测与相机箱材料 | Interstate plastics，加利福尼亚州，美国 | ABS黑色挤出板（https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php） | 1803 平方英寸 |
| 用于果蝇实验 arena 和气味室插件的聚四氟乙烯，3/8" 厚，12" ×12" | McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国 | 8545K27 | 1 |
| 玻璃板，1/8" 厚，9" × 9" | McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国 | 8476K191 | 2 |
| 双作用热电控制器 | WAtronix 公司，加利福尼亚州，美国 | DA12V-K-0 | 1 |
| 红外LED阵列 | Advanced Illumination，美国佛蒙特州罗切斯特 | AL4554-88024, PS24-TL | 2 个 LED 阵列和 1 个电源 |
| 空调机组 | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| 成像系统 | （所需数量） | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH（12.5 mm F/1.4）C接口镜头 | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, 美国 | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N 互连电缆 | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, 美国 | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 相机适配器 | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, 美国 | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR 滤光片 | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, 美国 | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5 mm 圆形偏振镜 | 亚马逊 | 1 | |
| 红外摄像机 | 工业视觉源，佛罗里达州，美国 | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB视频转换器 | The Imagingsource，北卡罗来纳州，美国 | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2（果蝇追踪软件） | Julian Brown，美国加利福尼亚州斯坦福：julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture 2.2 软件 | The Imaging Source，北卡罗来纳州，美国（http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/） | ||
| 其他 | （所需数量） | ||
| Dremel 旋转工具 | Dremel，Racine，WI，USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| 用于玻璃切割的金刚石涂层钻头 | 可从多家供应商处获取；MSC工业供应公司，纽约州梅尔维尔 | 90606328 | 1 |
参考文献
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).
- Thorpe, W. H. Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects. Proc R Soc B. 127 (8....
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重印与许可
