从细胞使用寡核苷酸定向洗脱同源RNA-蛋白质复合物的隔离

摘要

本手稿描述了一种通过特异性寡核苷酸定向富集分离真核细胞中形成的选定同源 RNP 的方法。我们通过分离与由 DHX9/RNA 解旋酶 A 组成的逆转录病毒 5' 非翻译区结合的同源 RNP 来证明这种方法的适用性。

摘要

所证明的 RNA-蛋白质共沉淀方案适用于通过蛋白质组学分析、免疫印迹或合适的生化鉴定测定对蛋白质成分进行下游分析。该实验方案表明 DHX9/RNA 解旋酶 A 在同源逆转录病毒 RNA 的 5' 末端富集，并为鉴定其与细胞应激相关的 huR 和 junD 同源 mRNA 的关联提供了初步信息。

引言

转录后基因表达被精确调节，以在细胞核中的DNA的转录开始。通过RNA结合蛋白（限制性商业惯例）控制，基因生物合成及代谢发生在高度动态的核糖核蛋白颗粒（体RNP），其联营公司及RNA代谢^1-3的进展过程中与底物前体mRNA的解离。在RNP部件的动态变化影响的mRNA的转录后命运和初级成绩单，它们的核运输和定位，它们作为mRNA翻译模板活动，和成熟的mRNA的最终成交的处理过程中提供质量保证。

许多蛋白质由于其保守的氨基酸结构域，包括RNA识别基序（RRM）的指定为限制性商业惯例中，双链RNA结合结构域（RBD），和碱性残基的延伸（ 例如，精氨酸，赖氨酸，和甘氨酸） ^4。限制性商业惯例通常是通过免疫策略分离和筛选，以确定其同源的RNA。某些限制性商业惯例共调节预的mRNA即在功能上相关的，被指定为RNA的调节子^5-8。这些限制性商业惯例，其同源的mRNA，有时非编码RNA，形成催化的RNP在组成而改变;其独特之处是由于相关因素的各种组合，以及以时间顺序，位置，以及它们之间的相互作用⁹的持续时间。

RNA免疫沉淀（RIP）是一个强大的技术来隔离细胞的RNP，并确定使用序列分析^10-13相关的成绩单。从候选移动到全基因组筛选是通过RIP与微阵列分析¹⁴或高通量测序（RNA测序^）15组合是可行的。同样地，共沉淀的蛋白质可通过质谱法鉴定，如果它们足够丰富和可分离来自共沉淀的抗体^16，17。在这里，我们解决了分离从培养的人类细胞的特定的同源RNA的RNP部件的方法，虽然该方法是可改变的植物细胞，真菌，病毒和细菌的可溶性裂解物。该材料的下游分析包括候选识别和验证通过免疫印迹，质谱法，生化酶促测定法，RT-qPCR的，微阵列，和RNA测序，如总结于图1。

定的RNP在在转录后水平控制基因表达的基本作用，在组分限制性商业惯例或它们的可访问的表达的改变，以同源的RNA可能是有害的细胞，并与几种类型的疾病，包括神经系统疾病¹⁸相关联。 DHX9 / RNA解旋酶A（RHA）是必要的细胞和逆转录病毒起源⁶选定的mRNA的翻译。这些同源的RNA具有内结构相关的顺式作用元件的5'端非编码区，其被指定为转录后控制元件^{（PCE）19。} RHA-PCE活性是必需的许多逆转录病毒，包括HIV-1的有效帽依赖性翻译，和生长调节基因，包括JUND ^6,20,21。由必需基因（dhx9）编码，RHA是细胞增殖和其下调基本消除了细胞活力^22。 RHA-PCE的RNP的分子分析对于理解为什么RHA-PCE活性是必要的，以控制细胞增殖的重要步骤。

