乳糖酶的酶活性对于二糖乳糖的分解代谢过程至关重要。本实验采用比色法测定膳食补充剂中乳糖酶的活性，为学生提供了一个理解乳糖酶功能及酶动力学的实验平台。
本文内容
摘要
摘要
理解酶的作用机制并将其与现实生活中的实例联系起来，对于生物科学和生物医学科学领域的众多本科专业而言至关重要。本实验方案简明易懂，专为药学专业一年级本科生设计，旨在为酶反应及酶分析的检测方法提供入门级介绍。实验选用乳糖酶作为研究对象，因其是与人类疾病及药学实践相关的 commercially available 酶的典型代表。乳糖酶从膳食补充剂片剂中提取，并通过比色法检测其活性，该方法基于乳糖酶对人工底物（邻硝基苯-beta-D-半乳糖吡喃苷，ONPG）的水解作用。乳糖酶催化ONPG水解后释放出邻硝基苯酚，通过测定420 nm处吸光度的变化来定量反应产物的生成量；同时，通过在冰上、室温及37 °C条件下分别进行反应，评估温度对酶促反应的影响。利用本方案还可进一步开展更深入的分析，例如在不同实验条件或使用不同试剂的情况下测定酶活性。
引言
酶是一类特殊的蛋白质，可在生物体内作为化学反应的生物催化剂1。酶的作用对生命至关重要，它提供能量、清除废物，并使生物体正常运作。因此，理解酶的特性对于全面认识生命过程具有重要意义。这一知识对于从医学科学到生物学等多个大学层次的学位课程都至关重要。尽管可以通过讲座和阅读材料向学生讲授从催化原理到酶活性理论模型的详细背景知识，但如先前研究所示，通过亲自动手实践观察酶的实际反应，是理解酶反应特性的最佳方式2。本实验方案提供了一种在实验室条件下测定酶活性的简单易行的实验范式，以乳糖酶为例，其活性与人类营养和健康密切相关。
糖苷水解酶乳糖酶（EC 3.2.1.23/26）是一种对哺乳动物具有核心营养重要性的酶3。乳糖酶的活性在进化过程中高度保守，源自β-半乳糖苷酶酶家族——该家族从Escherichia coli到Homo sapiens均存在（图1，PDB 1JZ8）4。乳糖酶在人类营养中的关键作用源于其能够将乳糖分解为其组成的单糖成分，这些单糖随后可在体内用于能量生成。乳糖酶催化二糖乳糖中糖苷键的水解，释放出半乳糖和葡萄糖（图2）5。这些单糖随后主要通过柠檬酸循环和氧化磷酸化途径用于生成三磷酸腺苷（ATP）via the citric acid cycle and oxidative phosphorylation6。在新生儿和婴儿发育期间，乳糖酶在人体消化系统中高度表达，可分解来自母乳的乳糖——乳糖是母乳中主要的碳水化合物成分，也是早期生命阶段的关键营养来源之一7。乳糖酶的医学重要性体现在先天性乳糖酶缺乏症（CLD）中，这是一种罕见的常染色体隐性遗传病，由编码乳糖酶的乳糖酶基因（LCT）发生突变所致8。患有CLD的新生儿乳糖酶活性极低，因此不能喂食母乳、其他任何类型的牛奶或含有乳糖的配方奶。
在儿童期之后，乳糖酶的表达通常会减少；然而，断奶后这种减少程度存在地理差异，全球约有35%的成年人仍持续表达该酶9。乳糖酶的持续表达被称为乳糖酶持久性，使个体能够继续消化来自多种来源的牛奶及乳制品。相反，乳糖酶表达的缺失可导致乳糖不耐受，也称为成人型低乳糖酶症（ATH），其原因是无法在肠道中分解乳糖。ATH的特点是在摄入含乳糖食物后，乳糖在结肠中积聚。在结肠内，积聚的乳糖被肠道微生物群发酵，释放出氢气、甲烷和二氧化碳等气体。在乳糖酶缺乏的个体中，这些气体的产生可引起腹部胀气、排气增多、疼痛、恶心以及肠鸣音（腹部咕噜声）7。消化道中乳糖水平升高还可能导致稀便。
LCT 基因表达的调控受到邻近 MCM6 基因内含子中多态性的调节。持续表达乳糖酶的个体携带的多态性可作为 LCT 基因表达的强远端增强子，从而补偿断奶期间 LCT 转录正常的下调过程，进而维持成年期乳糖酶的表达3。已有研究提出，在五千多年前中东地区牛和骆驼驯化之后，这些增强子多态性可能受到了正向选择9,10。
