由人黑色素瘤肿瘤浸润性淋巴细胞生成诱导性多能干细胞

摘要

本实验方案的目的是展示将黑色素瘤肿瘤浸润性淋巴细胞重编程为诱导性多能干细胞的实验方法。

摘要

过继性转移 离体 扩增的自体肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）可在部分转移性黑色素瘤患者中诱导持久且完全的应答。该疗法的主要障碍包括因端粒缩短导致的过继性T细胞活力下降，以及从患者体内获取的TILs数量有限。具有较长端粒的低分化T细胞是过继性T细胞治疗的理想T细胞亚群；然而，大量获得此类低分化T细胞仍存在困难。理论上，可通过使用诱导性多能干细胞（iPSCs）克服过继性T细胞治疗的这一局限，因为iPSCs具有自我更新能力、维持多能性、端粒较长，并可为免疫治疗提供无限来源的自体T细胞。本文介绍一种利用仙台病毒载体将重编程因子导入TILs以生成iPSCs的实验方案。该方案可获得完全重编程且无载体整合的克隆。这些源自TILs的iPSCs可能能够生成低分化的、患者特异性和肿瘤特异性的T细胞，用于过继性T细胞治疗。

引言

通过过表达一组特定的转录因子来生成诱导性多能干细胞（iPSCs）的细胞重编程技术，在细胞治疗领域具有广阔的应用前景^1,2。这些iPSCs在转录和表观遗传特征方面与胚胎干细胞（ESCs）相似，同样具备自我更新能力和多能性^3-5。过去十年中，重编程技术取得了显著进展，使我们甚至能够从终末分化的细胞（如T细胞）中生成人源iPSCs^6-8。由T细胞衍生的iPSCs（TiPSCs）保留了原始T细胞T细胞受体（TCR）链基因相同的重排构型，从而可从TiPSCs再生出抗原特异性的T细胞^9-11。

近80%的来自患者肿瘤的黑色素瘤浸润性淋巴细胞（TILs）能够特异性识别肿瘤相关抗原，并对原始癌细胞保持细胞毒性¹²值得注意的是，肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）上程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）的表达可识别出自体肿瘤反应性T细胞库，其中包括针对突变新抗原特异性的CD8⁺ T细胞⁺ 淋巴细胞¹³体外扩增的自体肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）经过过继性转移，联合预处理性淋巴清除方案及系统性给予白细胞介素-2（IL-2），可在部分患者中引起转移性黑色素瘤的显著消退¹⁴尽管在临床前模型和患者中取得了令人鼓舞的成果，输注T细胞的存活率低以及免疫抑制通路的存在似乎限制了过继性T细胞治疗的全部潜力。目前的临床方案需要大量扩增T细胞 离....

方案

注意：患者应签署知情同意书，以参与经机构审查委员会和人类多能干细胞委员会批准的研究。

1. 肿瘤浸润淋巴细胞的分离与培养

1. 从病理科/组织采集中心获取无需用于组织病理学诊断的肿瘤组织材料。将 20–100 g 肿瘤标本置于含 30 ml 肿瘤收集液（表 1）的 50 ml 离心管中。
2. 使用剪刀将肿瘤标本中坚实、致密的正常组织与脆弱和/或出血性坏死区域分离。去除坏死组织后，继续用剪刀尽可能将标本剪碎。
3. 根据制造商说明书，使用组织解离仪及肿瘤解离试剂盒（人源）将剪碎的组织解离为单细胞悬液。将悬液通过置于 50 ml 离心管上的 70 µm 细胞筛过滤，并用 2 ml RPMI 1640 培养基洗涤筛网 2 次。
4. 在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 10 ml T 细胞培养基（表 1）中。
5. 在 50 ml 离心管中配制双层梯度溶液（如 Ficoll 梯度液），下层为 10 ml 100% 梯度液，中层为 30 ml 用无钙、无镁的杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS(-)）稀释的 75% 梯度液。
6. 将细胞悬液（步骤 1.4 所得）小心铺加在梯度液（步骤 1.5 所得）上层。在 20 °C 下以 400 × g 离心 45 分钟。
7. 收集位于 100% ....

