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确定药理学干预在自身免疫性脱髓鞘中对免疫系统抑制与中枢神经系统保护的作用

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DOI：

10.3791/54348

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2016年9月12日

 ,  ,  ,  , 
1Physical Medicine and Rehabilitation, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Pathology, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham, 4Center for Glial Biology and Medicine, University of Alabama at Birmingham

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了如何确定实验性自身免疫性脑脊髓炎的药物治疗是通过抑制免疫细胞浸润而产生中枢神经系统保护作用，还是在免疫细胞浸润攻击过程中具有神经保护作用。

摘要

多发性硬化（MS）是一种自身免疫性脱髓鞘疾病，其主要特征是免疫细胞浸润进入脑和脊髓，导致髓鞘破坏。这不仅减缓了神经冲动的传导，还会引起轴突损伤，进而导致运动功能和认知能力下降。目前针对 MS 的治疗主要集中于减轻免疫细胞向中枢神经系统（CNS）的浸润。这些疗法可减少复发次数，改善患者生活质量，但无法完全消除复发，因此对长期残疾的改善有限。因此，亟需能够保护中枢神经系统的治疗药物。在 MS 的动物模型及人类患者中，T 细胞进入 CNS 通常被认为是启动炎症反应的关键事件。为了评估某种药物是否具有 CNS 保护作用，必须排除其对周围免疫细胞浸润或增殖的潜在影响。本实验方案旨在阐明在药物干预后所观察到的 CNS 保护效应，究竟是源于减轻 CNS 浸润的免疫细胞所致，还是由于在炎症攻击过程中阻断了 CNS 细胞的死亡。能够在炎症攻击期间评估对 CNS 具有保护作用的 MS 治疗手段，对于推动治疗策略的发展至关重要，因为现有疗法虽可减少复发，却无法彻底根除复发。即，免疫细胞浸润），导致中枢神经系统易受退行性病变影响。

引言

多发性硬化症（MS）在疾病早期主要表现为脑部白质区域的炎性病灶。随着长期进展，通过磁共振成像（MRI）可检测到灰质萎缩，标志着疾病进入神经退行性阶段。白质中的反应性胶质增生、脱髓鞘及轴突损伤主要归因于中枢神经系统（CNS）浸润的免疫细胞。目前用于治疗MS的所有疗法均无法逆转或直接阻止CNS内的神经退行性变，而是通过抑制T细胞活化和/或其向CNS的浸润来减轻炎症。由于尚无治愈MS的方法，且接受现有治疗的患者仍持续出现病情进展，因此发现能够预防脱髓鞘和神经元丢失的药物显得尤为关键。然而，在实验上区分药物对免疫细胞与对CNS的效应仍具有挑战性，因为其最终结果—— 即，无论其发生机制如何，对中枢神经系统的损伤均表现出相似的减轻效果。因此，评估中枢神经系统保护作用时，必须同时评估中枢神经系统内浸润的免疫细胞以及外周免疫细胞的增殖情况，以确定药物如何影响疾病的发生机制。

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种成熟的自身免疫性炎症疾病的动物模型，直接促成了目前用于治疗多发性硬化症（MS）的药物的发现1-4。小鼠常被用于EAE研究，其中C57BL/6小鼠因存在多种遗传变异品系而被广泛使用。经EAE诱导的C57BL/6小鼠通常在诱导后约第10天发病，并呈现慢性疾病进展。这些动物的组织病理学特征表现为脊髓实质和小脑的炎性细胞浸润，而皮质实质中则无明显浸润5。此外，大脑中的皮质病变和脱髓鞘是该疾病的重要特征6-9，但在C57BL/6小鼠中这些病变相对少见。因此，在条件允许的情况下，使用SJL小鼠可能更为合适，因其表现出复发-缓解型病程，且在脑和脊髓中均可见病变，这些病变与多发性硬化症中的病变相似10。

如果免疫细胞从未到达中枢神经系统（CNS），则不能将治疗归类为具有神经保护作用。因此，本方案采用流式细胞术分析实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠的脑组织、脊髓和脾脏，以确定治疗对免疫细胞向中枢神经系统浸润以及外周免疫细胞增殖的影响，方法如先前研究所示11。本文还描述了通过免疫组织化学分析中枢神经系统组织，以评估神经保护的程度和性质。结合这些方法，可判断免疫细胞是否在外周被激活并增殖、是否进入中枢神经系统，以及中枢神经系统是否受到炎症或损伤的保护。若怀疑治疗存在神经保护效应，即使其对免疫系统有影响，实验人员也可在免疫细胞浸润中枢神经系统后调整给药起始时间。

本文介绍了一种利用两种不同主动实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的研究方案。EAE是一种T细胞介导的多发性硬化症（MS）动物模型。通过在疾病发展过程中多个时间点结合流式细胞术分析与免疫组织化学检测，评估实验性治疗策略对MS发病机制不同环节的干预效果。该方法有助于研究人员区分药物对免疫细胞增殖与浸润的作用和对中枢神经系统（CNS）的保护作用，从而更清晰地阐明药物作用于疾病发病机制的具体途径。

方案

涉及小鼠的实验操作必须遵守相关的机构和政府法规。本研究中，小鼠的饲养和处理均遵循美国国立卫生研究院以及阿拉巴马大学伯明翰分校机构动物护理与使用委员会的指导原则。

1. EAE 诱导与评分

  1. 按照先前所述方法11-13在C57BL/6小鼠或10,11SJL小鼠中诱导EAE13。
    注意：实验人员应根据研究问题选择最适合的模型（详见讨论部分）。
  2. 从诱导后第7天开始，按照先前所述方法11每天记录每只小鼠的评分。比较不同处理组随时间变化的平均每日评分。

