方法文章

使用 CeleST 软件对秀丽隐杆线虫（C. elegans）游泳行为进行自动化分析

DOI：

10.3791/54359

⸱

2016年12月7日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Rutgers University, 2Computing Research and Education Building (CoRE), Rutgers University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种高效且简便的基于计算机分析线虫在液体中游泳行为的方法。该方法对秀丽隐杆线虫（C. elegans）实验室几乎无需额外投入。所用硬件为常规设备，用于行为分析的计算机软件（CeleST）为开源软件。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

解析调控行为的神经元及神经肌肉回路仍是生物学领域的一项重大挑战。线虫 秀丽隐杆线虫 在应对这一挑战方面，已被证明是一种不可或缺的模式生物，从启发技术方法到 构建人类大脑连接组，以揭示基本功能模式背后的特定分子驱动因素。大部分行为学研究在 秀丽隐杆线虫 已在固体基质上完成。在液体环境中，动物表现出包括在三维空间中以不同速度运动以及部分身体运动（如后部弯曲而前部形态不变）在内的行为模式，这为定量分析带来了新的挑战。以下是一个简单流程的步骤，以及一种可实现高分辨率分析的软件的使用方法。 秀丽隐杆线虫 游泳行为在此呈现。该软件名为 CeleST，采用一种专门的计算机程序，可同时追踪多个动物，并提供全新的运动特征量化指标 秀丽隐杆线虫 液体中的运动（游泳）。这些指标主要基于动物体态，并运用计算机视觉与模式识别中的数学方法，无需设定计算阈值。该软件工具既可用于评估数百只动物在多个小规模实验中的整体游泳能力，也能在已有深入研究的遗传突变体中发现新的表型。CeleST 分析所用样本的制备过程简单且无需复杂技术，便于科学界广泛采用。因此，使用此处描述的计算方法将有助于更深入理解行为及其神经环路基础。 秀丽隐杆线虫 模型

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

阐明遗传、表观遗传、经验与环境如何影响行为是现代生物学面临的一项重大挑战。利用结构简单且遗传背景清晰、可进行计算追踪与定量分析的模式生物，可为实现这一目标作出关键贡献。线虫 秀丽隐杆线虫 是一种这样的模型。本文的目的是演示如何 秀丽隐杆线虫 游泳运动可以被追踪和定量，以提取具有生物学意义的八个新特征的信息。

C. elegans 在 20 °C 条件下具有相对较短的寿命，约为 2 - 3 周，生殖期大约为 4 天1,2。在标准的实验室培养条件下，这种微型线虫被培养在含有线虫生长培养基（NGM）的培养皿中，并接种细菌作为食物来源3,4。野生型 N2 动物在含琼脂的培养皿上以优雅的正弦波形式活跃移动；它们在漫游（寻找食物）、驻留（觅食）或进食后恢复（静息性饱食）时会改变运动速率5。运动能力受损6或衰老7-12也会显著改变其在培养皿上的运动行为。

通过分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）的运动模式或运动能力，可以对调控行为、健康寿命或衰老的基因进行功能表征。一种测量健康寿命的方法是根据线虫在培养板上的运动能力，将衰老的成虫分为三类（例如，A、B 和 C），其中剧烈运动活动属于 A 类，瘫痪属于 C 类7,8,13。尽管这种定性分类有助于揭示身体机能的差异，但这些类别范围较宽且缺乏明确的界限，因此评分容易受到实验人员主观判断的影响。

越来越多的追踪技术提高了对 C. elegans 在固体培养基上运动分析的客观性、复杂性和精确性14-18。C. elegans 在培养板上的运动主要局限于动物与培养基固体表面接触的平面内。（C. elegans 也可通过将头部抬起离开仍与固体表面接触的身体其余部分，使身体处于多个平面，从而引发探索行为。然而，这种行为并不常见。）当置于液体环境中时，这种线虫会启动一种波动式运动，即游泳，其运动具有更广泛的空间维度、更大的速度和运动深度范围，并且与在固体表面的个体相比，随着年龄增长，其身体前部与后部运动方式出现差异的频率也更高。作为一种对身体机能和对新环境反应的快速评估方法，实验人员可将单个线虫放入液滴中，在解剖显微镜下记录其体部弯曲的频率。视频记录有助于当前和未来对线虫游泳活力的评估。然而，人工方法限制了可评估特征的数量，且只能一次评估一只线虫。

