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方法文章

由人黑色素瘤肿瘤浸润性淋巴细胞生成诱导性多能干细胞

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DOI：

10.3791/54375

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2016年11月11日

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Biochemistry II, Kanazawa Medical University, 3Center for Immunotherapy, Roswell Park Cancer Institute, 4DNAVEC Corporation, 5Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine, 6Department of Surgical Oncology, Roswell Park Cancer Institute

本文内容

摘要

本实验方案的目的是展示将黑色素瘤肿瘤浸润性淋巴细胞重编程为诱导性多能干细胞的实验方法。

摘要

过继性转移 离体 扩增的自体肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）可在部分转移性黑色素瘤患者中诱导持久且完全的应答。该疗法的主要障碍包括因端粒缩短导致的过继性T细胞活力下降，以及从患者体内获取的TILs数量有限。具有较长端粒的低分化T细胞是过继性T细胞治疗的理想T细胞亚群；然而，大量获得此类低分化T细胞仍存在困难。理论上，可通过使用诱导性多能干细胞（iPSCs）克服过继性T细胞治疗的这一局限，因为iPSCs具有自我更新能力、维持多能性、端粒较长，并可为免疫治疗提供无限来源的自体T细胞。本文介绍一种利用仙台病毒载体将重编程因子导入TILs以生成iPSCs的实验方案。该方案可获得完全重编程且无载体整合的克隆。这些源自TILs的iPSCs可能能够生成低分化的、患者特异性和肿瘤特异性的T细胞，用于过继性T细胞治疗。

引言

通过过表达一组特定的转录因子来生成诱导性多能干细胞（iPSCs）的细胞重编程技术，在细胞治疗领域具有广阔的应用前景1,2。这些iPSCs在转录和表观遗传特征方面与胚胎干细胞（ESCs）相似，同样具备自我更新能力和多能性3-5。过去十年中，重编程技术取得了显著进展，使我们甚至能够从终末分化的细胞（如T细胞）中生成人源iPSCs6-8。由T细胞衍生的iPSCs（TiPSCs）保留了原始T细胞T细胞受体（TCR）链基因相同的重排构型，从而可从TiPSCs再生出抗原特异性的T细胞9-11。

近80%的来自患者肿瘤的黑色素瘤浸润性淋巴细胞（TILs）能够特异性识别肿瘤相关抗原，并对原始癌细胞保持细胞毒性12值得注意的是，肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）上程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）的表达可识别出自体肿瘤反应性T细胞库，其中包括针对突变新抗原特异性的CD8⁺ T细胞+ 淋巴细胞13体外扩增的自体肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）经过过继性转移，联合预处理性淋巴清除方案及系统性给予白细胞介素-2（IL-2），可在部分患者中引起转移性黑色素瘤的显著消退14尽管在临床前模型和患者中取得了令人鼓舞的成果，输注T细胞的存活率低以及免疫抑制通路的存在似乎限制了过继性T细胞治疗的全部潜力。目前的临床方案需要大量扩增T细胞 离体 通过操控自体T细胞以获得大量细胞，这会导致终末分化的T细胞产生，此类细胞存活能力差、增殖能力降低，并且PD-1表达水平较高15.

理论上，可通过使用诱导多能干细胞（iPSCs）来克服过继性T细胞治疗的这一局限性，因为iPSCs可为免疫治疗提供无限来源的自体T细胞。我们近期报道了利用仙台病毒（SeV）介导的四种转录因子OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC的转导，将表达高水平PD-1的黑色素瘤肿瘤浸润T细胞（TILs）重编程为iPSCs16。与逆转录病毒载体需要整合至宿主染色体以表达重编程基因不同，SeV载体不整合入基因组，且最终会从细胞质中被清除。相较于慢病毒或逆转录病毒载体，SeV系统的重编程效率显著更高6-8。此外，SeV能够特异性地对人外周血单个核细胞（PBMCs）中的T细胞进行重编程，而使用慢病毒或逆转录病毒载体产生的部分iPSC克隆可能来源于非淋巴系细胞6-8。本文详细描述了人黑色素瘤TILs的分离与活化，以及利用SeV重编程系统生成TIL来源iPSCs的具体操作步骤。