2. 处理

  1. 在疾病发作前处理EAE小鼠，以确定治疗是否影响免疫细胞的浸润或增殖。
    1. 选择一种治疗方法、给药途径和治疗频率，同时考虑药物的血脑屏障通透性、半衰期和剂量。
      注意：EAE会增加血脑屏障的通透性，可能使某些在健康动物中无法进入中枢神经系统的药物得以进入。通过开展剂量-反应曲线实验并观察EAE临床评分，有助于选择合适的药物剂量。应平行进行溶剂对照组实验。或者，可使用条件性基因敲除小鼠，并以同窝出生的小鼠作为对照。
    2. 本实验使用SJL或C57BL/6小鼠。在EAE诱导后早期（第7天）、症状出现前，采用选定的给药方式对小鼠进行处理。
    3. 根据随时间变化的最高平均临床评分，在疾病高峰期（约第15天）处死并解剖小鼠，操作方法同步骤3.1及其子步骤。
    4. 对小鼠脊髓进行流式细胞术分析（如步骤3.2所述），以评估免疫细胞向中枢神经系统的浸润情况；对脾脏进行流式细胞术分析（如步骤3.3所述），以评估外周免疫细胞的增殖情况。另取小鼠进行免疫组织化学分析（如步骤4所述），以定量星形胶质细胞和小胶质细胞，并评估髓鞘的保存情况。
  2. 在疾病发作后处理EAE小鼠，以确定治疗是否能在免疫细胞浸润发生后对中枢神经系统提供保护作用。
    1. 重复步骤2.1.1。
    2. 本实验使用SJL小鼠，因为这些小鼠具有可测量的疾病缓解期。根据平均临床评分，在疾病首次达峰时（或如需要，在后续复发高峰时）对小鼠进行治疗。
    3. 在EAE诱导后的预定时间点处死小鼠。由于免疫细胞浸润已经发生，通过FACS分析检测浸润可能不再具有意义。然而，可取脊髓组织以定量反应性胶质化和髓鞘情况，从而判断在免疫细胞浸润存在的情况下是否实现了对中枢神经系统的保护。

3. 流式细胞术分析

  1. 解剖
    1. 为每只动物标记三个15 ml锥形管（分别用于脑、脊髓和脾脏），标注动物编号及所含组织类型。整个操作过程中，所有组织需分别存放于冰上。
    2. 为进行脾脏的FACS分析，在疾病高峰期（约EAE诱导后第15天）使用二氧化碳处死小鼠，流速约为容器体积的15%每分钟，持续2–3分钟。通过呼吸停止确认动物死亡。每只小鼠处死后，取出脾脏14，放入已标记的15 ml锥形管（来自步骤3.1.1）中，管内预先加入含2% FCS、100 IU青霉素和100 μg/ml链霉素的冰冻RPMI培养基（在本方案中简称"media"）。
    3. 为进行脑和脊髓的FACS分析，用手术剪剪开小鼠右心房以释放循环血液，并用连接注射器的针头穿刺左心室，注射10 ml冰冻PBS。缓慢注入10 ml PBS。
    4. 剪下小鼠头部，用手术剪沿头皮正中线剪开。用手或镊子将皮肤向后剥离，再用手术剪从脊髓入口处开始沿颅骨正中线剪开。
    5. 用显微镊剥离颅骨，用铲子取出脑组织。将脑组织放入已标记的15 ml锥形管（来自步骤3.1.1）中，管内含media。
    6. 用镊子和手术剪去除小鼠皮肤，并用手术剪进行去内脏操作。用手术剪剪除四肢、尾巴、肋骨及周围肌肉，以暴露脊柱。
    7. 用手术剪将脊柱切成约5段大致相等的部分。用止血钳夹住其中一段的一端，再用另一把止血钳沿该段持续挤压，直至脊髓从顶端挤出。对每一段脊柱重复此操作，并将挤出的脊髓放入已标记的15 ml锥形管（来自步骤3.1.1）中，管内含media。
  2. 脑和脊髓中免疫细胞浸润的评估
    1. 用无菌剪刀将脑和脊髓组织剪成小块。用3 ml注射器的推杆在70 μm细胞筛上压碎组织，同时用media冲洗筛网，使细胞悬液流入新的50 ml离心管中。每管补加media至50 ml体积。在453 × g下离心5分钟以沉淀细胞。
    2. 吸除上清液，将沉淀重悬于4 ml 40%密度梯度培养基中。小心地将含细胞的40%密度梯度液覆盖于另一新15 ml锥形管中的2 ml 70%密度梯度液上方——用移液器极缓慢地沿管壁加入，以确保梯度分层清晰。在室温下以796 × g离心20分钟，不启用刹车。
    3. 用1 ml移液器小心吸除上层髓鞘层，再用1 ml移液器吸取界面处的活细胞，转移至新的15 ml锥形管中。补加media至15 ml体积，并在448 × g下离心10分钟。
    4. 将沉淀重悬于200 μl media中，加入96孔圆底板的单个孔中（每只动物的每个样本分别放入独立孔中）。以410 × g离心5分钟。
    5. 轻弹去除上清液，将沉淀重悬于200 μl再刺激培养基中（RPMI培养基补充10% FCS、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、1 mM丙酮酸钠和55 μM β-巯基乙醇，并加入50 ng/ml佛波酯肉豆蔻酸酯乙酸盐（PMA）、750 ng/ml离子霉素及蛋白转运抑制剂布雷菲德菌素A）。将培养板置于37 oC培养箱中孵育4小时。