与在固体介质上的运动相比，在液体中的运动研究较少。事实上，目前可用于实验室中测量液体中运动行为的软件选择有限，且多数缺乏足够的稳健性和易用性19-24。CeleST（C. elegans Swim Test）软件具有操作简便的优点，并采用基于数学的分析方法，可提供直接反映运动本质的数据（如曲率评分）8（Restif et al.8 中对该软件的功能与优势有详细描述）。此外，计算分析能够揭示出人类肉眼无法识别的表型特征。本文展示了体现该分析方法分辨率的示例数据，并描述了一种易于实施的实验方案，用于记录游泳实验，以便后续进行 CeleST 分析。

方案

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1. 线虫的培养与操作

  1. 在含有NGM 的标准培养皿上培养秀丽隐杆线虫（C. elegans），并以点接种OP50-1大肠杆菌（Escherichia coli）作为食物来源1-3。
  2. 将培养物置于可维持设定温度的培养箱中。C. elegans在15至25 °C范围内生长良好，其中20 °C为标准培养温度。
    注意：游泳行为是一种稳定的表型，但其运动强度可能受环境因素影响，包括培养皿污染以及培养物和载玻片过热。应尽力保持稳定的实验条件。
  3. 使用自制的线虫挑取工具（将铂金丝烧灼密封于玻璃棒中制成）来转移单个线虫个体4。

2. 游泳分析的设置

  1. 使用由体视显微镜、数字CCD相机和数字视频录制软件组成的集成系统。CeleST软件可在独立计算机上使用。
    1. 用深色布料（例如，毛毡）覆盖显微镜，以防止载玻片上泳动区域产生反光，从而提高图像质量。
    2. 调节显微镜的工作距离和放大倍数，以完整观察泳动区域，并调整底座反光镜，使动物与背景之间具有清晰的对比度。将照明设置为暗场，使成虫身体在黑色背景上呈现为白色，这非常有利于游泳分析软件进行计算可视化和追踪。
    3. 务必保持工作区域、载玻片和泳滴的清洁。碎屑可能阻碍成虫自由游动，干扰 分析；而细小的纤维丝状物在追踪过程中可能被误识别为静止不动的个体。

3. 液体环境中体能分析的动物准备

  1. 用移液器将 60 µL 的 1× M9 缓冲液加入到显微镜载玻片上预先印制的 10 mm 环内。确保液滴完全覆盖环内的区域。与使用多孔板相比，软件可从载玻片上该体积的液滴中提取更多的运动信息。
  2. 挑取单个成年线虫，并将其转移至 1× M9 缓冲液液滴中，尽量减少携带细菌，以免液体浑浊。可通过先将待转移的线虫放置在培养皿中无明显菌苔的区域，让其爬行一段时间，以减少所携带的细菌，然后轻轻挑起线虫。
    1. 将线虫转移至液滴时，应使用靠近分析工作站的解剖显微镜，以缩短游泳时间，避免影响线虫的行为25。
    2. 若线虫活动剧烈且频繁交叉路径，则每个液滴中仅放入 4 条成虫。为尽量减少游泳路径重叠（以免干扰计算机分析），当线虫活动性与年轻健康的野生型成虫相当时，建议每滴放 4 条；当线虫年龄较大、活动性减弱时，每滴可放 5 条。
      注意：健康的野生型线虫在被放入液体后会本能地立即开始游泳。若线虫在液滴中聚集，可用线虫挑针轻轻将其分开。