在稳定状态下或在细胞的生理扰动RHA-PCE RNP组分的确切性质要求RHA-PCE的RNP在足够丰富用于下游分析选择性富集和捕获。这里，逆转录病毒PCEgag的RNA具有标记为开放阅读框架内的MS2外壳蛋白（CP）的顺式作用的RNA结合位点的6份。该MS2外壳蛋白外切genously共表达质粒转染PCEgag的RNA以促进生长的细胞的RNP组件。含有同源MS2标记PCEgag RNA中的MS2外壳蛋白的RNP从细胞提取物中免疫沉淀和磁珠（ 图2a）捕获。选择性地捕获结合于四氯乙烯的RNP部件，固定RNP用至远端的PCE序列互补的寡核苷酸温育，形成的RNA-DNA杂交是对RNA酶H活性的底物。因为四氯乙烯是位于非翻译区的5'5的终端"，寡核苷酸是相邻的逆转录病毒翻译起始位点（的gag起始密码子）的RNA序列互补。邻近在gag起始密码子从固定化的RNP，将其收集作为洗脱剂释放的5'非编码区复杂RNA酶H裂解。此后，将样品通过RT-PCR评估，以证实PCEgag的，并通过SDS PAGE和免疫印迹捕获确认captu重新目标MS2外壳蛋白。四氯乙烯相关的RNA结合蛋白的验证，DHX9 / RNA解旋酶A，然后进行。

方案

缓冲成分

洗涤液:

的50mM的Tris-HCl，pH 7.4的

150毫米氯化钠

3毫米氯化镁

低盐缓冲液:

的20mM的Tris-HCl，pH值7.5

10毫米氯化钠

3毫米氯化镁

2毫摩尔DTT

1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒无EDTA

核糖核酸酶出5微升/毫升（RNA酶抑制剂）

细胞质裂解液:

0.2M的蔗糖

1.2％的Triton X-100

NETN-150洗涤液:

的20mM的Tris-HCl，pH 7.4的

150毫米氯化钠

0.5％的NP-40

3毫米氯化镁

10％甘油

结合缓冲液:

的10mM HEPES pH 7.6的

40毫米氯化钾

3毫米氯化镁

2毫摩尔DTT

5％甘油

表2:缓冲组合物。

1.细胞及亲和基质的制备

1. 培养的兴趣在10cm皿分汇合（80％）的细胞系。使用了FLAG标签NLS-MS2外壳蛋白的免疫沉淀无关（IP）10厘米板。执行使用抗血清的FLAG表位标签的IP。当表达FLAG标签的MS2外壳蛋白质粒转染细胞24-48小时提前收获^20。
   注:特定的RNP可以从核或细胞质中富集集成电路裂解物或生物化学分级分离制剂，如蔗糖梯度的级分。建议收获来自非转染细胞的裂解物在平行于提起附加阴性对照。
2. 每转的G蛋白磁珠浆IP 60微升至1.7 ml离心管。
3. 放置在磁铁架的管离心管到珠子从存储溶液中分离出来。
4. 用微量精心绘制，将其取出存储解决方案。
5. 从磁体机架上卸下管。
6. 洗涤和平衡1×洗涤缓冲液600微升珠（珠的使用量的10倍）（20毫摩尔Tris盐酸，pH为7.4; 3毫MgCl ₂的;以及150mM的氯化钠）和最终过端3旋转分钟，在室温。
7. 放置在磁铁架管和除去洗涤缓冲液。
8. 1×洗涤缓冲液和免疫沉淀FLAG抗体的10体积（600微升）添加到平衡的公关oteinģ磁珠（根据由生产用于免疫沉淀推荐的量）为至少30分钟至缀合的免疫沉淀抗体和旋转终端过端在室温下。使用相应的同种型IgG作为一个合适的抗体的阴性对照。
9. 放置在磁铁架的管收集珠子并除去上清液。
10. 从磁体机架上卸下管中，用1×洗涤缓冲液和旋转的10体积（600微升）洗抗体缀合的小珠在室温下3分钟。重复此步骤两次。
11. 放置在磁铁架管和除去洗涤缓冲液。

