具有异质细胞群体的承重组织的构建与分析仍是一项挑战。本文中，我们描述了一种制备双层海藻酸盐水凝胶圆盘的方法，该圆盘可作为在同一结构内共培养不同细胞群体的平台。
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本文内容
摘要
摘要
许多承重组织具有结构和功能上明显不同的区域，通常伴随着不同表型的细胞以及差异性的机械感应特性。这些组织类型的构建与分析仍然是一个挑战。分层水凝胶结构为研究单个构建物内多个细胞群体之间的相互作用提供了机会。海藻酸盐水凝胶不仅具有良好的生物相容性，还可在实验后方便地分离细胞。本文描述了一种制备小型双层海藻酸盐水凝胶圆盘的方法。该方法在形成过程中可维持人源间充质干细胞的高细胞活力，且这些双层圆盘能够耐受无侧限循环压缩，而这种压缩常用于刺激正在进行软骨生成的hMSCs。这些分层结构有望进一步扩展以包含更多层次，也可用于在分层后初始阶段分离不同的细胞群体。这种双层海藻酸盐水凝胶培养平台可用于多种不同应用，包括承重组织细胞的构建与分析，以及其他细胞类型的共培养。
引言
诸如关节软骨或椎间盘等承受压缩负荷的组织，由多种异质性组织区域构成，这些区域对于组织的生物力学功能以及适当的力学信号转导均具有关键作用。不仅不同区域的细胞排列和功能各不相同，其细胞外基质（ECM）在组成和结构上也存在差异。例如，关节软骨可分为三个主要区域，各区域在细胞形态、力学功能及细胞外基质方面均有所不同。由于细胞外基质的差异，各区域承担不同的负荷功能：浅表层主要负责对抗拉伸负荷，而中层和深层则主要承担抗压缩功能1。类似地，在椎间盘中，凝胶状的髓核被层状的纤维环所包围，这两个不同区域内的细胞所经历的生物物理刺激类型也不同2。在这些类型的组织中，当组织承受并响应机械力时，各层中的细胞与其所在区域的细胞外基质相互作用。
在组织工程和再生医学领域，重现此类异质性组织结构仍面临挑战，且我们对其生物学意义的理解尚有限。目前亟需开发可用于分析分层组织以及在同一构建体中不同细胞群体共培养的培养平台。在关节软骨组织工程中，已利用分区软骨细胞沉积不同细胞外基质（ECM）的能力，构建出无支架的分层结构，以模拟该组织的不同层次3,4。然而，分层水凝胶结构为研究多种缺乏独立形成强健组织能力的细胞群体之间的相互作用提供了新机遇。例如，可在分层结构中对不同来源的间充质干细胞进行共培养。此类分层支架已联合软骨细胞与正在分化的间充质干细胞用于提升组织工程效果5。不仅可在相似的水凝胶层中对不同细胞群体进行共培养，还可将单....
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方案
1. 海藻酸盐圆盘形成的准备工作
- 在不含氯化钙和氯化镁的1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液中配制4%（w/v）海藻酸钠溶液，并置于37 °C水浴中。海藻酸钠溶液的浓度可以有所变化，但建议使用1–4%（w/v）的浓度范围。
- 将海藻酸钠溶液与温热的细胞培养基按1:1的比例混合例如，适用于目标细胞类型的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基）。此时，海藻酸盐浓度为原始浓度的一半 即，2%（w/v）。使用无菌的0.2 µm尼龙注射器滤器对海藻酸盐/培养基溶液进行除菌。
- 制备无菌水中的无菌二水合氯化钙溶液（102 mM），用量需足以浸没模具（约 200 - 300 ml）。
- 收集无菌的 "凝胶成型模具" （直径6 mm、高3 mm的圆柱形孔，位于3英寸×3英寸的铝板上，参见 图1）和端板（底部：一块 3 英寸 × 3 英寸铝板，顶部：一块 1.5 英寸 × 3 英寸铝板），并按如下步骤准备模具：
- 将厚滤纸（吸水滤纸）和细胞微孔滤膜（10 µm 孔径）裁剪成与上下端板相同尺寸，放入氯化钙溶液中浸泡至饱和，约 1 分钟。如需灭菌，可在使用前通过高压灭菌或紫外照射 30 分钟对厚滤纸和微孔滤膜进行消毒。
- 组装模具结构的下半部分（底部半模）。
- 将以下物品按顺序叠放，并使用无菌刮刀抹平：大端板（3 英寸 × 3 英....