4. 液体中体能的分析——游泳视频记录

  1. 将载有成体的载玻片置于显微镜载物台上，以记录其游泳行为。30 s 视频可捕捉单个动物在液体中的行为细节视频 1），在 CeleST 软件的辅助下，可轻松实现对大量此类记录的采样8,26；然而，更长的游泳时间可能更适合其他特定的行为学研究25重要的是，在所有记录过程中务必保持相同的放大倍数，因为放大倍数的差异会影响游泳行为分析，并导致比较结果出现偏差。
    注意：这些步骤是使用本文件所列的数字视频录制软件提供的指导性说明 材料表; VirtualDub 开源软件或许可以替代，但我们尚未测试过。
    1. 使用以下设置作为成功进行游泳分析的指导：图像尺寸为 696 x 520 像素，图像分辨率为 0.02 mm/像素，帧率为 18 帧/秒。采用更高分辨率的设置可能有助于追踪，但不会影响程序计算的测量结果。
      注意：60 µL 提供的游泳区域 显微镜载玻片上的1x M9缓冲液滴深度较小，可最大限度减少生物体的上下游动。
  2. 在“设置”中，进入“录制”选项，将“限制序列大小”设为“磁盘上545帧”。在同一标题下，勾选“使用录制管理器”复选框。点击“编辑当前录制脚本...”按钮，在“命令”下选择“抓取帧”，在“停止条件”下输入“30.00秒后停止”。
  3. 在“主页”标题下选择“在内存中新建序列”，然后按下红色的“录制”按钮。软件将在30秒内采集545帧图像。 使用数码相机拍摄并将其保存在RAM存储器中。

5. 液体中体能的分析——视频处理

  1. 在视频录制软件中，单击主页标题并选择“导出完整序列至…”，将视频分割为一系列图像帧。
    注意：数字视频录制软件可将图像帧保存为 .bmp、.jpg、.tif 或 .png 格式，以上格式均可被本文介绍的游泳分析程序读取。请注意，.tif 文件占用更多存储空间，但某些格式（如 .jpg）可能会降低图像质量。
  2. 在 MATLAB 中单击运行按钮，启动游泳分析程序。
  3. 在游泳分析程序的主界面，使用“添加单个视频”或“添加多个视频”按钮，逐个或成组上传图像帧序列，并为每个序列附加相关标签，例如基因型、日期、实验编号和持续时间。软件将创建一个包含已标注序列的数据库。
  4. 单击“1. 处理视频”以启用对上传序列中多个动物的同时追踪。在新界面中，于左侧框内选择所需视频，然后单击“添加到列表”。针对每个视频，单击右上列表中的视频名称，即可在右下区域显示该视频的第一帧图像。通过在环形区域内选择三个点来划定游泳区域，然后单击“处理上述所有视频”以启动处理过程。处理进度可在界面底部中央查看。
  5. 处理完成后，单击“关闭”以关闭视频处理界面。

6. 液体中体能的分析——测量

  1. 点击“2. 计算参数”以打开一个新界面，在此界面中可逐个上传已处理的视频，用于验证或拒绝单个动物的追踪结果。已处理的视频将出现在左侧列表中，点击视频名称即可上传该视频。
  2. 利用此手动步骤，重点关注追踪失败区域（红色块）与成功追踪区域（绿色块）之间的对比。
    注意：由于该软件具有稳健的追踪系统（在来自404个视频的2,020只动物中观察到94.1%的有效性8），也可直接依赖其自动输出的有效追踪结果。
    1. 在屏幕下半部分的第一条彩色条形图中找到“分段身体的有效性”。其中，“有效帧”的百分比以绿色显示，“被拒绝帧”的百分比以红色显示。若有效帧比例 ≥80%，则表示用于计算参数的追踪信息来自以18帧/秒记录的30 秒游泳试验中540帧里的至少432帧。
    2. 使用“下一区块”、“切换有效性”、“分割区块”和“隔离帧”选项，可轻松导航并修改有效/被拒绝帧的区块。在极少数情况下，若两只动物在不拥挤的游泳区域内路径交叉，可通过“切换”按钮在特定帧范围内交换它们的编号。
    3. 查看屏幕下半部分的柱状图，以获取有关追踪性能和重叠情况的额外信息。分段身体长度（每帧中动物的身体长度）与重叠事件的发生频率相关。
  3. 如果视频中存在任何亮斑干扰分析，可通过选择“反光区域”功能来调整游泳区域内的明亮部分。
  4. 在上传下一个已处理视频前，点击“保存并计算参数”以保存有效性输入。在此阶段，软件将在后台（对用户不可见）计算各个动物游泳表现的曲率图，并计算如下所示的参数（视频2）。
    注意：本文重点描述的测量参数见于表1。波动起始率、体波数、不对称性、伸展度和卷曲度是基于软件为动物计算出的曲率图得出的；而行进速度、划水幅度和活动指数参数则不基于曲率图。
  5. 点击“关闭”以退出“计算参数”界面。