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方案

注意：患者应签署知情同意书，以参与经机构审查委员会和人类多能干细胞委员会批准的研究。

1. 肿瘤浸润淋巴细胞的分离与培养

  1. 从病理科/组织采集中心获取无需用于组织病理学诊断的肿瘤组织材料。将 20–100 g 肿瘤标本置于含 30 ml 肿瘤收集液（表 1）的 50 ml 离心管中。
  2. 使用剪刀将肿瘤标本中坚实、致密的正常组织与脆弱和/或出血性坏死区域分离。去除坏死组织后，继续用剪刀尽可能将标本剪碎。
  3. 根据制造商说明书，使用组织解离仪及肿瘤解离试剂盒（人源）将剪碎的组织解离为单细胞悬液。将悬液通过置于 50 ml 离心管上的 70 µm 细胞筛过滤，并用 2 ml RPMI 1640 培养基洗涤筛网 2 次。
  4. 在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 10 ml T 细胞培养基（表 1）中。
  5. 在 50 ml 离心管中配制双层梯度溶液（如 Ficoll 梯度液），下层为 10 ml 100% 梯度液，中层为 30 ml 用无钙、无镁的杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS(-)）稀释的 75% 梯度液。
  6. 将细胞悬液（步骤 1.4 所得）小心铺加在梯度液（步骤 1.5 所得）上层。在 20 °C 下以 400 × g 离心 45 分钟。
  7. 收集位于 100% 与 75% 梯度液界面处富含肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的细胞层，转移至 50 ml 离心管中。加入 20–30 ml D-PBS(-) 稀释富含 TIL 的细胞层。
  8. 在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将富含 TIL 的细胞组分重悬于 10 ml T 细胞培养基中。
  9. 将该细胞组分（步骤 1.8 所得）与 2 ml T 细胞培养基及 6,000 IU/ml 重组人源（rh）IL-2 加入 6 孔板中，在 37 °C、5% CO2 条件下培养。
  10. 自培养开始后第 5 天更换一半培养基，此后每 2–3 天更换一次。
  11. 当细胞融合度达到 80–90% 时，轻柔吹打悬浮细胞，按 1:2 比例传代（无需胰酶消化），同时将培养孔数加倍。加入半量（1 ml）新鲜 T 细胞培养基及 6,000 IU/ml rhIL-2。

2. 丝裂霉素C处理的SNL饲养细胞板的制备

  1. 在经0.1%明胶包被的10 cm培养皿中，加入10 ml SNL饲养层细胞培养基（表1），培养SNL饲养层细胞至80–90%融合度（3–4 × 106 个细胞）。
  2. 向SNL饲养层细胞培养皿中直接加入310 µl 0.4 mg/ml丝裂霉素C溶液，在37 °C、5% CO2条件下孵育2小时15分钟。吸除培养基，用5 ml D-PBS(-)洗涤细胞两次。
  3. 加入0.5 ml 0.25%胰蛋白酶/1 mM EDTA，在室温下孵育1分钟以使细胞解离。加入4.5 ml SNL饲养层细胞培养基以中和并重悬细胞，形成单细胞悬液。
  4. 将细胞转移至15 ml离心管中，在200 × g下离心5分钟。吸除上清液，用10 ml SNL饲养层细胞培养基重悬细胞后，使用血细胞计数板进行细胞计数。
  5. 将1.5 × 106 个SNL饲养层细胞接种至每个10 cm培养皿中，在37 °C、5% CO2条件下培养。SNL饲养层细胞需在3天内使用。