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结果
图1展示了海藻酸盐水凝胶的形成与分层结构。如图2所示，制备完成的双层凝胶表现出细胞群体之间完全的初始分离。如图3所示，嵌入在这些水凝胶中并呈分层分布的人类间充质干细胞的细胞活力保持较高水平，且与整体水凝胶中的细胞活力相当。在退火处理后，将凝胶垂直切开以暴露其中心区域，随后根据试剂说明书，使用活细胞示踪染料CMFDA（绿色）对退火凝胶中的活细胞染色，同时使用碘化乙啶同二聚体-1对死细胞（红色）染色。利用荧光显微镜对切开的表面进行共聚焦Z轴扫描，成像深度约为凝胶内部100 µm处，并将这些图像投影为一幅二维图像。随后使用ImageJ软件中的颗粒分析功能对活细胞与死细胞进行定量分析。
我们希望验证这些无细胞的分层水凝胶是否能够承受类似于诱导软骨生成反应所需的周期性压缩。结果发现，这些水凝胶在培养七天后，再经受4小时、1 Hz、0–10%应变的无侧限周期性压缩.......
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讨论
本文介绍了一种制备分层海藻酸盐水凝胶圆盘的实验方案，用于研究多种细胞群体的共培养体系，例如生理条件下呈分层结构的组织。 例如， 软骨。分层结构（如所述的培养平台）可用于研究在相同培养环境或载荷条件下两种不同细胞群体之间的相互作用。
海藻酸盐是一种阴离子线性多糖，已被证实具有生物相容性，并已成功应用于软骨生物学和组织工程研究 12,14. 使用二价阳离子交联形成海藻酸盐水凝胶， 例如钙离子。这些交联可通过使用螯合剂（如柠檬酸钠或EDTA）去除阳离子而解除，该过程此前已被用于分离在凝胶中培养的软骨细胞 3,4,12同样，该原理也已成功应用于将海藻酸盐片层粘合为双层结构，甚至将海藻酸盐微球聚集成簇。 11,12,15该平台基于相同的原理，但用于制备小型圆盘状的层状水凝胶。该过程分为两个步骤：首先，将模具浸入富含钙离子的溶液中，形成海藻酸盐圆盘；随后将这些圆盘切成两半，并用钙螯合溶液处理，以局部释放交联海藻酸盐中的钙离子。将经处理的表面相互贴合，并再次将圆盘浸入富含钙离子的溶液中，从而重新.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国家科学基金会（CBET 0845754，AHH）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 海藻酸钠 | Sigma Aldrich | A1112 | 使用 DPBS (-/-) 配制的质量百分比（wt%）溶液 |
| 1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液 (-/-) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| 1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液 (+/+) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Gibco Life Technologies | 11965 | 示例：使用所需类型的培养基 |
| 注射器滤器（0.02 μm 尼龙） | FisherBrand | 0979C | |
| 二水合氯化钙 | Fisher Bioreagents | BP510 | 用无菌水配制溶液 |
| Criterion 印迹滤纸 | Biorad | 1704085 | 裁剪至与模具端板相同尺寸以形成模具 |
| 细胞微筛膜（孔径 10 μm） | Biodesign Inc of New York | N10R | 裁剪至与模具端板相同尺寸以形成模具 |
| 二水合柠檬酸钠 | FisherScience | S93364 | |
| 乙二胺四乙酸四钠盐二水合物（EDTA） | FisherBioreagent | BP121 | |
| 胎牛血清 | Gibco Life Technologies | 26140 | 用于示例中的间充质干细胞基础生长培养基 |
| 青霉素/链霉素（10,000 U/ml） | Gibco Life Technologies | 15140 | 用于示例中的间充质干细胞基础生长培养基 |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | Gibco Life Technologies | 25030081 | 用于示例中的间充质干细胞基础生长培养基 |
| 非必需氨基酸（100×） | Gibco Life Technologies | 11140050 | 用于示例中的间充质干细胞基础生长培养基 |
参考文献
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The Basic Science of Articular Cartilage. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Neidlinger-Wilke, C., et al. Mechanical loading of the intervertebral disc: from the macroscopic to the cellular level. Eur. Spine J.
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