7. 液体环境中的体能分析——结果输出

注意：该软件可报告多种游泳运动指标，涵盖从明显的到极为细微的行为特征，而这些特征通常难以通过肉眼观察进行评分（视频 3 和 4）。本文重点关注通常表现出良好动态范围的 8 个参数：波形启动频率、体波数量、不对称性、伸展度、卷曲度、移动速度、划水幅度和活动指数。

  1. 在程序的主界面中，点击“3. 显示结果”以获取分析输出。
  2. 通过在左侧框中选择所需分析的帧序列，并点击“添加到选定样本”或“添加到新样本”按钮，将其移至新样本组或现有样本组，从而创建用于统计处理的样本组。
  3. 点击“显示这些样本的图表”，进入第二个界面，在屏幕顶部选择后可查看各样本在8个参数上的图表及关键统计结果。
    1. 如有需要，可使用屏幕左上方的“颜色”、“直方图数量”和“线虫数量”选择器调整柱状图的显示方式。
  4. 使用“2D直方图”功能，在屏幕左侧的“X轴测量”和“Y轴测量”下拉菜单中选择任意两个参数，绘制其组合图。点击“关闭”退出并返回“显示结果”界面。
  5. 使用屏幕左上方的“导出…”按钮，将详细的数值数据保存为 .csv 文件，以便在电子表格程序中打开并进一步处理。
  6. 关闭“显示结果”界面返回主界面，然后点击“退出”，以确保保存包含已分析视频序列的数据库。

结果

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通过分析液体环境中的运动行为（游泳），可以揭示在固体培养基上不易观察到的表型（爬行）。为了定量评估游泳运动，我们开发了专门的软件，用于测量游泳行为的十个新参数8。其中最有用的八个参数在表1中进行了详细描述。这些参数分别为：波形起始频率（Wave initiation rate）、体波数量（Body wave number）、不对称性（Asymmetry）、伸展度（Stretch）、卷曲度（Curling）、移动速度（Travel speed）、划水幅度（Brush stroke）和活动指数（Activity index）。已有研究利用该软件的强大功能，定义了数百只野生型（WT）以及具有行为或寿命突变背景的衰老成虫的功能衰退过程8，并分析了已被广泛研究的长寿突变体age-1(hx546)和daƒ-16(mgDƒ50)，这些突变体携带破坏正常胰岛素信号通路的基因突变。age-1基因编码磷脂酰肌醇3-激酶（PIK3）的催化亚基，当其携带hx546突变时，可导致寿命延长和应激抗性增强27-29。daƒ-16基因编码叉头框O（FOXO）转录因子，当该基因缺失时会缩短寿命并损害应激反应能力30-33。

即使在有利的遗传背景下，游泳的某些参数（如波动起始频率、行进速度、划水动作和活动指数）也随着年龄增长而逐渐下降（图1）。与现有认知一致，寿命较长的 age-1(hx546) 突变体在老年及极老年阶段表现出比野生型更强的运动能力。正如预期，寿命较短的 daf-16(mgDf50) 突变体则表现出运动能力受损，尤其是在极老年阶段。值得注意的是，只有在CeleST计算机视觉与数学算法分析系统的精细检测下，才能在成年早期发现 age-1(hx546) 突变体具有更优的游泳表现。这一事实表明，age-1(hx546) 突变在年轻成年期即可增强运动能力，提示该突变以一种此前未被充分认识的方式影响了正常的发育和/或年轻成年期的表型（图1）。

在野生型和衰老突变型成虫中，体波数、不对称性、伸展和卷曲参数均随年龄增长而上升（图2）。有趣的是，该软件的分辨率能够揭示更精细的行为特征，例如age-1(hx546)突变体在整个生命周期中持续保持的对称性，以及极高龄的daƒ-16(mgDƒ50)突变体无法像同龄的野生型和age-1(hx546)成虫那样充分伸展和卷曲的现象。