3. 使用仙台病毒（SeV）载体生成诱导多能干细胞（iPSCs）

  1. 收获TILs（来自步骤1.11），并激活5 x 105 使用6孔板，在37 °C、5% CO₂条件下，将TIL细胞与包被的鼠抗人CD3抗体（1 µg/ml）和可溶性鼠抗人CD28抗体（5 µg/ml）共同孵育，并加入rhIL-2（6,000 IU/ml），总体积为2 ml T细胞培养基2 5天。
  2. 使用移液器将TILs（来自步骤3.1）收集至15 ml离心管中，并用血细胞计数板进行细胞计数。
  3. 重悬 1 x 105 使用板结合的小鼠抗人CD3（1 µg/ml）和可溶性小鼠抗人CD28（5 µg/ml）刺激TIL细胞，同时加入rhIL-2（60 IU/ml），置于500 µl重编程培养基中表124孔板中每孔在37 °C、5% CO₂条件下培养2 孵育24小时。准备3个孔用于SeV感染：OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC（1孔）；SeV感染（GFP：绿色荧光蛋白）（1孔）；细胞计数（1孔）。
  4. 24 小时后（从步骤 3.3 开始），使用血细胞计数板计数细胞数量，并确定每种不同（3-20）感染复数（MOI）所需的病毒体积。从 -80 °C 保存处取出一组仙台病毒载体管，迅速在水浴（37 °C）中解冻，然后置于冰上。
    病毒体积（µl）= MOI（CIU/细胞）× 细胞数量 / 病毒滴度（CIU/ml）× 10⁻³（µl/ml）
  5. 将分别携带 OCT3/4、SOX2、KLF4 和 c-MYC 的四种仙台病毒载体按计算体积加入，使病毒混合物在含活化TILs的培养基中的感染复数（MOI）达到10-20。
  6. 为确定转导效率，将计算好的SeV-GFP体积加入活化TILs的孔中。
  7. 将培养皿（来自步骤 3.5 和步骤 3.6）置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中2 孵育24小时。24小时后，在荧光显微镜下观察经SeV-GFP感染的TILs，评估感染效率。
  8. 将细胞（来自步骤 3.5）收集至 15 ml 离心管中，在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。
  9. 弃去上清液，将沉淀重悬于0.5 ml含基本成纤维细胞生长因子（bFGF，4 ng/ml）的灵长类胚胎干细胞培养基（Primate ES Cell Medium）中。
  10. 将细胞悬液转移至一个10 cm培养皿中，该培养皿内含有经丝裂霉素C处理的SNL饲养层细胞，并加入10 ml hESC培养基。每隔一天更换一次hESC培养基，直至细胞集落生长形成。
  11. 在第18至21天左右，在超净台中使用10 µl枪头在显微镜下移除集落周围的SNL饲养层细胞。
  12. 使用10 µl枪头刮取菌落，并用200 µl枪头将其转移至96孔组织培养板每孔中含100 µl iPSC培养基的孔内。上下吹打2-3次，使菌落分散为平均大小为50-100 µm的小团块。
  13. 将小细胞团块转移至6孔组织培养板中，每孔加入2 ml含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，4 ng/ml）的iPSC培养基，培养板中已预先铺有经丝裂霉素C处理的SNL饲养层细胞（来自步骤2）。每天更换iPSC培养基。
  14. 将iPSCs每5-6天传代至含新鲜丝裂霉素C处理的SNL饲养层细胞的6孔组织培养板中，每孔加入1 mg/ml IV型胶原酶。每个克隆每块板准备2个孔用于免疫染色。
  15. 通过多能性标志物（SSEA3、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81 和 OCT3/4）的免疫组织化学染色，确定每个克隆的完全重编程状态1.
    注意：为了进一步评估多能性潜能，需通过拟胚体形成与分化实验或畸胎瘤形成实验，确认完全重编程的iPSC细胞系能够分化为三个胚层。16.
  16. 通过细胞遗传学分析，确认完全重编程的iPSC细胞系具有正常的核型。
  17. 为进行畸胎瘤形成实验，注射未分化的TIL来源的iPSC（1 × 10⁶）6将100 µl含10%胎牛血清的DMEM中的细胞悬液注射至6-8周龄雌性NOD/SCID小鼠的皮下组织。用苏木精和伊红染色畸胎瘤切片。

4. 人诱导多能干细胞中 SSEA3、SSEA4、TRA1-60 和 TRA1-81 的免疫荧光染色

  1. 用 1 ml PBS 清洗诱导多能干细胞（iPSCs），加入 1 ml 4% 多聚甲醛溶液固定 10 分钟。去除 4% 多聚甲醛溶液，再用 1 ml PBS 清洗 iPSCs 3 次。
    注意：使用多聚甲醛时需谨慎，因其具有毒性。
  2. 用封闭缓冲液（表 1）对 iPSCs 进行 30 分钟的预处理。同时，将一抗（大鼠抗人 SSEA3、小鼠抗人 SSEA4、小鼠抗人 TRA1-60 和小鼠抗人 TRA1-81）用含 1.5% 山羊血清的 PBS-TritonX-100 溶液按 1:50 比例稀释（总体积：1 ml）。
  3. 去除封闭缓冲液（表 1），加入稀释后的一抗溶液，室温孵育 1 小时。同时，将二抗（抗小鼠 IgG 和 IgM 或抗大鼠 IgM）用 1.5% 山羊血清溶液按 1:50 比例稀释。
  4. 去除稀释后的一抗溶液，用 1 ml PBS 清洗 iPSCs 3 次，每次 5 分钟。加入稀释后的二抗溶液，在避光条件下室温孵育 45 分钟。
  5. 去除稀释后的二抗溶液，用 1 ml PBS 清洗 iPSCs 3 次，每次 5 分钟。使用免疫荧光显微镜观察 iPSCs。

