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方法文章

利用寡核苷酸定向洗脱法从细胞中分离同源RNA-蛋白质复合物

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⸱

DOI：

10.3791/54391

⸱

2017年1月16日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary & Biomedical Sciences, University of Minnesota, 2Department of Veterinary Biosciences, Ohio State University, 3School of Biotechnology, Gautam Buddha University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了一种通过特异性寡核苷酸定向富集的方法，用于分离在真核细胞中形成的特定同源核糖核蛋白复合物（RNP）。我们通过分离与逆转录病毒5'非翻译区结合的同源RNP（其组分包含DHX9/RNA解旋酶A）来展示该方法的适用性。

摘要

核糖核蛋白颗粒通过不同的RNA结合蛋白组合，指导所有mRNA的生成及转录后调控。它们由位置依赖性的顺式作用RNA元件和特定组合的RNA结合蛋白构成。明确特定核糖核蛋白（RNP）的组成，对于深入理解基因调控机制至关重要。选择性分离某一特定RNP的过程，犹如大海捞针。本文展示了一种在非同步化转染细胞中，分离特定mRNA的5'非翻译区相关RNP的方法。研究表明，这种特异性RNP对某些病毒以及细胞应激反应基因的翻译过程具有必要性。

所展示的RNA-蛋白质共沉淀实验方案适用于通过蛋白质组学分析、免疫印迹或适当的生化鉴定实验对蛋白质组分进行下游分析。该实验方案表明，DHX9/RNA解旋酶A在相应的逆转录病毒RNA的5'末端富集，并为鉴定其与细胞应激相关的人源huR和junD相应mRNA的关联提供了初步信息。

引言

转录后基因表达受到精确调控，始于细胞核内的DNA转录过程。在RNA结合蛋白（RBPs）的调控下，mRNA的生成与代谢发生于高度动态的核糖核蛋白颗粒（RNPs）中，这些颗粒在RNA代谢过程中与前体mRNA底物发生动态的结合与解离1-3。RNP组分的动态变化影响mRNA的转录后命运，并在初级转录本的加工、核内运输与定位、作为翻译模板的活性，以及成熟mRNA的最终降解过程中提供质量保障。

许多蛋白质因其保守的氨基酸结构域而被归类为RNA结合蛋白（RBPs），这些结构域包括RNA识别基序（RRM）、双链RNA结合结构域（RBD），以及富含碱性残基的区域（例如精氨酸、赖氨酸和甘氨酸）4。通常采用免疫沉淀策略分离RBPs，并筛选其对应的RNA。某些RBPs共同调控功能相关的前体mRNA，这类调控单元被称为RNA调控子（RNA regulons）5-8。这些RBPs、其对应的mRNA，有时还包括非编码RNA，共同组成组成多样的催化性核糖核蛋白复合物（RNPs）；其独特性源于相关因子的不同组合，以及这些因子相互作用的时间顺序、空间定位和持续时间的差异9。

RNA 免疫沉淀（RIP）是一种强大的技术，可用于从细胞中分离核糖核蛋白复合物（RNP），并通过序列分析鉴定与其结合的转录本10-13。通过将 RIP 与微阵列分析14或高通量测序（RNAseq）15相结合，可实现从候选基因研究向全基因组筛选的过渡。同样，如果共沉淀的蛋白质丰度足够高且能与共沉淀的抗体有效分离，则可通过质谱法鉴定这些蛋白质16,17。本文介绍从培养的人源细胞中分离特定同源 RNA 的 RNP 组分的实验方法，尽管该方法也可调整用于植物细胞、真菌、病毒和细菌的可溶性裂解液。对所得材料的下游分析包括通过免疫印迹、质谱、生化酶学检测、逆转录定量 PCR（RT-qPCR）、微阵列和 RNAseq 进行候选分子的鉴定与验证，如图 1所示。

鉴于核糖核蛋白复合物（RNPs）在转录后水平调控基因表达中的核心作用，其组成RNA结合蛋白（RBPs）的表达改变或其对相应RNA的可及性变化可能对细胞产生有害影响，并与多种疾病相关，包括神经系统疾病18。DHX9/RNA解旋酶A（RHA）对于某些细胞来源和逆转录病毒来源的mRNA的翻译至关重要6。这些靶向RNA在其5'非翻译区（5' UTR）含有结构相似的顺式作用元件，被称为转录后调控元件（PCE）19。RHA-PCE活性对于多种逆转录病毒（如HIV-1）以及生长调控基因（如junD）的有效帽子依赖性翻译是必需的6,20,21。RHA由一个必需基因（dhx9）编码，对细胞增殖至关重要，其表达下调会导致细胞失去活力22。对RHA-PCE核糖核蛋白复合物的分子分析是理解RHA-PCE活性为何在调控细胞增殖中起关键作用的关键步骤。