除了因年龄增长导致的身体机能不可避免的整体下降外，即使在遗传背景和环境几乎相同的情况下，每位成年个体在衰老过程中的进展模式也各不相同7。（通过控制遗传和环境因素，可最大限度地减少这些因素的混杂影响，从而揭示出随机性在衰老相关退化中的重要作用。）在受控环境中维持的具有相似遗传背景的同步化 C. elegans 种群，仍会根据其衰老特征包含多种不同类型的个体。尽管所有个体均以健康成年状态开始，但部分个体迅速丧失身体机能（不良衰老者，C类），而另一些个体则能在更长时间内保持活力（优雅衰老者，A类）。因此，不良衰老者的健康寿命明显短于优雅衰老者。

正如我们在研究中进一步详述的那样8，健康衰老个体保持了年轻的体能水平，这一点通过与年轻得多的成年个体的游泳特征进行比较得以观察（图3、4和5）。这种持续的体能水平与长寿的age-1(hx546)突变体在生殖后期（第11天）的运动表现相当（图1和2）。相反，衰老不良个体在生殖结束后不久便急剧丧失了大部分身体机能，其表现水平类似于极度衰老和早衰的daƒ-16(mgDƒ50)成年个体（图1 - 4）。这些相似性可通过粗略比较得出，但在更细致的观察下，特定的特征差异显而易见。例如，尽管在极度衰老的野生型和衰老相关突变体中，伸展和卷曲的程度存在一定相关性（图2），但在衰老不良个体中并未观察到这种关系（图4和5），后者在测试样本中表现出更强的卷曲倾向，但伸展能力并未相应增强。因此，我们所介绍的软件通过提供此前难以实现的更复杂研究工具，拓展了对体能或运动能力分析的维度。总之，CeleST以八项新颖的测量指标提供全面的行为读数，这些指标定义了特定遗传、表观遗传和环境背景下的行为特征指纹，有助于识别独特或共有的参数模式，这些模式可作为特定条件（环境、药理、营养）、生物学过程或生物体状态（如健康寿命）的标志。

波起始率、活动指数、划动次数、移动速度柱状图；遗传性衰老研究数据。
图 1：CeleST 软件报告野生型（WT）、age-1(hx546) 和 daƒ-16(mgDƒ50) 成虫在第 4 天（青年期）、第 11 天（生殖后阶段）和第 20 天（极老年期）的波起始率（A）、活动指数（B）、划动次数（C）和移动速度（D）。 y 轴中的“#”表示“数量”。WT 以灰色表示，age-1 以绿色表示，daƒ-16 以红色表示。误差线代表均值的标准误（SEM）。同龄的 WT 与衰老突变体通过单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计学显著性比较，随后进行 Dunnett 多重比较检验。**，p = 0.001 - <0.01；***，p = 0.0001 - <0.001。每个数据点 n = 62，来自四次独立实验。请注意，此处以及 图 2 中，每段 30 秒的视频包含 4 只动物，每次实验我们从 4 段游泳视频中共计评分 16 只动物，每个数据点均进行 4 次生物学重复。请点击此处查看该图的放大版本。

不同品系随年龄变化的身体波动分析图表，显示波数、不对称性、伸展度和卷曲度。
图 2：野生型（WT）、age-1(hx546) 和 daƒ-16(mgDƒ50) 成虫在第 4 天（青年期）、第 11 天（生殖后阶段）和第 20 天（极老年）的身体波动波数（A）、不对称性（B）、伸展度（C）和卷曲度（D）的软件分析报告。 y 轴中的“#”表示“数量”。WT 以灰色表示，age-1 以绿色表示，daf-16 以红色表示。误差线代表平均值的标准误（SEM）。同龄的 WT 与衰老突变体之间采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Dunnett 多重比较检验以评估统计学显著性。*，p = 0.01 - <0.05；**，p = 0.001 - <0.01；***，p = 0.0001 - <0.001。每个数据点来自四次独立的 30 秒游泳实验，n = 62。请点击此处查看该图的放大版本。