      注：PMA和离子霉素再刺激可激活所有T淋巴细胞——无论其抗原特异性如何，从而评估给定组织中各T细胞亚群的总数。然而，抗原特异性效应T细胞反应可通过多种方式评估，例如在布雷菲德菌素A存在下用MOG肽再刺激细胞15,16。
    6. 中枢神经系统CD4+ T细胞表型的评估
      1. 孵育结束后，将96孔圆底板（来自步骤3.2.5）在410 × g下离心5分钟，轻弹去除上清液。后续所有染色步骤均在此板中进行。
      2. 用含2% FCS的200 μl PBS洗涤细胞，在410 × g下离心5分钟。轻弹去除上清液，加入含2% FCS和Fc阻断剂（克隆2.4G2）的200 μl PBS，冰上孵育10–15分钟。
      3. 开始细胞外染色：在410 × g下离心细胞5分钟，轻弹去除上清液，将沉淀重悬于50 μl表面染色混合液中，该混合液含荧光标记的抗CD4抗体（1:200，1 μg/ml）、抗TCRβ抗体（1:200，1 μg/ml）和活力染料（1:500），用PBS稀释，在冰上孵育15分钟。在410 × g下离心5分钟，轻弹去除上清液。用200 μl PBS洗涤细胞两次，每次在410 × g下离心5分钟。
      4. 去除细胞外染色液后，开始细胞内染色程序，包括固定/通透及细胞内染色。
        1. 首先，轻弹去除上清液，使用Foxp3转录因子染色试剂17（按制造商说明；见材料清单）在4 oC下固定/通透细胞30分钟至过夜。
        2. 用试剂盒提供的150 μl通透缓冲液洗涤细胞，将培养板在410 × g下离心5分钟。轻弹去除上清液，在50 μl通透缓冲液中加入荧光标记的抗IL-17A抗体（1:200，1 μg/ml）、抗IFN-γ抗体（1:200，1 μg/ml）和抗Foxp3抗体（1:200，2.5 μg/ml），用PBS稀释后在冰上染色30分钟。
        3. 在410 × g下离心5分钟，轻弹去除上清液。为去除多余抗体，用200 μl通透缓冲液洗涤三次，每次在410 × g下离心5分钟。轻弹去除上清液，重悬于200 μl PBS中。
        4. 通过流式细胞术分析细胞，参照先前方法11设门分析活CD4+ TCRβ+细胞，评估表达各分子的细胞百分比。使用血细胞计数板18或其他经验证的方法计数细胞，确定每只小鼠中具有各CD4+ T细胞表型的细胞数量。
        5. 根据所得数据，计算每只小鼠脑和脊髓中浸润的CD4+ T细胞的百分比和数量，重点关注在EAE发病机制和保护中起关键作用的以下细胞群19：IL-17A+ IFN-γ-、IL-17A+ IFN-γ+、IL-17A- IFN-γ+、Foxp3+。
  3. 外周T细胞增殖和活化的评估
    1. 用磨砂玻璃片在60 × 15 mm培养皿中压碎脾脏。将细胞悬液转移至15 ml锥形管中，用media悬浮细胞。补加media至15 ml体积，在448 × g下离心5分钟。
    2. 吸除上清液，将沉淀重悬于2 ml ACK裂解缓冲液中，室温下裂解红细胞约3分钟。
    3. 补加media至15 ml体积，通过70 μm细胞筛过滤至新管中。在448 × g下离心5分钟，吸除上清液，重悬于2 ml media中。
    4. 通过Ki-67染色评估外周CD4+ T细胞增殖
      1. 取来自步骤3.3.3的脾细胞等量小份（通常为200 μl），分别加入96孔圆底板的各个孔中（每样本一孔）。
      2. 在410 × g下离心5分钟，轻弹去除上清液。重悬于含2% FCS的200 μl PBS中，重复离心。轻弹去除上清液，用含2% FCS和Fc阻断剂（克隆2.4G2）的PBS重悬细胞，冰上孵育10–15分钟。细胞外染色步骤重复步骤3.2.6.3。
      3. 去除细胞外染色液后，开始细胞内染色程序，包括固定/通透及细胞内染色。
        1. 重复步骤3.2.6.4.1。
        2. 在410 × g下离心5分钟，轻弹去除上清液。用试剂盒提供的200 μl通透缓冲液洗涤一次，在410 × g下离心5分钟。轻弹去除上清液，在50 μl通透缓冲液中加入抗Ki-67抗体（1:200，1 μg/ml），染色30分钟。
        3. 在410 × g下离心5分钟，轻弹去除上清液。用试剂盒提供的200 μl通透缓冲液洗涤两次，每次在410 × g下离心5分钟。
        4. 轻弹去除上清液，用200 μl PBS洗涤一次，在410 × g下离心5分钟。通过流式细胞术分析细胞，参照先前方法11设门分析活CD4+ TCRβ+细胞，再评估Ki-67+细胞的百分比。
    5. 外周CD4+ T细胞表型的评估
      1. 将200 μl细胞（来自步骤3.3.3）加入96孔圆底板中（每样本一孔），在410 × g下离心5分钟，按步骤3.2.5进行再刺激。
      2. 将培养板置于37 oC培养箱中孵育4小时。按照步骤3.2.6及其子步骤进行相同的染色程序。按步骤3.2.6.4.4–3.2.6.5.5进行流式细胞术分析。