在稳态条件下或细胞受到生理扰动时，对RHA-PCE核糖核蛋白（RNP）组分进行精确表征，需要选择性富集并捕获足量的RHA-PCE RNP，以满足后续分析的要求。在此实验中，逆转录病毒PCEgag RNA在其开放阅读框内被标记了6个拷贝的顺式作用RNA结合位点，该位点可特异性结合MS2衣壳蛋白（CP）。通过质粒转染，在细胞中外源共表达MS2衣壳蛋白与PCEgag RNA，以促进在生长中的细胞内形成RNP复合物。从细胞提取物中利用免疫沉淀法富集含有MS2衣壳蛋白及与其特异性结合的MS2标记PCEgag RNA的RNP，并将其捕获于磁珠上（图2a）。为了选择性捕获与PCE结合的RNP组分，将固定的RNP与一段寡核苷酸孵育，该寡核苷酸互补于PCE远端的RNA序列，从而形成RNA-DNA杂交体，作为RNase H酶切的底物。由于PCE位于5'非翻译区（5' UTR）的5'末端，该寡核苷酸互补于紧邻逆转录病毒翻译起始位点（gag起始密码子）的RNA序列。RNase H在gag起始密码子附近进行切割，从而将5' UTR复合物从固定的RNP上释放，并作为洗脱液收集。随后，通过RT-PCR检测样品以确认PCEgag的成功捕获，并通过SDS-PAGE和免疫印迹检测以确认目标蛋白MS2衣壳蛋白的捕获。最后，对与PCE相关联的RNA结合蛋白DHX9/RNA解旋酶A进行了验证。

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方案

缓冲液组成
洗涤缓冲液：
50 mM Tris-HCl, pH 7.4
150 mM NaCl
3 mM MgCl2
低盐缓冲液：
20 mM Tris-HCl, pH 7.5
10 mM NaCl
3 mM MgCl2
2 mM DTT
1x 蛋白酶抑制剂混合物（无EDTA）
RNase Out 5 µl/ml（RNase抑制剂）
胞质裂解缓冲液：
0.2 M 蔗糖
1.2% Triton X-100
NETN-150 洗涤缓冲液：
20 mM Tris-HCl, pH 7.4
150 mM NaCl
0.5% NP-40
3 mM MgCl2
10% 甘油
结合缓冲液：
10 mM HEPES pH 7.6 
40 mM KCl 
3 mM MgCl2
2 mM DTT
5% 甘油

表2：缓冲液组成。

1. 细胞与亲和基质的制备

  1. 将目标细胞系在10 cm培养皿中培养至亚汇合状态（80%）。使用10 cm培养皿用于FLAG标签NLS-MS2衣壳蛋白的独立免疫沉淀（IP）。使用抗FLAG表位标签的抗血清进行IP。当表达FLAG标签MS2衣壳蛋白质粒时，需在收获前24–48小时转染细胞20。
    注意：特定RNP可从核裂解物、胞质裂解物或生化分馏样品（如蔗糖梯度分馏组分）中富集。建议平行收集未转染细胞的裂解物，作为额外的阴性对照。
  2. 将60 µl蛋白G磁珠悬液（每IP）转移至1.7 ml微量离心管中。
  3. 将离心管置于微量离心管用磁力架上，使磁珠与储存液分离。
  4. 用微量移液器小心吸除储存液。
  5. 将离心管从磁力架上取下。
  6. 用600 µl（磁珠使用体积的10倍）1×洗涤缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4；3 mM MgCl2；150 mM NaCl）重悬磁珠，并在室温下翻转旋转孵育3分钟，以洗涤并平衡磁珠。
  7. 将离心管放回磁力架，吸除洗涤缓冲液。
  8. 向已平衡的蛋白G磁珠中加入10倍体积（600 µl）的1×洗涤缓冲液以及适量免疫沉淀用FLAG抗体（根据厂家推荐用于免疫沉淀的抗体用量），并在室温下翻转旋转孵育至少30分钟，使抗体与磁珠偶联。使用相应同型IgG作为合适的抗体阴性对照。
  9. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并吸除上清液。
  10. 将离心管从磁力架上取下，用10倍体积（600 µl）1×洗涤缓冲液重悬抗体偶联磁珠，并在室温下旋转3分钟。重复此步骤两次。
  11. 将离心管放回磁力架，吸除洗涤缓冲液。