波发起、活动指数、划动次数、移动速度柱状图；昆虫衰老；行为分析。
图3：软件报告的年轻野生型成虫（D 4）以及同龄优雅衰老型和不良衰老型个体（D10 和 D11）的波发起率（A）、活动指数（B）、划动次数（C）和移动速度（D）。 y轴中的“#”表示“数量”。年轻野生型组以灰色表示，A类优雅衰老型以绿色表示，C类不良衰老型以红色表示。误差线代表平均值的标准误（SEM）。采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行Dunnett多重比较检验，将A类优雅衰老型和C类不良衰老型与D4年轻成年个体进行比较。****，p <0.0001。每个数据点n = 27，来自两次独立的、持续30秒的游泳实验。该图略作修改自Restif et al. (2014)8，原图发表于Creative Commons Attribution (CC BY) 许可协议下 http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。请点击此处查看此图的放大版本。

身体运动分析；柱状图；波数、不对称性、卷曲程度随年龄在A类和C类中的变化。
图4：软件对年轻野生型成年个体（D4）、同龄优雅衰老个体和不良衰老个体（D10和D11）的身体波数（A）、不对称性（B）及卷曲程度（C）的分析结果。 y轴中的“#”表示“数量”。年轻野生型个体以灰色表示，A类优雅衰老个体为绿色，C类不良衰老个体为红色。误差线代表均值的标准误（SEM）。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Dunnett多重比较检验，将A类优雅衰老个体和C类不良衰老个体与D4年轻成年个体进行比较。**，p = 0.001 - <0.01；****，p <0.0001；n/a，不适用，因在总样本中仅有一只动物出现卷曲行为。每个数据点n = 27，来自两次独立的30秒游泳实验。该图略作修改自Restif et al. (2014)8，原图发表于Creative Commons Attribution (CC BY) 许可协议下，http:/creativecommons.org/licenses/by/4.0/。请点击此处查看该图的放大版本。

曲率范围随年龄变化的柱状图，揭示了一项科学研究中随天数变化的伸展能力。
图 5：年轻野生型成年个体（第 4 天）以及同龄优雅衰老和不良衰老个体（第 10 和 11 天）的伸展能力软件分析报告。 年轻野生型个体以灰色表示，A 类优雅衰老个体以绿色表示，C 类不良衰老个体以红色表示。误差线代表平均值的标准误（SEM）。采用单因素方差分析（ANOVA）结合 Dunnett 多重比较检验，将 A 类优雅衰老和 C 类不良衰老个体与第 4 天的年轻成年个体进行比较。每个数据点来自两次独立实验，n = 27。该图略作修改自 Restif et al. (2014)8，原论文发表于 Creative Commons Attribution (CC BY) 许可协议 http:/creativecommons.org/licenses/by/4.0/ 下。请点击此处查看该图的放大版本。

秀丽隐杆线虫在圆形区域中的运动分析显微镜图像，展示线虫运动行为。
视频 1：C. elegans 成虫代表性群体的游泳行为。 请点击此处观看视频。（右键可下载。）

流体动力学流动分析；速度分布图，流动模式示意图；流体动力学研究数据。
视频 2：CeleST 软件计算受试动物游泳表现的个体曲率图。 曲率图在后台计算生成；在软件用户界面中不会显示。 请点击此处观看该视频。（右键单击可下载。）

静力平衡示意图；图表显示受力分析和位移趋势；结构分析。
视频 3：基于个体曲率图的游泳指标软件计算。 请点击此处观看视频。（右键单击可下载。）

显微镜示意图、颗粒追踪、数据图、轨迹分析、科学实验结果。
视频 4：不依赖曲率图的游动参数软件计算方法。 请点击此处观看视频。（右键可下载。）

讨论

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使用 秀丽隐杆线虫 作为一种模式系统，其应用持续增长，这得益于其基因的可塑性、实验的可操作性以及精细注释的解剖结构。例如，其神经元结构与连接性 秀丽隐杆线虫 雌雄同体的结构被清晰地描绘出来34-36，极大地促进了对控制特定行为的神经环路的研究。成年雌雄同体秀丽隐杆线虫的神经系统由302个神经元组成，能够将多种感觉输入转化为运动等基本行为输出。更为复杂的雄性神经系统结构也已被描述。37，从而能够研究性别特异性的神经环路。37