2.收获的RNP

注:在步骤1.8之后的孵化时间准备的RNP。

1. 通过抽吸除去从细胞培养基中并用1-5毫升冰冷的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗细胞两次。使用细胞刮赶走潮湿，在4℃收集前贴壁细胞通过在226×g离心4分钟离心。
2. 添加375微升冰冷却的，低盐缓冲液（20mM的Tris-HCl，pH值7.5; 3毫MgCl ₂的10毫摩尔NaCl; 2mM的DTT; 1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒，无EDTA;和5μl/ ml的RNA酶抑制剂）的细胞沉淀，并允许通过将它放置在冰上5分钟肿胀。
   注:裁缝根据细胞沉淀的大小低盐缓冲液体积。对于从10cm平板1.2×10 ^6个细胞，375微升缓冲液中是足够的。
3. 收集胞质细胞裂解物中，添加125微升冰冷的裂解缓冲液（0.2M蔗糖/ 1.2％的Triton X-100），然后执行10笔用Dounce匀浆，这是在一个冰桶预冷。
   注意:为了收集总细胞提取物，被推荐用于增溶的核质/染色质标准的RIPA裂解缓冲液。
4. 自旋以最快的速度（16,000 XG）1分钟微量;这将清除碎片的上清液第二核。
5. 将上清转移到新的1.7 ml离心管，其已经在冰上。确定由一个标准，实验室优选的方法，如Bradford测定²³的总蛋白浓度。保留至少10％的等分试样用于蛋白质印迹分析，以用作一个输入控制。立即使用收获的细胞裂解物进行免疫沉淀或储存在-80℃以供将来分析。
   注:根据我们的经验，这些样品可以存储和几个月后用于免疫分析没有诚信的一种妥协。

3.免疫沉淀

1. 添加收获细胞裂解物的所需体积，基于在步骤2.5中确定的蛋白浓度，对目标抗体缀合的小珠。用1×洗涤缓冲液，使总体积达600微升和旋转终端过端在室温下90分钟。
   注:该时间周期足以产生高亲和性的RNP复合体的健壮隔离，同时最小化非特异性结合。稀替代RNP来源，如蔗糖梯度的级分，至少1:1与1×洗涤缓冲液，然后用预先制备的珠 - 抗体复合孵育它们，如上所述。
2. 90分钟温育后，放置在磁铁架知识产权管收集珠子。保留上清液作为流通。
   注:此第一流通是衡量IP效率的重要对照样品。免疫印迹测定法将提供的IP效率的指示，以及所研究的相互作用的特异性。它建议保留该上清液用于下游分析。
3. 150毫摩尔NaCl; 3毫MgCl ₂的0.5％NP40;用冰冷的NETN-150洗涤缓冲液（20mM的Tris-HCl，pH值7.4的10体积（600微升）洗RNP结合，抗体缀合的小珠和10％甘油）根据在室温下3分钟的旋转。重复步骤3次。
   注:此缓冲区从裂解缓冲液的不同，有效地降低了弱的或非特异性的关联。
4. 以下最后的洗涤，悬浮固定化的RNP复合物在60微升冰冷的1X结合缓冲液（10mM HEPES，pH值7.6; 40毫氯化钾; 3毫米氯化镁_2; 5％甘油;和2mM DTT）中，并储备10％对于Western印迹和RNA分离20％的固定的复合物珠粒。

4.洗脱

1. 调整剩余体积至100μl用冰冷的1X结合缓冲液，并在70℃下加热管3分钟。
2. 以分离同源RNA-蛋白质复合物，添加〜30-nt的DNA寡核苷酸是与感兴趣的RNA的3'序列的边界互补并在室温下在温和温育30分钟摇动（100nM的寡核苷酸是足够了）。
   注:寡核苷酸是反义邻近于翻译的核苷酸残基开始现场用作为例四氯乙烯构建体E在此协议。适当的序列互补性是由〜40％的GC含量提供。设计用于高效杂交与靶RNA的最小互补区域的反义寡核苷酸。
3. 添加5-10单位RNA酶H的该管，在室温下孵育1小时以裂解RNA的RNA:DNA杂交体。将上清转移到无菌1.7毫升离心管中;该样品中含有的利益所捕获的RNP复合物。
   注:根据同源RNA的可获得性，两个或更多个轮RNA酶H处理可能是有用的，以增加样品丰度为下游分析。
4. 用洗脱液为20％的Western印迹已知相关蛋白并随后通过RT qPCR的洗脱液用于RNA分离的20％。剩下的60％可以用于质谱或鉴定蛋白质组分。
5. 平行地，若使保留细胞裂解物对RNA分离和RT-PCR分析的等分试样。这ASSEssment提供RNP园区内的RNA富集的迹象。
   注:使用在控制免疫印迹分离蛋白制剂，以确定该核糖核酸酶H裂解能有效地从immunuoprecipitated复杂释放RNP。