通过减少乳糖摄入（例如从饮食中去除乳制品）可以缓解乳糖不耐受（ATH）引起的症状。对于乳糖不耐受（ATH）的另一种方法，以及乳糖酶缺乏症（CLD）的首选方法，是使用乳糖酶补充剂，这类补充剂在药店广泛可得。这些补充剂提供来源于多种来源（包括酵母和细菌）的乳糖酶，以液体或片剂形式存在，可随餐服用或将酶添加至含乳糖的食物中。补充剂可将食物中部分乳糖水解为葡萄糖和半乳糖产物，从而促进其吸收，并防止未消化的乳糖底物在肠道内积聚。
基于乳糖酶补充剂作为膳食辅助剂的应用，我们开发了一项适用于生物医学科学或药学专业一年级学生的简单酶学实验。该实验利用市售的乳糖酶补充剂，采用邻硝基苯酚-β-D-半乳糖吡喃糖苷（ONPG），用于通过比色终点法测定乳糖酶对糖苷键的切割作用图3)11ONPG 是乳糖酶的一种人工底物，当该酶对其催化水解时，会生成 D-半乳糖和邻硝基苯酚。后者呈黄色，可在 420 nm 波长处吸收光。通过定量测定 ONPG 经乳糖酶作用后在 420 nm 处吸光度的变化，即可估算该酶的活性。本实验可演示酶的水解酶活性。通过增加重复实验次数并在不同条件下进行检测，还可进一步开展更深入的酶动力学分析，为与人类健康相关的酶实际作用提供有价值的实例。
方案
注意：以下方案设计为在专用教学实验室中进行，总时长约为两小时（包括完成课堂练习表）。实验步骤经过有意简化，省略了对酶动力学的更深入分析（本课程中该部分内容将通过模型数据另行开展）；然而——如讨论部分所述——本方案可作为更高级分析的模板，具体可根据时间、实验条件及学生掌握程度进行调整。
安全事项：本实验应遵循良好化学实验室规范（GCLP）进行——在实验室内始终佩戴个人防护装备，包括系好扣子的实验服、一次性手套和护目镜。
1. 提取酶
- 使用研钵和研杵将一片含有 200 mg 酶的乳糖酶片研磨成均匀的粉末。
- 将所得粉末放入一个标记为 "suspension" 的 15 mL 离心管中，并用 10 mL 的 100 mM 磷酸盐缓冲液（PBS）重新悬浮。
- 涡旋振荡 1 分钟，以最大程度地提取酶。
- 从悬浮液中转移 1 mL 至一个 1.5 mL 离心管中，在 10,000 × g 条件下离心 1 分钟，以沉淀固体颗粒。
- 将上清液中的 500 µL 转移至一个标记为 "Lactase Extract" 的洁净 1.5 mL 离心管中。
2. 观察比色反应
- 取 390 µL 100 mM PBS 加入已标记为 "Reaction A" 的 1.5 mL 离心管中。
- 加入 100 µL 5 mM ONPG 溶液，充分涡旋混匀。
注意：本实验使用邻硝基苯基-beta-D-半乳糖吡喃苷（ONPG）作为乳糖的替代物。由于 ONPG 是一种酚类化合物，操作时应谨慎。若皮肤接触 ONPG，应立即用清水冲洗。如有洒漏，应立即用纸巾擦拭，并按相应废弃物处理流程进行处置。 - 向 Reaction A 管中加入 10 µL 提取物，充分涡旋混匀。
- 观察反应混合物 5 分钟，记录溶液的颜色变化情况。
3. 测定酶活性
- 准备两个 1.5 mL 离心管：一个标记为 "Reaction B"，另一个标记为 "Control"。
- 向 Reaction B 管中加入 390 µL 的 100 mM PBS，向 Control 管中加入 400 µL 的 100 mM PBS，然后向每管中加入 100 µL 的 5 mM ONPG。
- 通过涡旋混合各管内容物。
- 向 Reaction B 管中加入 10 µL 乳糖酶提取物，涡旋混匀，并在室温下反应 1 分钟。
- 1 分钟后，向两管中各加入 500 µL 的 1 M 碳酸钠，通过提高 pH 抑制乳糖酶活性，从而终止反应。
- 从每管中转移 500 µL 液体至干净的分光光度计比色皿中，使用分光光度计在 420 nm 处测定吸光度。
- 记录 Reaction B 和 Control 样品的吸光度值，然后从 Reaction 值中减去 Control 值，以计算在活性酶存在下 ONPG 水解引起的吸光度变化。
4. 温度对酶活性的影响
- 按照第3节所述设置三个对照管和三个反应管，并标记这些管子 "4 °C", "室温"，以及 "37 °C".