C. elegans 的行为已在含有固体培养基的标准培养皿上进行了广泛研究。由于野生型 C. elegans 在含琼脂的培养皿上以可预测的正弦波形式移动，因此可以通过肉眼观察并手动记录偏离整体运动模式的情况。然而，这种方法依赖于实验者的主观判断，且劳动强度较大。专门设计用于在固体培养基上追踪和测量 C. elegans 运动行为的硬件与软件工具能够消除主观偏差，并支持大规模研究，从而有助于回答更为复杂的生物学问题。Schafer 实验室最近建立的行为数据库16 就是一个很好的范例，展示了基于计算系统对平板上运动行为分析所达到的广度与深度。

当野生型 C. elegans被置于液体中时，该动物会迅速适应新环境并开始游泳。C. elegans在液体中的游泳运动幅度大于爬行，且可能更加不规则8。CeleST等软件旨在弥补对液体中C. elegans行为进行详细分析的不足，可量化那些肉眼难以直接观察或比人工评分更快速获取的运动相关参数。在8小时内，一个人每天最多可处理200个视频，约1,000条记录。

该软件定义了用于评估游泳行为的参数，这些参数可作为身体素质和行为特征的综合指纹。此外，这些参数还有助于深入理解复杂的行为和生理特征 秀丽隐杆线虫 液体中的行为及其潜在的分子通路，该软件可用于探究生物学的多个方面，包括药理学反应、衰老以及不同的行为表现。本文展示了在生物体物理性能方面发生的可量化变化的概述 秀丽隐杆线虫 随着成年人年龄增长，这是该软件应用的一个示例（更详细的描述参见Restif） 等8）。在衰老背景下，某些测量参数在野生型中下降，而其他参数则上升或未表现出一致的变化。这些趋势在很大程度上通过长寿突变体的计算分析谱型，以及在相同环境条件下培养的同龄群体中“优雅衰老”与“不良衰老”亚群的相对谱型得到了验证。该软件的高分辨率还能够揭示以往在已充分表征的突变体中未知的细微表型。例如， age-1(hx546) 在 图1).

该实验方案中有一些尤为关键的步骤。保持泳动环境与菌株培养板之间的温度恒定，对于泳动实验的可重复性至关重要，因此强烈建议实验人员尽最大努力避免温度的随机变化。泳动培养基的温度应与培养板保持一致。同样，需仔细控制泳动接种液滴的大小，以确保实验结果的可重复性。最后，应提前考虑大量积累的视频文件的转移与存储问题。建议在与视频采集计算机分离的设备上进行图像处理。

本文介绍的游泳分析软件存在一定的局限性。首先，尽管该程序能够同时追踪多个动物，但如果同时分析超过五只动物，视频图像中动物相互交错的概率会增加。当程序无法明确区分各个动物时，会将这些数据帧屏蔽。虽然此功能可确保单个动物的数据质量较高，但限制了通量。其次，图像应较为清晰，即无灰尘、污迹以及光源造成的反光，因为这些干扰信号也会影响图像分析。如实验方案第2.1.1节所述，一种非常简单且低成本的方法是用一块深色布料覆盖显微镜载物台区域，以隔绝环境光的干扰，从而显著改善图像采集质量。第三，该程序主要针对成年阶段的动物进行了优化。幼龄幼虫游动速度快且体型小，容易增加程序分析的误差。第四，部分软件依赖MATLAB运行，当MATLAB版本或操作系统升级时，某些程序链接可能会中断。目前，软件在MATLAB 2015b和Mac OS 10.10版本上运行效果最佳，但我们预计不久将发布一个对这类变更更具兼容性的软件版本。最后，视频数据文件可能迅速变得庞大，需预留足够的存储空间。