4. 免疫组织化学与定量分析

  1. 组织制备
    1. 在另一项独立实验中，于EAE诱导后的任意时间点（通常为约第30天，即C57Bl/6小鼠疾病的慢性期，或SJL小鼠平均临床评分峰值期）处死小鼠，这些小鼠不应来自步骤3及其子步骤所用的实验组。按照以下步骤操作，以评估反应性胶质增生和脱髓鞘的程度。
    2. 用2.5%异氟烷和97.5%氧气麻醉小鼠，并使用镊子轻捏脚趾以确认麻醉深度，观察是否无反应。按照3.1.3步骤所述进行心脏灌注。向左心室注入PBS后，更换新的注射器，注入10 ml含4%多聚甲醛的PBS溶液。 注意： 多聚甲醛对皮肤和肺部有刺激性，可能对眼睛造成严重损伤，并被怀疑具有致癌性。应避免吸入、食入以及与皮肤和眼睛接触。灌注操作应在通风橱中进行。
    3. 按照步骤 3.1.4 - 3.1.6 所述方法取出脑组织和脊柱。用细绳将脊柱绑在小木棒上，以确保脊髓保持平直。
    4. 将脑组织放入已标记动物编号的闪烁瓶中，加入约20 ml含4%多聚甲醛的PBS溶液；将脊髓组织放入已标记动物编号的50 ml锥形管中，加入约50 ml含4%多聚甲醛的PBS溶液，4℃过夜后固定。
    5. 为保护脑组织免受冷冻损伤，用1x PBS冲洗3次，并在4℃下保存 o在1×PBS中加入30%蔗糖，4°C孵育脑组织，直至其沉降至容器底部（约3天）。
    6. 用1×PBS冲洗脊柱3次以去除钙，然后将其置于大量（小鼠脊髓约50 ml）含0.5 M EDTA的1×PBS溶液中（起始pH约为10，用6 N HCl调节至pH约7.8），孵育2至3周，直至骨组织不再坚硬。随后按照步骤4.1.5进行脊柱的冷冻保护。
    7. 将脑组织和脊柱在容器底部沉降后立即按照以下子步骤包埋于OCT中。
      1. 将1份30%蔗糖的1x PBS溶液与2份OCT混合（例如，将15 ml 30%蔗糖的1x PBS溶液加入30 ml OCT中）。
      2. 将OCT/蔗糖混合物加入包埋模具中（脑组织使用22 x 22 x 20 mm模具，脊髓组织使用22 x 30 x 20 mm模具），加至约½满。
      3. 使用剃刀将脊柱切成6个大小相等的片段，放入22 × 30 × 20 mm包埋模中，朝前放置，用于冠状脊髓切片。将完整脑组织放入22 × 22 × 20 mm包埋模中，朝前放置。
      4. 加入OCT/蔗糖混合液以完全覆盖组织，静置1小时，使气泡充分逸出。在此期间，将2-甲基丁烷加入可容纳包埋模具的容器中，用于快速冷冻。将容器置于干冰上并加盖，进行预冷却。
      5. 将模具在干冰冷却的2-甲基丁烷中速冻，并于-80℃保存 o容器内以防止脱水。
    8. 准备就绪后，使用冷冻切片机将组织切成16 μm切片，并置于静电充电载玻片上。每隔10片th 每张载玻片分别放置脑组织和脊髓组织的切片（例如，第1张载玻片包含第1、11和21号切片，第2张载玻片包含第2、12和22号切片，依此类推）。将载玻片保存于-80℃。 oC 或立即用于染色。
  2. 反应性胶质增生与髓鞘染色
    1. 当准备染色时，为每只动物的每种染色方法分别选取一张脑组织切片和一张脊髓切片，切片位置应相同或尽可能相近。对于脑组织切片，应选择显示胼胝体和扣带束的切片。
    2. 将载有组织的玻片置于70℃热板上 o7分钟后关闭加热模块，让载玻片在加热模块上再冷却10至15分钟。这可以防止组织切片在染色过程中从载玻片上脱落。
    3. 用含0.1%非离子去污剂的1×PBS缓冲液（针对细胞内抗原）或1×PBS缓冲液（针对靶向细胞表面抗原的抗体）洗涤载玻片，每次5分钟，共洗涤3次。
      注意：由于本实验方案中使用的抗体为细胞内抗体，后续步骤将使用非离子型去污剂。此步骤之后，切勿让载玻片完全干燥。
    4. 将载玻片放入容器中，并用pH 3.0的柠檬酸盐缓冲液覆盖。配制柠檬酸盐缓冲液时，将0.192 g无水柠檬酸溶于水中，定容至100 ml。若pH高于3.0，用乙酸调节；若pH低于3.0，用NaOH调节。
    5. 37℃孵育载玻片 o在含0.1%非离子去垢剂的1x PBS中，30分钟内升温至C，随后在相同溶液中洗涤3次，每次5分钟。
    6. 用疏水屏障笔在组织周围画圈，将切片置于湿盒（例如，内含湿滤纸的切片盒）中。向组织上加入封闭缓冲液，室温孵育30分钟。
      注意：封闭缓冲液由1×PBS、0.3%非离子型去污剂以及根据二抗宿主选择的适当血清（5%）组成。 即，用于髓鞘碱性蛋白（MBP）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的马血清，以及用于Iba1的山羊血清。
    7. 甩去载玻片上的封闭液，加入用适当封闭缓冲液（见步骤4.2.6）稀释的一抗（1:1,000 或 0.2 µg/ml 山羊抗髓鞘碱性蛋白抗体用于少突胶质细胞，1:1,000 或 1 µg/ml 至 3 µg/ml 小鼠抗GFAP抗体用于星形胶质细胞，或 1:750 或 0.67 μg/ml 兔抗Iba1抗体用于小胶质细胞），覆盖画圈区域。4 °C孵育过夜。 o在湿润的孵育盒中于4°C过夜。
    8. 用封闭缓冲液去除载玻片上的Flick抗体，随后在含0.1%非离子去垢剂的1×PBS中清洗载玻片3次，每次5分钟。
    9. 加入用适当封闭缓冲液（见步骤4.2.6）稀释的二抗（MBP和GFAP使用1:200或7.5 µg/ml生物素标记的马抗小鼠抗体，Iba1使用生物素标记的山羊抗兔抗体）至圈定区域，将切片置于湿盒中，室温孵育1小时。
    10. 用封闭缓冲液去除载玻片上的Flick抗体，随后在含0.1%非离子去污剂的1×PBS中清洗载玻片3次，每次5分钟。
    11. 在使用前30分钟配制免疫过氧化物酶用的亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）（见材料列表），并在摇床上持续振荡，直至4.2.12步骤需要时。加入0.3% H2O2 在甲醇中处理标记区域10分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。
    12. 轻拍去除载玻片上的溶液，用1×PBS或含0.1%非离子型去污剂的1×PBS洗涤2次，每次5分钟，再用1×PBS洗涤1次。在圈出区域加入ABC试剂，孵育30分钟。
    13. 轻拍载玻片去除溶液，用1×PBS洗涤3次，每次5分钟，再用水洗涤2次，每次5分钟。配制3,3'-二氨基联苯胺（DAB）溶液（见材料列表），加入适量覆盖组织切片。
      注意：此步骤需要使用显微镜观察染色的最佳检测时间，且为便于载玻片之间的比较，所有样本必须处理相同的时间。
    14. 将载玻片在水中清洗3次，每次5分钟。依次置于下列溶液中各2分钟以脱水：70%乙醇水溶液、95%乙醇水溶液、100%乙醇水溶液、50%二甲苯与50%乙醇混合液、100%二甲苯。用树脂封固剂将盖玻片封固于载玻片上。
    15. 或者，按照先前所述方法进行免疫荧光染色 11 使用针对 Iba-1 和 GFAP 的抗体评估反应性胶质增生。
    16. 使用4倍、0.13 NA物镜拍摄每张脊髓切片（经相应抗体DAB染色）的图像，并将图像保存为.tiff格式。或者，使用20倍、0.50 NA物镜拍摄左侧或右侧大脑半球的胼胝体和扣带束图像，并将图像保存为.tiff格式。为了更全面地评估脑内病灶负荷，建议在分析中同时包含双侧半球。
  3. 测量反应性胶质增生的平均分数面积（Iba1 和 GFAP 染色）
    1. 下载 NIH ImageJ（http://imagej.nih.gov/ij/）并在计算机上打开。在 ImageJ 软件中，使用菜单命令 File > 打开并选择步骤 4.2.16 中的图像。使用以下方法绘制一个区域： "多边形选择" 工具栏中的工具。对于脊髓，勾画整个切片区域；对于脑组织，勾画胼胝体和扣带束。通过图像菜单将图像转换为16位 > 类型并点击 "16位"
    2. 通过执行“Process”来去除图像噪声 > 减去背景并设置 "滚动球半径" 至少达到不属于背景的最大物体的尺寸（参见 ImageJ 用户指南：http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146-29.html）。
      注意：对于Iba-1染色的4倍图像，我们使用4.0，对于GFAP染色使用50.0，但这些数值可能因图像放大倍数和染色强度而有所不同。
    3. 检查 "滑动抛物面" 并点击 "好的". 转到图像 > 调节 > 阈值……使用滑动条设置下限阈值（上方的滑块）。仅包含细胞水平的染色，并在所有图像间保持一致。对于具有深色背景的图像（仅适用于荧光染色），确保 "暗背景" 复选框被选中。
    4. 转到分析 > 设置测量值……并选择 "面积分数" （表示感兴趣区域内达到阈值的面积百分比）。确保 "限定至阈值" 是不受控制的且 "显示标签" 检查完毕。点击 "好的" 完成时。
    5. 为获得测量结果，请前往分析菜单 > 测量。A "结果" 弹出窗口将出现，此数据可直接保存或复制到其他程序中。进行分析时，进行比较 "面积分数" 处理组之间的数值差异。
  4. 通过光密度法对MBP染色进行定量分析
    1. 打开图像并按照步骤 4.3.1 中所述绘制感兴趣区域。转到 分析 > 设置测量值……并选择 "平均灰度值" （选定区域内灰度值总和除以像素数量）。确保 "限制为阈值" 是未受控制的且 "显示标签" 已检查。点击 "好的" 完成时。
    2. 为获得测量结果，请前往分析菜单 > 测量。观察一个 "结果" 弹出窗口出现。复制此数据并原样保存，或复制到其他程序中。
    3. 用于分析时，将数值复制粘贴到其他程序中。使用以下公式将平均灰度值转换为光学密度（OD）：OD = log10(255/平均灰度值)