- 加入酶提取物后，将一个试管置于冰上，一个置于室温，另一个置于37 °C（预热的水浴中）孵育。
- 让反应进行1分钟，然后向每根试管中加入500 µL 1 M碳酸钠以终止反应。
- 按照第3节所述，测定每支试管在420 nm处的吸光度。记录测定值，并从每个反应管的吸光度值中减去对照管的吸光度值。
结果
方案第2部分的代表性结果如图所示 图 4A对照反应在没有乳糖酶的情况下保持澄清，而含有乳糖酶片提取物的反应溶液则因ONPG被水解而释放出黄色产物。 正交-硝基苯酚 图 4B 显示使用分光光度计分析样本后，根据方案第4节以任意单位进行的定量结果。反应在冰上孵育时，邻硝基苯酚的生成量最低；而在特定温度下进行反应时，邻硝基苯酚的生成量最高 37 °C.
图 1： E. coli β-半乳糖苷酶。（A） 来自 Escherichia coli 的 β-半乳糖苷酶的晶体结构，显示了活性复合物的四聚体结构。（B）异乳糖（以红色显示）结合在 β-半乳糖苷酶的活性位点。图像由 PDB 1JZ84 生成。请点击此处查看此图的放大版本。
图 2： 乳糖酶的酶促作用。 乳糖酶催化乳糖水解生成β-D-半乳糖和β-D-葡萄糖。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3: 邻硝基苯酚的水解β-D-半乳吡喃糖苷 乳糖酶催化ONPG水解生成β-D-半乳糖和邻硝基苯酚（呈黄色），通过测定420 nm处的吸光度可估测乳糖酶活性。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 4： ONPG 水解反应。 ONPG 水解的代表性结果，显示对照管和反应管（A），以及来自本实验方案第 4 节的代表性数据，记录于课堂工作表中，显示在 420 nm 处的原始吸光度（任意单位），已扣除背景值，并在三种不同温度下进行测定（B）。请点击此处查看该图的放大版本。
| 实验条件 | 实验变量 |
| 温度 | 0 °C, 10 °C, 20 °C, 30 °C, 50 °C |
| 底物浓度 | 0 mM, 1 mM, 5 mM ,10 mM ONPG |
| 竞争性抑制 | 5 mM ONPG 加 0 mM, 1 mM, 5 mM 或 10 mM 乳糖 |
| 时间依赖性 | 0 s, 15 s, 30 s, 1 min, 5 min, 10 min, 20 min |
| 热变性 | 乳糖酶提取物在测定前于 100 °C 加热 10 分钟 |
表1：可能的扩展实验条件。建议进行的扩展实验，需设置三个重复，用于研究乳糖酶生物学的特定方面。
补充材料。 请点击此处下载该文件。
讨论
要掌握生物学、生物医学和药理学等多个领域的知识，必须深入了解酶、酶促反应及酶动力学的相关原理。上述实验方案以乳糖酶为例，展示与人类健康相关的酶促反应，帮助学习者掌握关键实验技能，为开展更复杂的基于实验室的研究奠定基础。
本方案经过精心设计，力求具备尽可能高的稳健性，使实验经验较少或没有湿实验实验室经验的学生 经验 在短时间内产生可解释的结果。在雷丁大学药学院2014/2015学年，共有144名学生，以每组3人分组，开展了该实验 "测量乳糖酶" 实验中，所有组均能从乳糖酶片提取物中检测到一定程度的酶活性。
本实验方案中有若干关键步骤。首先，初始提取步骤必须高效，以确保溶解出足够量的活性酶用于后续分析。根据我们的经验，大学一年级本科生只要严格按照所述方案操作即可实现这一目标；但在该步骤中仍需实验指导教师给予一定指导。尽管这一点看似不言自明，但本方案成功的关键因素在于能够准确量取液体体积、正确标记试管并严格遵循操作说明。虽然可假设多数学生已具备一定的操作熟练度，但通过仔细监督，并明确要求学生在不确定下一步操作时及时寻求帮助，最有可能确保实验成功。