总之， 本文介绍了一种简单的方法，任何实验室均可在无需大量投入的情况下轻松实施，用于制作视频 秀丽隐杆线虫 用于CeleST分析的游泳行为。该软件包的特点包括从追踪到分析的广泛自动化、同时对多只动物进行追踪，以及使用数学基底（即， 曲率测量）来量化大多数运动参数。该软件为开源，代码和示例的详细信息可在 Restif 中公开获取 等8. 尽管该程序具有用于追踪的高级计算机视觉分析功能，但其他已发表的追踪系统（例如格林布卢姆 等, 201438) 与本文介绍的软件参数分析功能兼容。未来的改进将致力于将该软件转化为一个更加稳健的软件包，不再限制于上述特定版本的操作系统（如文中也已注明的） 材料表).

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CeleST 的开发得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 R21AG027513 和 U01AG045864 的支持。数据及部分短视频内容改编自 Restif et al. (2014)8，原始内容依据知识共享署名（CC BY）许可协议 http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ 发布。  我们感谢 Ricardo Laranjeiro 在论文撰写方面提供的帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>试剂
N2秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）秀丽隐杆线虫 野生型（祖先型）。
OP50 大肠杆菌秀丽隐杆线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）生物安全等级：BSL-1。
OP50-1 大肠杆菌 秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）OP50链霉素抗性菌株  生物安全等级：BSL-1
硫酸链霉素盐Sigma-AldrichS6501
打印的显微镜载玻片 赛默飞世尔科技金封荧光抗体载玻片：3032-002有两个用白色陶瓷墨水标出的蚀刻圆圈，直径为10 mm
线虫生长培养基（NGM）每升：17 g 琼脂，3 g NaCl，2.5 g 蛋白胨，1 mL 1 M CaCl₂2，1 mL 5 mg/mL 胆固醇乙醇溶液，25 mL 1 M KPO4 缓冲液，1 mL 1 M MgSO₄4，H20 至 1 L。通过高压灭菌进行灭菌。Stiernagle, T. 维持 秀丽隐杆线虫. WormBook，1-11，doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)
M9 缓冲液对于 1 L：3 g KH2PO4，6 g Na2HPO4，5 g NaCl，1 mL 1 M MgSO₄4，H20 至 1 L。通过高压灭菌进行灭菌。Stiernagle, T. 维持培养 秀丽隐杆线虫. WormBook，1-11，doi:10.1895/wormbook.1.101.1（2006）
<强>设备
CeleSTDriscoll 实验室，罗格斯大学秀丽隐杆线虫 游泳实验开源，详见 http://celestmod.github.io/CeleST/ 和 http://celest.mbb.rutgers.edu/
MATLABwww.mathworks.com/downloadsMatLab 版本 2015b（推荐）此处演示的 CeleST 版本在 Mac OS 10.10 和 MatLab 2015b 环境下功能最佳。MATLAB 2015B 对图形处理方式进行了修改，包括引入了新的编码规范和语法。这些更改解决了一个此前无法优雅解决的问题（主要原因是 MATLAB 内部机制确实需要在 MATLAB 2015B 中实施的图形系统重大更新）。因此，CeleST 应始终在 MATLAB 2015B 或更高版本中运行。然而，对于无法获取 MATLAB 2015B 或更新版本（或根本没有 MATLAB）的用户，我们开发了一个无需在计算机上安装 MATLAB 的 CeleST 程序。潜在用户可下载一个安装程序，随后该程序会像大多数软件一样，通过几个简单的提示步骤自动完成安装。  
Mac OSwww.apple.com版本 10.10目前，CeleST 已移植到主要操作系统（Windows、Mac 和 Linux）上。当前代码可在任意操作系统上运行，并且针对每个操作系统均有无需用户安装 MATLAB 即可使用 CeleST 的版本（该版本需要较大的下载量）。其中，Windows 版本测试最少，因此最易出现漏洞；Linux 版本经过中等程度测试；而 Mac 版本则已进行并持续进行广泛测试（主要因为本实验室使用的是该操作系统）。
体视显微镜 ZeissStemi 2000-C 
透射光底座诊断仪器TLB 3.1
数码CCD相机QImagingRolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12)
数字视频录制软件NorpixStreampix 版本 3.17.2

参考文献

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