结果

本研究采用两种实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型，以评估药物是否通过抑制T细胞向中枢神经系统的浸润，或在炎性免疫细胞浸润过程中防止髓鞘和轴突损伤，从而提供中枢神经系统（CNS）保护作用。为确定治疗药物是否能够阻止免疫细胞浸润脊髓，采用C57BL/6小鼠的慢性EAE模型，该模型中免疫细胞浸润和疾病病理主要发生在脊髓（图1A）。为评估治疗药物是否在免疫细胞侵入中枢神经系统期间提供CNS保护作用，采用SJL小鼠的复发-缓解型EAE模型，该模型在脑和脊髓中均表现出疾病病理变化（图1B）。

临床评估

根据典型（图1C）或非典型（图1D）EAE的以下评分标准进行相关临床评估。对于典型临床疾病，评分为0表示无异常行为。当从尾根部提起小鼠时，尾巴可能快速旋转（类似于直升机旋翼），后肢会分开。临床评分为1表示尾巴部分无力，可通过从尾根部提起小鼠来判断。正常的类似直升机的旋转动作可能减弱或消失，尾巴的一部分可能完全无力。判断尾部麻痹程度的一个有效方法是用手指沿尾巴长度方向滑动：未麻痹的尾巴通常会缠绕手指，而部分麻痹的尾巴则无法完成此动作。临床评分为2表示尾巴完全麻痹。从尾根部提起小鼠时，尾巴完全无活动。临床评分为3表示后肢部分麻痹。确定该评分时需让小鼠在平坦表面上自由活动。若小鼠向前移动时有一只后肢拖行，或一只或两只后肢表现出部分麻痹，则可给予评分为3。临床评分为4表示后肢完全麻痹。在此评分下，小鼠无法移动其后肢，仅能依靠前肢拖动身体前行。临床评分为5表示濒死小鼠，或在笼内移动或呼吸困难的小鼠。若小鼠无法在笼底自行拖行或呼吸费力，则应实施人道安乐死。临床评分为6表示在笼内发现已死亡的小鼠。评分为6的情况较为罕见，应调查除EAE以外的其他死因。

非典型临床症状可能伴有或不伴有瘫痪。如果小鼠同时表现出非典型症状和典型症状，可能需要采用两套独立的评分系统。评分为0表示无异常行为，与典型评分系统相同。临床评分为1表示小鼠在行走时出现轻微头部偏转或倾斜。可通过让小鼠向前行走并观察其运动是否持续偏向左侧或右侧来判断。临床评分为2表示头部偏转更为明显，并伴有翻身能力下降。与非典型评分为1的情况类似，小鼠在运动中存在方向性，且可能有轻微的平衡困难。临床评分为3表示无法沿直线行走。小鼠会出现平衡困难，在行走时可能依靠笼壁来维持身体直立。临床评分为4表示小鼠侧卧，因平衡障碍而无法行走。小鼠可能能够在笼底拖行自身，但其运动仍可能具有方向性。临床评分为5表示小鼠在无支撑情况下持续翻滚。达到此评分的小鼠应实施人道安乐死。临床评分为6表示小鼠被发现死于笼中。评分为6的情况较为罕见，应调查除实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）以外的其他死亡原因。

可能需要予以考虑 "介于两者之间" 评分， 例如，若小鼠状况发生轻微变化或在两个评分之间难以抉择时，可增加0.5分。例如，小鼠活动速度较正常同类稍慢但无瘫痪表现，或在尾部提起时前肢抓握后肢而非正常伸展后肢，可评分为0.5分。小鼠仅能在笼底拖行自身，且后肢仅能周期性抽动或在触碰时抽动，可评分为3.5分。

评估免疫细胞浸润的减少

在C57BL/6小鼠模型中诱导EAE后（图1A，第0天），抗原呈递及脾脏T细胞增殖发生在第1至5天，随后约在第7天出现免疫细胞向中枢神经系统（CNS）的浸润。在初始免疫细胞浸润发生后约3至5天，小鼠开始出现临床评分症状。为了评估某种治疗药物是否能够阻断免疫细胞向脊髓的浸润，可在抗原呈递和脾脏T细胞增殖之后、但免疫细胞尚未开始浸润脊髓之前的第7天给予药物或对照溶剂。若免疫细胞的浸润受到抑制，则疾病的上升期（第10至15天）临床病程应表现为临床评分的改善（图2）。

免疫细胞浸润减少也会导致神经炎症减弱。反应性星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化被认为是神经炎症的主要特征。通过GFAP标记星形胶质细胞、Iba-1标记小胶质细胞，随后检测平均面积分数染色的变化，可用于量化神经炎症（图3）。