学生评估可通过课堂作业（作为补充材料提供）进行，要求学生记录实验数据，对结果进行评述，并联系课堂讲授材料中的背景信息或阅读内容；也可通过课后更详细的评估方式进行，提供模型数据，以便尝试并评估动力学分析。
本文所述方案是在教学实验室条件下进行乳糖酶活性检测的一个简单示例，实验的复杂性有充分的拓展空间，可用于实现更高级的分析。特别是，本方案介绍了酶动力学的基本概念，但未包含对实验数据的动力学分析。因此，我们建议将本方案视为教学课程的初步模板，具体细节可根据参与实验的学生群体的具体目标和能力进行调整。拓展实验的示例包括：在不同温度下重复测量、使用不同底物浓度以进行统计学分析、对数据进行动力学分析（适用于生物化学专业学生）、起始使用多种不同的药片并让学生评估每种药片中酶活性的差异（加入对照药片，适用于法医学专业学生）、评估热变性的影响，或通过添加乳糖或乳糖酶抑制剂进行竞争性实验（表1）。此前已有文献发表过乳糖酶动力学分析的详细方案12。
本实验方案的一个重要优势在于，它将酶学和酶动力学的基础知识与医学中酶学的实际案例研究相结合。这使得该实验对医学、药学、生物医学科学及相关专业的学生具有特别重要的意义。尤为重要的是，乳糖分解既涉及一种严重的医学病症，又关联着更为普遍的饮食问题，这为教师向学生提出广泛的医学和伦理议题提供了契机。这些议题可包括围绕医学疾病的基因检测、基因治疗和遗传咨询的相关讨论，以及药物补充剂的使用与销售问题。本方案的一个主要局限性在于，由于提取所用的起始材料限制，无法对酶浓度进行精确定量。然而，可通过改用试剂级纯酶进行检测来弥补这一不足。这一点尤为重要，因为这样做还可实现对乳糖酶动力学参数的更精确计算。
总之，在教学实验室环境中检测乳糖酶活性，可为大学低年级学生提供一个扎实、引人入胜且富有意义的酶生物学入门实践。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
PAL 获得了英国帕金森病基金会研究奖学金（资助号 F1002）的资助。本研究工作得到了英国医学研究理事会（MRC）新研究者研究基金（MR/L010933/1）和 MRC 项目基金（MR/N026004/1）对 PAL 的资助，以及英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）学生奖学金（BB/M017222/1）对 JET 的资助。我们感谢雷丁大学 2014-15 学年药学硕士一年级学生参与本实验的首次实施，也感谢后续各届学生提供的反馈和建议。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乳糖酶片 | Lamberts | 8511-60 | |
| 磷酸盐缓冲液（粉末） | Sigma | P3813 | 用去离子水溶解至终浓度为 100 mM |
| ONPG | Sigma | N1127 | 用去离子水溶解至终浓度为 5 mM |
| 碳酸钠 | Sigma | 451614 | 用去离子水溶解至终浓度为 1 M |
| 去离子水 | NA | NA | |
| 研钵和研杵 | VWR | ||
| 分光光度计 | Jenway 6315 | ||
| 移液器 | Gilson | ||
| 15 mL 离心管 | VWR | ||
| 1.5 mL 离心管 | Eppendorf | ||
| 分光光度计比色皿 | Jenway | ||
| 涡旋振荡器 | Vortex genie 2 | ||
| 离心机 | Beckman | ||
| 冰桶 | VWR | ||
| 水浴锅 | Thermo-Scientific | ||
| 电子天平 | Thermo-Scientific |
参考文献
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