2. 收获核糖核蛋白复合物（RNPs）

注意：在步骤 1.8 之后的孵育时间内制备核糖核蛋白复合物（RNPs）。

  1. 通过抽吸去除细胞培养基，并用 1–5 ml 冰冷的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。使用细胞刮刀刮下湿润的贴壁细胞，然后在 4 °C 下以 226 × g 离心 4 分钟收集细胞。
  2. 向细胞沉淀中加入 375 µl 冰冷的低盐缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.5；3 mM MgCl2；10 mM NaCl；2 mM DTT；1× 蛋白酶抑制剂混合物，无 EDTA；以及 5 µl/ml RNase 抑制剂），并将样品置于冰上孵育 5 分钟以使其充分膨胀。
    注意：根据细胞沉淀的大小调整低盐缓冲液的体积。对于来自 10 cm 培养皿的 1.2 × 106 个细胞，375 µl 缓冲液已足够。
  3. 为收集胞质细胞裂解液，加入 125 µl 冰冷的裂解缓冲液（0.2 M 蔗糖 / 1.2% Triton X-100），然后使用预先在冰桶中预冷的 Dounce 匀浆器进行 10 次上下抽吸。
    注意：若需收集全细胞提取物，建议使用标准 RIPA 裂解缓冲液以溶解核质/染色质。
  4. 在微量离心机中以最高速度（16,000 × g）离心 1 分钟，以去除上清液中的碎片和细胞核。
  5. 将上清液转移至预先置于冰上的新 1.7 ml 微量离心管中。采用实验室常用的标准方法（如 Bradford 法23）测定总蛋白浓度。保留至少 10% 的等分试样用于 Western blot 分析，作为输入对照。收获的细胞裂解液应立即用于免疫沉淀实验，或储存于 -80 °C 以备后续分析。
    注意：根据我们的经验，这些样品可在不损失完整性的前提下储存数月后仍可用于免疫沉淀分析。

3. 免疫沉淀

  1. 根据步骤2.5测定的蛋白浓度，加入适当体积的收获细胞裂解液至目标抗体偶联的磁珠中。用1×洗涤缓冲液将总体积调至600 µl，并在室温下翻转孵育90分钟。
    注意：该孵育时间足以有效分离高亲和力的RNP复合物，同时最大限度减少非特异性结合。对于其他RNP来源（如蔗糖梯度组分），需用1×洗涤缓冲液至少1:1稀释，然后与上述预先制备的磁珠-抗体复合物进行孵育。
  2. 孵育90分钟后，将IP管置于磁力架上收集磁珠，保留上清液作为流穿液。
    注意：第一次流穿液是评估IP效率的重要对照样本。通过免疫印迹分析可评估IP效率以及所研究相互作用的特异性。建议保留此上清液用于后续分析。
  3. 用10倍体积（600 µl）预冷的NETN-150洗涤缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4；150 mM NaCl；3 mM MgCl2；0.5% NP40；10%甘油），在室温下旋转孵育3分钟，洗涤与RNP结合的抗体偶联磁珠。重复此步骤3次。
    注意：该缓冲液不同于裂解缓冲液，可有效减少弱结合或非特异性结合。
  4. 最后一次洗涤后，将固定化的RNP复合物重悬于60 µl预冷的1×结合缓冲液（10 mM HEPES，pH 7.6；40 mM KCl；3 mM MgCl2；5%甘油；2 mM DTT）中，并保留10%的固定化复合物磁珠用于Western blot检测，20%用于RNA提取。