为了确定免疫细胞浸润是否减少，在疾病高峰期（图1A，约第18天）取出脊髓并进行流式细胞术分析。这可确保有最大数量的免疫细胞已进入脊髓。T细胞进入中枢神经系统（CNS）被认为是启动炎症的关键事件，在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）动物模型及多发性硬化症（MS）患者中均能检测到Th1和Th17细胞。因此，流式细胞术分析应包括对这两类致病性T细胞的评估。此外，调节性T细胞（Tregs）是已被充分表征的抑制性T细胞，能够缓解疾病进展。因此，必须将Treg占总CD4+细胞群体的百分比与效应T细胞亚群的百分比进行比较。这将揭示T细胞浸润总体是否减少，或中枢神经系统内T细胞表型是否存在偏移。代表性点图（图4A）显示，与对照溶剂处理小鼠相比，药物处理小鼠脊髓中浸润的CD4+ T细胞总数减少（右上象限数值）。为评估Th1、Th17和Treg细胞，需分别检测其特征性标志蛋白：IFN-γ+、IL-17+和Foxp3+，这些应有所降低（图4A）。应对CD4+、IFN-γ+、IL-17+和Foxp3+细胞数量进行统计学分析，以证明其显著减少（图4B）。为排除T细胞亚群比例偏移的可能性，需对IFN-γ+ IL-17+、IFN-γ+ IL-17-、IL-17+ IFN-γ-以及Foxp3+细胞的比例进行统计学评估（图4C）。

为了排除中枢神经系统浸润性T细胞减少是由于外周免疫应答中T细胞增殖、活化和分化受到抑制所致，需要评估外周区活跃增殖的T细胞数量以及T细胞亚群的比例。如果T细胞的活化和分化未受影响，则CD4+、IFN-γ+、IL-17+或Foxp3+细胞的比例应无变化（图 5A）。此外，如果增殖过程未受影响，则Ki67+ CD4+细胞的比例也应无变化（图 5B）。药物处理通常在第7天或之后开始，以避免干扰初始抗原呈递及外周T细胞的活化。然而，在遗传学模型中，相关蛋白通常在胚胎发育阶段即被持续性敲除，或在EAE诱导前已被诱导缺失，因此对脾细胞的评估尤为重要。

评估中枢神经系统保护作用

为了验证某种特定治疗药物是否在免疫细胞浸润中枢神经系统（CNS）后调节疾病病理过程，应在临床评分首次达到高峰期间给予药物干预。SJL型实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型在这些实验中具有优势，因为该品系小鼠表现出复发-缓解的表型。如果某种药物治疗能够防止髓鞘-轴突变性，则可观察到临床评分的改善（图6）。对髓鞘的病理学评估必须证实髓鞘损伤减少，且与临床评分的改善相一致。为了定量评估髓鞘完整性，需对髓鞘碱性蛋白（MBP）进行DAB染色，随后对该染色结果进行光密度统计分析（图7）。为进一步验证治疗干预是否持续或减轻神经炎症，可按照前述方法测定反应性胶质增生的平均面积比例（图3）。为了证实该治疗干预直接保护中枢神经系统而无免疫调节作用，必须排除免疫细胞向中枢神经系统的浸润以及脾脏中免疫细胞增殖的减弱效应。为此，应按照前述方法进行脑和脊髓中免疫细胞浸润的评估，以及外周T细胞增殖与活化的检测（图4和图5）。综上所述，若某种治疗药物能够在不减少中枢神经系统浸润性T细胞或外周T细胞增殖的情况下阻断CNS细胞损伤，则该药物属于中枢神经系统保护性治疗。

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图 1. C57BL/6 和 SJL 小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）临床评分的代表性结果。 （A）使用 MOG35-55 诱导 C57BL/6 小鼠（n = 10）产生慢性型 EAE 的临床评分（均值 ± 标准误）。（B）使用 PLP139-151 诱导 SJL 小鼠（n = 3）产生复发-缓解型 EAE 的临床评分（均值 ± 标准误）。（C）用于追踪 EAE 小鼠典型疾病进展的临床评分标准。（D）用于追踪 EAE 小鼠非典型疾病进展的临床评分标准。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2. EAE 诱导的 C57BL/6 小鼠在免疫细胞浸润前的药物治疗 临床评分（平均值 ± 经PBS（n = 20）或SAS（n = 19）处理的MOG免疫后第7天C57BL/6小鼠的扫描电镜（SEM）结果35-55数据来自三次合并的独立实验。统计学差异采用非参数双尾Mann-Whitney U检验确定，*p < 0.05. 经许可重新印制自 (11)。

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图3. 对照组、EAE模型及经处理的C57BL/6小鼠脊髓中反应性胶质增生的免疫荧光染色与定量分析。（A）对照组（未免疫）小鼠（左图）、PBS处理的EAE小鼠（中图）以及SAS处理的EAE小鼠（右图）脊髓组织中GFAP（星形胶质细胞标记）和Iba-1（小胶质细胞标记）的荧光染色结果。比例尺 = 100 µm。通过面积分数法对染色面积进行定量，计算GFAP（B）和Iba-1（C）免疫阳性区域的百分比。数据以均值±标准误表示，n = 3 对照组，n = 3 SAS处理组，或 n = 4 PBS处理组，每只小鼠分析6个切片。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计学差异检验，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。经许可重印自（11）。请点击此处查看本图的放大版本。

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图4. 经治疗EAE C57BL/6小鼠脊髓的流式细胞分析显示T细胞浸润减少。 C57BL/6小鼠在EAE诱导后第7天开始接受SAS或PBS处理。于第15天获取脊髓组织。(A) 代表性点图显示CD4+细胞群中Th1细胞（IFN-γ+/IL-17-）和Th17细胞（IFN-γ-/IL-17+）（上排图）以及调节性T细胞（Foxp3+）（下排图）。点图中右上象限显示相应细胞百分比。(B) 对CD4+细胞以及IFN-γ+、IL-17A+和Foxp3+细胞的绝对数量进行统计分析。(C) 还分析了SAS处理与PBS处理EAE小鼠之间T细胞亚群百分比的变化。数据表示为均值±标准误，PBS处理组n = 10，SAS处理组n = 9，来自两次独立实验。所有柱状图均采用双尾t检验。**p < 0.01。经许可重印自(11)。 请点击此处查看此图的放大版本。