5.蛋白电泳和Western blot分析

1. 根据标准的实验室协议受试者的总样品进行SDS-PAGE和免疫印迹分析的约10-20％。
   注意:此步骤用于之前下游RNA分析验证的IP效率和特异性。它也可以用来评估所述分离的RNP复合体的蛋白质组合物。

6.收集免疫沉淀的RNA

注:RNA分离可通过Trizol法或以下所描述的协议来实现。

1. 在750微升异硫氰酸胍试剂样品总数的一半悬浮和孵化在房T5分钟提取从捕获的PCE-RNP复合物的RNA之前emperature。
2. 加入200μl的氯仿至管，剧烈振荡10秒，并在室温下孵育3分钟。
3. 在4℃下16000×g离心15分钟离心后，收集水相到重新管和添加异丙醇等体积。拌匀并在室温下孵育至少10分钟。加入1μl乙二醇蓝色的样品，并在冷冻高效沉淀或加工-20℃存放在未来某一日期。
4. 离心反应管以16,000 xg离心在4℃下10分钟。小心收集并弃去上清液，以便不干扰RNA沉淀;建议使用的p-200微管尖端，以促进该过程。
5. 16,000 xg离心加入500μl75％乙醇到每个管中，涡旋，离心管5分钟，在4℃下。认真收集并弃去上清液按步骤6.4。空气-干燥在100μl的无RNase水2-3分钟，重悬沉淀。
   注意:不要延长时间沉淀晾晒，以避免与悬浮的一个问题。
6. 应用100微升RNA样品的RNA清理柱。使用制造商的协议处理。洗脱在无RNase水和存储的30微升的RNA在-80℃长达3个月。
   注意:此分离的RNA适合于通过RT-实时PCR（qPCR的），微阵列，和RNA测序下游分析。取决于丰RNP和与感兴趣的RNP分离效率，相同的裂解物可以经受两个或更多轮的IP，以产生适用于下游分析足够的RNA。

7. RNA反转录和扩增的cDNA通过PCR

1. 若使分离的RNA通过用高质量的逆转录酶（RT）的随机引物反转录，根据厂家专业cturer的说明。
2. 为了扩增目的RNA，设计核糖核酸酶H裂解序列内的特定基因的反义引物。使用反义寡核苷酸，随机引物或寡-dT引物相似量的（见材料表 ）。
   注:寡聚-dT引物和聚腺苷酸化的mRNA提供用于RT-PCR反应阳性对照反应。
3. 储备RT反应（1微升）用于制备的qPCR串联做阴性对照溶胞产物的IP和阳性对照DNA样本来定义截止和产生的标准曲线的5％。如果制备的qPCR的CT值是超出标准曲线的范围内，稀释在1个连续的RT反应:5稀释液，并重复步骤7.2。
   注:对于RNA测序和质谱技术，请参阅补充方法文件。 请点击此处ŤØ查看本补充方法文件。 （右键点击下载）。