5. iPSCs 中 Oct3/4 的免疫荧光染色

  1. 用 1 ml PBS 洗涤 iPSCs，并加入 1 ml 4% 多聚甲醛溶液固定 10 分钟。移除 4% 多聚甲醛溶液，用 PBS 洗涤 iPSCs 3 次。
  2. 加入透化缓冲液（表 1），室温孵育 10 分钟。移除透化缓冲液，加入封闭缓冲液（表 1）。
  3. 室温孵育 30 分钟。同时，用封闭缓冲液将一抗（小鼠抗人 Oct3/4）按 1:50 稀释。
  4. 加入稀释后的一抗溶液，4 °C 过夜孵育。
  5. 移除稀释后的一抗溶液，用 1 ml PBS 洗涤 iPSCs 3 次，每次 5 分钟。同时，用封闭缓冲液将二抗（山羊抗小鼠 IgG/IgM）按 1:100 稀释。
  6. 加入稀释后的二抗溶液，避光室温孵育 45 分钟。
  7. 移除稀释后的二抗溶液，用 1 ml PBS 洗涤 iPSCs 3 次，每次 5 分钟。在免疫荧光显微镜下观察 iPSCs。

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结果

图1展示了实验流程的总体概述，包括首先使用重组人IL-2（rhIL-2）扩增黑色素瘤肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），随后用抗CD3/CD28抗体激活TILs，并将OCT3/4、KLF4、SOX2和c-MYC基因导入TILs以诱导生成诱导多能干细胞（iPSCs）。通常情况下，TILs在含rhIL-2的培养体系中培养21至28天后开始形成细胞球。此时，TILs已准备好接受抗CD3/CD28抗体的激活。图2A显示了培养21天后、处于rhIL-2培养条件下、准备进行抗CD3/CD28激活的TILs。图2B显示了以20 MOI感染剂量转染仙台病毒（SeV）介导的GFP导入效果。图2C显示了在SNL饲养层细胞上、仙台病毒感染后18至21天出现的一个典型多能性克隆。图2D显示所获得的TIL来源的iPSCs具有正常的核型。图3展示了免疫荧光染色结果，用于确认iPSCs表达多能性标志物（SS...

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讨论

本文展示了一种通过SeV介导的四种转录因子OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC转导，将黑色素瘤肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）的实验方案。该方法利用SeV系统对T细胞进行重编程，具有非整合性技术的优势7。

先前的一项研究表明，SeV重编程系统不仅能够高效且可靠地重编程成纤维细胞，还能重编程外周血T细胞7,17。此外，我们最近发现，与外周血T细胞相比，分化程度更高且表达更高水平抑制性受体（如PD-1）的黑色素瘤肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）也可通过SeV载体实现重编程16。使用抗CD3/CD28刺激与SeV载体感染的时间点对于TILs的重编程至关重要。外周血T细胞在从供体采集后可立即使用抗CD3和IL-2进行刺激以启动重编程7，而TILs则需要在IL-2存在下培养3至4周后才能进行刺激。

尽管在使用IL-2培养3-4周并以抗CD3/CD28活化后，超过99%的TIL为CD8 T细胞16

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

感谢密歇根大学组织获取核心实验室的 Deborah Postiff 女士和 Jackline Barikdar 女士，以及多能干细胞核心实验室的 Cindy DeLong 博士在技术方面提供的帮助。本研究得到了密歇根大学启动资金，以及中央外科协会、美国外科医师学会、黑色素瘤研究联盟和美国国立卫生研究院国家癌症研究所（1K08CA197966-01）向 F. Ito 提供的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
gentle MACS C 管Miltenyi Biotec130-093-237
gentle MACS 组织解离仪Miltenyi Biotec130-093-235
人肿瘤组织解离试剂盒Miltenyi Biotec130-095-929
RPMI 1640Life technologies11875-093
Falcon 70 µm 细胞滤筛BD352350
BD Falcon 50 ml 圆锥形离心管BD352070
IMDMLife technologies12440053
人 AB 血清Life technologies34005100
L-谷氨酰胺（200 mM）Life technologies25030-081
2-巯基乙醇（1000×，55 mM）Life technologies21985-023
青霉素-链霉素 Life technologies15140-122
庆大霉素Life technologies15750-060
Ficoll-Paque PLUSGE17-1440-02
D-PBS (-)Life technologies14040-133
重组人（rh）IL-2Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.
纯化无添加剂/低内毒素小鼠抗人 CD3 抗体BD555329
纯化无添加剂/低内毒素小鼠抗人 CD28 抗体BD555725
X-VIVO 15Lonza04-418Q
FBSGibco26140-079
HEPESLife technologies15630-080
N-乙酰半胱氨酸Cumberland Pharmaceuticals Inc.NDC 66220-207-30
Falcon 组织培养板（6 孔）Corning353046
Falcon 组织培养板（24 孔）Corning353047
仙台病毒载体DNAVEC
SNL 饲养层细胞Cell Biolabs, IncCBA-316
丝裂霉素 CSIGMAM4287可溶于水（0.5 mg/ml）
明胶SIGMAG1890
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）Life technologiesPHG0264

参考文献

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