4. 洗脱

  1. 用预冷的1×结合缓冲液将剩余体积调至100 µl，并在70 °C下加热3分钟。
  2. 为分离特异性RNA-蛋白质复合物，加入一条约30个核苷酸长度的DNA寡核苷酸，该寡核苷酸与目标RNA的3'端序列边界互补，并在室温下轻轻振荡孵育30分钟（寡核苷酸终浓度为100 nM即可）。
    注意：该寡核苷酸与本方案示例中所用PCE构建体翻译起始位点邻近的核苷酸序列互为反义链。约40%的G-C含量可提供适当的序列互补性。设计反义寡核苷酸时，应确保其能高效地与目标RNA的最小互补区域发生杂交。
  3. 向管中加入5–10单位的RNase H，在室温下孵育1小时，以切割RNA:DNA杂合体中的RNA。将上清液转移至无菌的1.7 ml微量离心管中；此样品即为捕获的目标RNP复合物。
    注意：根据目标RNA的可及性，可能需要进行两轮或更多轮的RNase H处理，以增加后续分析所需的样品量。
  4. 取20%的洗脱液用于已知结合蛋白的Western blot检测，另取20%的洗脱液用于RNA提取，随后进行RT-qPCR分析。剩余的60%样品可用于质谱分析或鉴定蛋白质组分。
  5. 同时，取一部分保留的细胞裂解液进行RNA提取及RT-PCR分析。该检测可反映RNA在RNP复合物中的富集情况。
    注意：将分离得到的蛋白质样品用于对照Western blot，以确认RNase H切割有效，成功将RNP从免疫沉淀复合物中释放出来。

5. 蛋白质电泳与蛋白质印迹分析

  1. 根据标准实验室方案，将总样本的大约 10-20% 进行 SDS-PAGE 和免疫印迹分析。
    注意：此步骤用于在进行下游 RNA 分析之前验证免疫沉淀的效率和特异性。也可用于评估所分离的核糖核蛋白复合物的蛋白质组成。

6. 免疫沉淀RNA的收集

注意：RNA 提取可采用 Trizol 法或遵循所述方案进行。

  1. 将总样本的一半重悬于750 µl酸性硫氰酸胍试剂中，在室温下孵育5分钟，然后从捕获的PCE-RNP复合物中提取RNA。
  2. 向离心管中加入200 µl氯仿，剧烈振荡10秒，并在室温下孵育3分钟。
  3. 在4 °C条件下以16,000 × g离心15分钟后，收集水相至新的离心管中，并加入等体积的异丙醇。充分混匀后，在室温下孵育至少10分钟。向样品中加入1 µl甘油蓝，随后将样品置于-20 °C冰箱中保存，以实现高效沉淀或留待后续处理。
  4. 在4 °C条件下以16,000 × g离心10分钟。小心收集并弃去上清液，避免扰动RNA沉淀；建议使用P-200微量移液器吸头以方便此操作。
  5. 向每管中加入500 µl 75%乙醇，涡旋混匀后，在4 °C条件下以16,000 × g离心5分钟。参照步骤6.4小心收集并弃去上清液。将沉淀在空气中干燥2–3分钟，然后重悬于100 µl无RNase的水中。
    注意：请勿延长沉淀的干燥时间，以免影响重悬效果。
  6. 将100 µl RNA样品上样至RNA纯化柱中。按照制造商提供的操作流程进行处理。用30 µl无RNase的水洗脱RNA，并于-80 °C保存，可稳定保存长达3个月。
    注意：所获得的RNA适用于后续分析，包括逆转录实时PCR（qPCR）、微阵列和RNA测序。根据RNP的丰度以及目标RNP复合物的分离效率，同一裂解液可进行两轮或更多轮的免疫沉淀，以获得足量RNA用于后续分析。

7. RNA 逆转录及通过 PCR 扩增 cDNA

  1. 根据制造商说明书，使用高质量的逆转录酶（RT）和随机引物对分离的RNA进行逆转录反应。
  2. 为扩增目的RNA，需在RNase H切割序列内设计一条基因特异性的反义引物。反义寡核苷酸、随机引物或oligo-dT引物的使用量应相近（参见材料表）。
    注意：oligo-dT引物与多聚腺苷酸化mRNA可作为RT-PCR反应的阳性对照。
  3. 保留5%的逆转录反应产物（1 µl），用于与阴性对照裂解液免疫沉淀及阳性对照DNA样本平行进行的预实验qPCR，以确定阈值并绘制标准曲线。若预实验qPCR的CT值超出标准曲线范围，需将逆转录反应产物按连续1:5梯度稀释后重复步骤7.2。
    注意：有关RNA测序和质谱分析技术，请参见补充方法文件。请点击此处查看该补充方法文件。（右键点击可下载。）