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图5. 实验性自身免疫性脑脊髓炎C57BL/6小鼠脾脏的流式细胞术分析，显示经治疗与未治疗小鼠中T细胞表达谱和增殖水平相当。 在诱导EAE后第15天分析PBS处理组和SAS处理组小鼠的脾脏。（A）来自两项独立实验的PBS处理组（n = 10）和SAS处理组（n = 9）小鼠脾脏中CD4+ T细胞、Th1细胞（IFN-γ+/IL-17-）、Th17细胞（IFN-γ-/IL-17+）以及调节性T细胞（Foxp3+）的比例。（B，左图）来自健康小鼠脾脏（n = 4）、PBS处理组（n = 5）和SAS处理组（n = 5）EAE诱导小鼠CD4+细胞群中Ki-67+细胞的比例。单因素方差分析（one-way ANOVA）显示，健康小鼠脾脏中Ki-67+细胞比例与PBS或SAS处理的EAE小鼠脾脏相比具有统计学显著性差异；而PBS处理组与SAS处理组EAE小鼠脾脏之间无显著差异。（B，右图）代表性散点图；数字表示增殖比例。散点图显示百分比数值。柱状图采用双尾t检验分析，***p < 0.001。经许可重印自（11）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6. SJL 小鼠 EAE 模型中免疫细胞浸润后的药物治疗 临床评分（均值 ± 经PBS（n = 8）或SAS（n = 8）处理的SJL小鼠在免疫后第24天（虚线）给予PLP后的扫描电镜（SEM）结果139-151数据为均值 ± 临床评分的扫描电镜分析。统计学差异采用非参数双尾Mann-Whitney U检验确定，***p < 0.001。顶行表示用于统计分析的数值。经（11）许可重印。

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图7. 使用光密度法对MBP染色进行定量分析。 （A）未指明基因敲除小鼠与同窝对照C57BL/6小鼠在诱导EAE后胸段脊髓中MBP的代表性染色结果。括号标注的区域显示MBP染色减弱，提示脱髓鞘。（B）未指明基因敲除C57BL/6小鼠胸段脊髓的MBP染色结果。（C）与诱导EAE的野生型（WT；n = 3只小鼠，每只动物2 - 4个腰段和胸段切片）小鼠相比，诱导EAE的未指明基因敲除小鼠（KO；n = 6只小鼠，每只动物2 - 4个腰段和胸段切片）脊髓中MBP染色的光密度（OD）更高。采用双尾t检验进行统计分析，*p < 0.05。误差线表示标准误（SEM）。比例尺：100 µm。

讨论

多发性硬化症（MS）患者在使用可减弱T细胞活化和/或其向中枢神经系统（CNS）浸润的药物期间，仍会经历疾病复发，因此有必要开发能够直接保护中枢神经系统的治疗方案。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）传统上被用于模拟MS的症状，在研究免疫系统与中枢神经系统之间相互作用的本质时，可作为一种强有力的工具。 体内根据EAE治疗时机的考虑 例如在疾病发生之前或之后，结合检测中枢神经系统中的免疫细胞浸润以及外周免疫细胞的增殖与活化情况，可以明确治疗手段对免疫系统和中枢神经系统的双重影响。

尽管C57BL/6小鼠的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型应用更为广泛，但SJL小鼠的EAE模型可能更能代表多数多发性硬化（MS）病例，因为这些小鼠表现出复发-缓解的表型，并伴有免疫细胞向脑实质的浸润10。SJL小鼠在缓解期具有明显的恢复特征，因此可在疾病表现后、炎症减轻期间开始治疗。需要注意的是，SJL小鼠的复发与缓解并不总是同步发生，这可能导致在合并结果时出现较大的变异性。因此，部分研究人员可能选择展示单只动物的代表性临床评分结果，同时在疾病进展的个体化时间点分别采集小鼠用于FACS分析和组织学检查。

考虑在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠病程中的干预时机，有助于确定治疗手段对免疫系统或中枢神经系统（CNS）的影响。治疗开始的时间有多种选择，每种时机都暗示着免疫细胞是否已进入中枢神经系统，以及它们与中枢神经系统的相互作用方式。在症状出现前开始治疗，意味着免疫细胞尚未进入或对中枢神经系统造成损伤；而在症状出现后开始治疗，则表明免疫细胞已经侵入中枢神经系统并造成一定程度的损害。使用SJL小鼠时，治疗还可选择在复发期启动，此时免疫细胞正活跃地浸润并引发炎症；或在缓解期启动，此时中枢神经系统中的免疫细胞可能较少，炎症程度也较轻。在确定治疗干预时机时，结合免疫细胞在病理过程中所处阶段，可初步提出关于治疗手段如何影响中枢神经系统和免疫系统的假设。

治疗手段可通过多种方式影响免疫细胞和中枢神经系统（CNS），最终减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）症状的严重程度。因此，有必要采用流式细胞术分析和免疫组织化学方法，评估免疫细胞在外周和中枢神经系统中的变化情况、免疫细胞是否已进入中枢神经系统，以及中枢神经系统对治疗的反应。尽管对脊髓进行流式细胞术分析可确定在特定时间点进入中枢神经系统的细胞数量，但除非脾脏中免疫细胞的增殖未受影响，否则无法确定该效应是源于免疫细胞迁移减少所致。因此，必须同时分析外周和中枢神经系统组织，并通过比较两种组织的结果来阐明其潜在的作用机制。此外，治疗还可能改变免疫细胞的活性谱型，例如由以致病性辅助性T细胞为主的表型转变为以调节性T细胞为主的表型。因此，检测不同细胞类型的标志物，并比较经治疗与未治疗动物之间各标志物表达百分比的变化，也是重要的分析内容。多发性硬化（MS）研究中的一个新兴观点认为，B细胞在自身免疫性脱髓鞘过程中发挥重要作用，这一观点基于研究表明B细胞对于T细胞的再活化是必需的20。该观点也得到了利妥昔单抗等治疗手段成功的支持，利妥昔单抗是一种靶向B细胞表面表达的CD20分子的抗体21,22。正如奥瑞珠单抗（ocrelizumab）在临床试验中取得的成功所表明，靶向CD20分子不同表位的药物可能进一步提高针对B细胞治疗策略的疗效23。

本文所介绍技术的一个局限性在于，免疫细胞可能进入中枢神经系统（CNS），但无法在实质组织中迁移。可通过免疫组织化学方法检测免疫细胞的血管周围套袖现象，并评估经处理与未处理动物之间免疫细胞在实质组织中迁移的距离。另一个潜在的局限性涉及微生物组对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）发病机制的影响。共生的肠道微生物群可显著影响疾病的发生发展24；因此，饲养于不同种群甚至不同笼具中的小鼠，其疾病严重程度可能存在巨大差异。因此，在涉及EAE的实验中，应尽可能使用同窝对照小鼠，并在同一笼具中饲养。最后需指出的是，如果实验上希望消除外周免疫细胞增殖变化的影响，可考虑采用被动转移诱导方法，而非本方案中所述的主动诱导方法。