结果

RIP前鉴定结果逆转录病毒插科打诨RNA和选择的共沉淀的细胞的RNA与DHX9 / RHA，包括HIV-1 ^6，勇得⁶户珥（弗里茨和鲍里斯-劳列，未发表）。反转录病毒的5'非编码区已被证明与DHX9 / RHA在细胞核共沉淀并在多核糖体的细胞质共同隔离。它是唯一定义为顺式短效后转录控制元件^{（PCE）6。}为了分离形成增殖细胞PCEgag的RNA核糖核蛋白RHA复合物（体RNP），我们在转染的HEK293细胞裂解液进行FLAG-MS2 RNP免疫沉淀。结果显示FLAG-MS2蛋白的高效沉淀。值得注意的是，DHX9 / RHA这篇RNP复合内而不是IgG同种型控制内识别，也没有负对照的HEK293细胞裂解物中（ 图2A）。含有的RNP的基质与互补的30温育-nt寡核苷酸，然后进行所述RNA-DNA杂交体的RNA酶H裂解。在核糖核酸酶H消化，洗脱液用免疫印迹法进行分析。在RNA-DNA杂交位置PCEgag RNA的证明RNA酶H裂解释放特异性结合于5'非编码区的...

讨论

这里描述的RNP隔离和同源RNA识别策略是调查一个特定的RNA蛋白质相互作用，发现候选蛋白共同调节细胞的特异性RNP的选择性手段。

使用寡核苷酸定向RNA酶H切割以分离的RNP的优点是捕捉和具体分析过下游结合到感兴趣的顺式作用RNA元件异质的RNP的RNP顺式作用RNA元件的能力。因为在给定的RNP同源RNA的丰度是无RNA酶H裂解分离所收集的RNP的一小部分，该工作流的主要缺点是同源的RNP的稀缺。根据我们的经验，这种限制必要5比常规RNA IP 10倍的原料检测敏感免疫学和蛋白质组学分析。通过固定的RNP提供的另一优点是重复RNA酶H特雷的便利atment和收集更多洗脱液。根据我们的经验，2-4轮核糖核酸酶H治疗是明智的，以收集更多洗脱液。

在这个协议中，关键技术问题是保持最佳温度，并确保试剂的无菌处理。所有试剂应RNA酶和免费蛋白酶。 RNA样品的完整性考虑，如果一个RNA蛋白质相互作用，未检出一个潜在的缺陷。

这种技术需要细胞的有效的裂解来访问的RNP在合适的量进...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dynabeads 蛋白 A	Invitrogen	10002D
Dynabeads 蛋白 G	Invitrogen	10004D
抗 FLAG 抗体	Sigma	F3165
抗 FLAG 抗体	Sigma	F7425
抗 RHA 抗体	Vaxron	PA-001
TRizol LS 试剂	Life 技术	10296-028
RNase H	Ambion	AM2292
氯仿	Fisher Scientific	BP1145-1
异丙醇	Fisher Scientific	BP26184
RNaeasy 纯化柱	Qiagen	74204
Omniscript 逆转录酶	Qiagen	205113
RNase Out	Invitrogen	10777-019
蛋白酶抑制剂混合物	罗氏	5056489001
Triton X-100	Sigma	X100
NP-40	Sigma	98379
甘油	Fisher Scientific	17904
随机六聚体引物	Invitrogen	N8080127
Oligo-dT 引物	Invitrogen
PCR 引物IDT			基因特异性引物 PCR 扩增
RNase H 介导的切割寡核苷酸	IDT		靶 RNA 的反义引物
胰蛋白酶	Gibco Life 技术	25300-054
DMEM 组织培养基	Gibco Life 技术	11965-092
胎牛血清	Gibco Life 技术	10082-147
Tris 碱基	Fisher Scientific	BP152-5
氯化钠	Fisher Scientific	S642-212
氯化镁	Fisher Scientific	BP214
DTT	Fisher Scientific	R0862
蔗糖	Fisher Scientific	BP220-212
硝酸纤维素膜	Bio-Rad	1620112
磁力架			1.7 ml 微量离心管
层流罩			用于动物组织培养
CO2 培养箱			用于动物组织培养
蛋白质凝胶装置			蛋白质样品分离
蛋白质转移装置			样品转移
即用型蛋白质凝胶 （4-15%）			蛋白质样品分离
台式离心机			样品沉淀
台式旋转器			样品端到端混合
涡旋			混合样品