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结果

先前的 RIP 结果鉴定出逆转录病毒 gag RNA 和部分与 DHX9/RHA 共沉淀的细胞 RNA，其中包括 HIV-16, junD6 以及huR（Fritz和Boris-Lawrie，未发表）。已证实逆转录病毒5' UTR可在细胞核内与DHX9/RHA共同沉淀，并可在细胞质中与多聚核糖体共同分离。其特征明确为 cis反式作用转录后调控元件（PCE）6为了分离在增殖细胞中形成的PCEgag RNA-RHA核糖核蛋白复合物（RNPs），我们在转染的HEK293细胞裂解液中进行了FLAG-MS2 RNP免疫沉淀。结果表明FLAG-MS2蛋白被有效沉淀。值得注意的是，DHX9/RHA存在于该RNP复合物中，而不存在于IgG同型对照或阴性对照HEK293细胞裂解液中图2A）。将含有核糖核蛋白复合物（RNP）的基质与一条互补的30-nt寡核苷酸孵育，随后对RNA-DNA杂交体进行RNase H切割。经RNase H消化后，收集洗脱液并进行Western blo...

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讨论

本文所述的核糖核蛋白（RNP）分离及对应RNA鉴定策略，是一种研究特定RNA-蛋白质相互作用以及发现细胞中共同调控特定RNP的候选蛋白质的选择性方法。

使用寡核苷酸引导的RNase H切割法分离核糖核蛋白复合物（RNP）的优势在于，能够捕获并特异性分析与目标顺式作用RNA元件下游结合的异质性RNP中的该顺式作用RNA元件。由于在未进行RNase H切割而分离得到的RNP中，目标RNA在特定RNP中的丰度仅占所收集RNP的一小部分，因此该实验流程的主要缺点是目标RNP的产量稀少。根据我们的经验，为在高灵敏度的免疫印迹和蛋白质组学分析中实现检测，此方法所需的起始材料通常需比传统的RNA免疫沉淀（IP）多5至10倍。将RNP固定在固相载体上的另一优势在于可方便地重复进行RNase H处理，并收集额外的洗脱液。根据我们的经验，建议进行2至4轮RNase H处理，以充分收集更多的洗脱产物。

在本实验方案中，关键的技术问题包括维持最佳温度以及确保试剂的无菌操作。所有试剂均应不含RNase和蛋白酶。如果无法检测到RNA-蛋白质相互作用，则应...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者们衷心感谢美国国立卫生研究院（NIH）P50GM103297、P30CA100730 和综合性癌症中心 P01CA16058 项目的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Dynabeads Protein AInvitrogen10002D
Dynabeads Protein GInvitrogen10004D
Anti-FLAG 抗体SigmaF3165
Anti-FLAG 抗体SigmaF7425
Anti-RHA 抗体VaxronPA-001
TRizol LS 试剂Life technology10296-028
RNase HAmbionAM2292
氯仿Fisher ScientificBP1145-1
异丙醇Fisher ScientificBP26184
RNeasy 纯化柱Qiagen74204
Omniscript 逆转录酶Qiagen205113
RNase OutInvitrogen10777-019
蛋白酶抑制剂混合物Roche5056489001
Triton X-100SigmaX100
NP-40Sigma98379
甘油Fisher Scientific17904
随机六聚体引物InvitrogenN8080127
Oligo-dT 引物InvitrogenAM5730G
PCR 引物IDT用于 PCR 扩增的基因特异性引物
用于 RNase H 介导切割的寡核苷酸IDT靶标 RNA 的反义引物
胰蛋白酶Gibco Life technology25300-054
DMEM 细胞培养基Gibco Life technology11965-092
胎牛血清Gibco Life technology10082-147
Tris 碱Fisher ScientificBP152-5
氯化钠Fisher ScientificS642-212
氯化镁Fisher ScientificBP214
DTTFisher ScientificR0862
蔗糖Fisher ScientificBP220-212
硝酸纤维素膜Bio-Rad1620112
磁力架用于 1.7 ml 微量离心管
超净工作台用于动物细胞培养
CO2 培养箱用于动物细胞培养
蛋白质凝胶电泳装置蛋白质样品分离
蛋白质转膜装置蛋白质样品转膜
即用型蛋白凝胶（4–15%）蛋白质样品分离
台式离心机沉淀样品
台式旋转混合仪样品端对端混合
涡旋振荡器混合样品

参考文献

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