结果

图1展示了实验流程的总体概述，包括首先使用重组人IL-2（rhIL-2）扩增黑色素瘤肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），随后用抗CD3/CD28抗体激活TILs，并将OCT3/4、KLF4、SOX2和c-MYC基因导入TILs以诱导生成诱导多能干细胞（iPSCs）。通常情况下，TILs在含rhIL-2的培养体系中培养21至28天后开始形成细胞球。此时，TILs已准备好接受抗CD3/CD28抗体的激活。图2A显示了培养21天后、处于rhIL-2培养条件下、准备进行抗CD3/CD28激活的TILs。图2B显示了以20 MOI感染剂量转染仙台病毒（SeV）介导的GFP导入效果。图2C显示了在SNL饲养层细胞上、仙台病毒感染后18至21天出现的一个典型多能性克隆。图2D显示所获得的TIL来源的iPSCs具有正常的核型。图3展示了免疫荧光染色结果，用于确认iPSCs表达多能性标志物（SS.......

讨论

本文展示了一种通过SeV介导的四种转录因子OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC转导，将黑色素瘤肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）的实验方案。该方法利用SeV系统对T细胞进行重编程，具有非整合性技术的优势⁷。

先前的一项研究表明，SeV重编程系统不仅能够高效且可靠地重编程成纤维细胞，还能重编程外周血T细胞^7,17。此外，我们最近发现，与外周血T细胞相比，分化程度更高且表达更高水平抑制性受体（如PD-1）的黑色素瘤肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）也可通过SeV载体实现重编程¹⁶。使用抗CD3/CD28刺激与SeV载体感染的时间点对于TILs的重编程至关重要。外周血T细胞在从供体采集后可立即使用抗CD3和IL-2进行刺激以启动重编程⁷，而TILs则需要在IL-2存在下培养3至4周后才能进行刺激。

尽管在使用IL-2培养3-4周并以抗CD3/CD28活化后，超过99%的TIL为CD8 T细胞¹⁶

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
gentle MACS C 管	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentle MACS 组织解离仪	Miltenyi Biotec	130-093-235
人肿瘤组织解离试剂盒	Miltenyi Biotec	130-095-929
RPMI 1640	Life technologies	11875-093
Falcon 70 µm 细胞滤筛	BD	352350
BD Falcon 50 ml 圆锥形离心管	BD	352070
IMDM	Life technologies	12440053
人 AB 血清	Life technologies	34005100
L-谷氨酰胺（200 mM）	Life technologies	25030-081
2-巯基乙醇（1000×，55 mM）	Life technologies	21985-023
青霉素-链霉素	Life technologies	15140-122
庆大霉素	Life technologies	15750-060
Ficoll-Paque PLUS	GE	17-1440-02
D-PBS (-)	Life technologies	14040-133
重组人（rh）IL-2	Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.
纯化无添加剂/低内毒素小鼠抗人 CD3 抗体	BD	555329
纯化无添加剂/低内毒素小鼠抗人 CD28 抗体	BD	555725
X-VIVO 15	Lonza	04-418Q
FBS	Gibco	26140-079
HEPES	Life technologies	15630-080
N-乙酰半胱氨酸	Cumberland Pharmaceuticals Inc.	NDC 66220-207-30
Falcon 组织培养板（6 孔）	Corning	353046
Falcon 组织培养板（24 孔）	Corning	353047
仙台病毒载体	DNAVEC
SNL 饲养层细胞	Cell Biolabs, Inc	CBA-316
丝裂霉素 C	SIGMA	M4287	可溶于水（0.5 mg/ml）
明胶	SIGMA	G1890
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）	Life technologies	PHG0264