可通过共培养系统11进一步验证神经保护作用，以检测细胞死亡的特定机制，或利用条件性基因敲除小鼠，实现特定细胞类型中蛋白的选择性缺失。此外，为了拓展对具有神经保护作用的药理学制剂的研究，应纳入轴突横断和神经元死亡的标志物。另一个重要的研究方向是髓鞘再生。受损轴突无法实现再髓鞘化，这进一步支持将神经保护疗法作为髓鞘再生治疗的重要组成部分。此外，无髓鞘轴突比有髓鞘轴突更易受到损伤。这提示当轴突发生脱髓鞘后，促进及时再髓鞘化的治疗干预将可预防轴突损伤。为探索这些方向，可采用其他用于研究脱髓鞘与再髓鞘化的体内模型（例如，环己酮和溶血卵磷脂模型）。本文所述方法侧重于通过量化髓鞘丢失来评估神经保护作用。而对于再髓鞘化的评估，还应考察前体细胞的数量及其增殖与成熟能力。在提及这些替代模型时，也必须考虑由病毒介导的不同脑炎模型。目前已有两种特征明确的RNA病毒模型可导致髓鞘丢失：其一是鼠类脊髓灰质炎病毒（Theiler's murine encephalomyelitis），一种无包膜的小RNA病毒科（Picornaviridae）病毒；另一种是小鼠肝炎病毒，属于冠状病毒科（Coronaviridae）病毒家族25,26。

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究各种干预或治疗手段如何影响免疫系统和中枢神经系统（CNS）体内功能的有力工具。本文所述方案有助于确定治疗作用于疾病过程的具体环节，无论是在外周免疫系统、血脑屏障，还是在中枢神经系统内部。目前尚无能够治愈多发性硬化症（MS）的疗法，患者常随时间推移出现病情恶化。类似地，其他涉及免疫细胞浸润中枢神经系统并导致髓鞘破坏的疾病，如急性播散性脑脊髓炎、横贯性脊髓炎和视神经脊髓炎谱系疾病，也缺乏能够在免疫细胞直接攻击下保护中枢神经系统的有效治疗手段。通过综合考虑治疗时机，并结合流式细胞术对脾脏和脊髓的分析，以及对中枢神经系统的免疫组织化学检测来评估炎症与损伤程度，可深入阐明治疗作用的潜在机制。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国家神经疾病与卒中研究所（NINDS）P30-NS069324、美国国家多发性硬化症协会RG 4587-A-1、国际Civitan研究基金会、Mike L. Jezdimir横贯性脊髓炎基金会、阿拉巴马大学健康服务基金会普通捐赠基金、美国国家科学基金会1355183项目以及美国国立卫生研究院下属国家过敏与传染病研究所T32 AI007051项目资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
22 x 22 x 20 毫米包埋模具Fisher ScientificNC9719245
22 x 30 x 20 毫米包埋模具Fisher ScientificNC9531194
2-巯基乙醇（55 mM）Thermo Fisher Scientific 21985-023
2-甲基丁烷Fisher ScientificO3551-4
30 x 22 x 20 毫米包埋模具Fisher Scientific18-30
ACK裂解缓冲液Quality Biological118-156-101
抗CD4 PE-Cy7BD Biosciences5527750.2 mg/ml 储存浓度
抗Foxp3-FITCeBioscience11-5773-820.5 mg/ml 储存浓度
抗GFAP（混合抗体）Biolegend8353011 - 3 mg/ml 储存浓度
抗Iba-1多克隆抗体（50 µg）Wako019-197410.5 mg/ml 储存浓度
抗IFN-γ APCeBioscience17-7311-820.2 mg/ml 储存浓度
抗IL-17A PerCP-Cy5.5eBioscience45-7177-820.2 mg/ml 储存浓度
抗Ki-67 PEeBioscience12-5698-820.2 mg/ml 储存浓度
抗MBP（D-18）Santa Cruz Biotechnologysc-139120.2 mg/ml 储存浓度
抗TCRβ FITCeBioscience11-5961-850.5 mg/ml 储存浓度
抗TCRβ PEeBioscience12-5961-830.2 mg/ml 储存浓度
生物素化山羊抗兔IgGVector LabsBA-10001.5 mg/ml 储存浓度
生物素化马抗小鼠IgGVector LabsBA-2000 1.5 mg/ml 储存浓度
柠檬酸，无水，99.5%Fisher ScientificAC42356-5000
乙二胺四乙酸（EDTA），四钠盐二水合物，99%Fisher ScientificAC446085000
胎牛血清HyCloneSH30071.03
Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片，每箱10片Fisher Scientific12-550-15
高尔基体阻断剂（Golgi Plug）BD Biosciences555029蛋白转运抑制剂
Immedge 疏水屏障笔Fisher ScientificNC9545623
离子霉素EMD Millipore407952-5mg
L-谷氨酰胺，100倍浓缩液Corning25-005-Cl
MEM非必需氨基酸Corning25-025-Cl
近红外活/死细胞染色试剂盒Life TechnologiesL10119细胞活力染料
正常山羊血清Vector LabsS-1000
正常马血清Vector LabsS-2000
多聚甲醛，96%Fisher ScientificAC416785000
青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩液Corning30-002-Cl
PercollGE Healthcare17-0891-01密度梯度介质
PermountFisher ScientificSP15-500树脂封片剂
佛波醇12-十四烷酸酯13-乙酸酯（PMA）SigmaP1585-1mg
纯化抗髓鞘碱性蛋白抗体BioLegend808401
RPMI 1640Corning10-040-CM
丙酮酸钠Corning25-000-Cl
Tissue-Tek CRYO-OCT 包埋剂Fisher Scientific14-373-65
吐温X-100Sigma-AldrichT9284非离子型去垢剂
Vectastain Elite ABC 试剂盒（标准型）Fisher ScientificNC9206402亲和素-生物素-过氧化物酶 复合物（ABC）用于免疫过氧化物酶 
Vector Laboratories 过氧化物酶底物试剂盒（DAB）Fisher ScientificNC9276270DAB溶液

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免疫细胞浸润流式细胞术EAE模型组织处理密度梯度离心ImageJ分析髓鞘碱性蛋白反应性胶质增生
确定药理学干预在自身免疫性脱髓鞘中对免疫系统抑制与中枢神经系统保护的作用
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