质谱流式细胞术分析的样本制备

摘要

本文介绍了用于质谱流式细胞术分析的样本采集与处理方法。

摘要

质谱流式细胞术利用与重金属标签偶联的抗体，这一方法显著增加了可检测的参数数量，极大地拓展了深度分析的可能性，远超传统基于荧光的流式细胞术所能达到的范围。与任何新技术一样，存在若干关键步骤有助于确保可靠地生成高质量数据。本文提供了一项经过优化的实验方案，整合了多种用于质谱流式细胞分析样本处理的技术。文中所述方法将帮助使用者避免常见误区，通过减少实验变异性获得稳定可靠的结果，从而防止数据失真。为指导实验设计，本文还阐述了方案中可选或替代步骤背后的科学依据，以及这些步骤在揭示所研究生物系统新发现方面的有效性。最后，提供了代表性数据以展示采用本方案技术所能获得的预期结果。

引言

细胞计量技术能够在大量细胞群体中对单个细胞水平的多种抗体靶标进行同时检测。在传统的基于荧光的流式细胞术中，可定量的参数数量受限于多种荧光染料发射光谱之间的光谱重叠，随着检测参数数量的增加，需要进行日益复杂的补偿计算。质量细胞术克服了这些限制，该技术通过飞行时间（TOF）质谱法检测和定量重金属标记的抗体，从而显著增加可同时采集的参数数量，并为每个单细胞提供高维度的蛋白质丰度谱型。

了解质谱流式细胞仪的基本工作原理对用户很有帮助，且可能对故障排查至关重要。有关质谱流式细胞仪调谐和运行的更详尽描述，请参见相关论文¹。简而言之，细胞样本使用一组金属标记的抗体进行标记，这些抗体靶向细胞表面标志物、胞质蛋白、核蛋白、染色质结合蛋白或其他感兴趣的表位（图1i）。标记后的细胞通过手动进样逐个加载到仪器上，或使用自动进样器从96孔板中取样加载。加载的细胞通过雾化器注入，产生包裹细胞的液滴喷雾（图1ii）。该喷雾被定位，使细胞被氩等离子体炬电离。此电离过程生成由每个细胞所有组成原子构成的粒子云（图1iii）。当该粒子云向检测器移动时，四极杆质谱过滤器将低原子质量的原子与高质量离子分离。剩余的高质量离子继续进入检测器，在此每种同位素的丰度被定量（图1iv）。检测器收集的原始数据由质谱流式细胞仪软件分析，以识别细胞事件....

方案

1. 细胞收获

1. 从原代组织中收获细胞
   注意：此处所述从原代组织中收获细胞的方法专门适用于小鼠乳腺肿瘤组织，可能不直接适用于其他来源的原代组织。
   1. 按每克待处理组织在10 mL DMEM/F12培养基中溶解5 mg透明质酸酶和30 mg胶原酶，配制消化缓冲液。对消化缓冲液进行过滤除菌。
   2. 从小鼠中分离原代乳腺肿瘤组织，并记录肿瘤重量。
   3. 使用#10手术刀将组织切碎，持续至少5分钟。
   4. 将切碎的组织加入适量体积的消化缓冲液中（每克组织使用10 mL缓冲液）。
   5. 在37 °C下，以100 rpm振荡切碎的组织1–3小时。
   6. 通过0.4 μm滤膜将细胞过滤至50 mL离心管中，获得单细胞悬液。
   7. 在4 °C下以300 × g离心10分钟。倾去或小心吸除上清液，避免扰动沉淀。
   8. 将沉淀重悬于4 mL DMEM/F12培养基中，并转移至5 mL圆底试管中。
2. 从组织培养物中收获细胞
   1. 在室温下用不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤贴壁细胞的培养板或培养瓶。
      注意：此处所述的细胞收获技术专门适用于人胚胎干细胞（hESC）贴壁培养细胞。然而，后续所述的实验流程广泛适用于其他培养的细胞系、非贴壁细胞系....

结果

本方案可广泛适用于多种培养细胞和原代细胞样本，仅需少量修改。根据实验需求，可在无需某些步骤（如条形码标记或细胞表面染色）时，以模块化方式执行该方案。若完整使用，本方案可制备用于多重质谱流式分析的样本，标记内容包括死细胞排除、S期细胞群鉴定，并可对多达38种抗体靶标进行定量检测。

本方案所述方法产生的预期结果（图2）如图3所示。数据采集后，可在质谱流式软件中根据校准微球的信号强度对信号强度进行标准化处理。标准化后，可使用任何具备流式细胞数据分析能力的软件手动进行初步数据处理，包括去除校准微球、单细胞设门以及去除死细胞。去除校准微球可通过在Ir191+ Ce140-细胞群上设门（图3A）手动完成，或使用基于MATLAB的算法²⁰实现。通过在Ir193与事件长度（Event Length）的双轴图上设门（

讨论

本文所述方案已成功用于多种培养细胞系（H1 和 H9 人胚胎干细胞、小鼠胚胎干细胞、MCF7、HEK 293、KBM5、HMEC、MCF10a）以及原代组织样本（小鼠骨髓、小鼠胚胎肝脏、小鼠成年肝脏、小鼠肿瘤）的处理。无论样本来源如何，任何能够解离为单细胞并同时保持细胞状态的组织均适用于质谱流式细胞术分析，但可能需要对方案进行一定优化。需要注意的是，特定的解离、固定和通透处理可能会影响某些表位，因此这些方法可能需要根据样本进行特异性优化。如果某个抗体信号较弱，可通过在活细胞上进行细胞表面标记、更换通透方法或缩短固定时间来改善信号强度。

在实验设计允许的情况下，在样本处理流程中引入条形码技术可确保样本在细胞浓度和抗体浓度水平上的一致性。如果不使用条形码，即使在样本处理过程中已尽可能严格控制条件，仍可能在不同样本之间引入抗体浓度和细胞浓度的微小差异。此外，由于不同样本中特定表位阳性细胞的比例可能存在差异，即使总体抗体浓度保持一致，有效抗体与表位的比例在不同样本间也可能必然不同，从而可能导致抗体染色结果的不一致。这些差异在单通道检测时通常较小，但在进行高参数实验时可能被显著放大，若在数据.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
mTeSR1 培养基试剂盒	Stem Cell technologies	05850	使用前于室温下回温
DMEM F-12	ThermoFisher	11330-032	使用前在 37 °C 下预热
Accutase	Stem Cell technologies	07920	使用前在 37 °C 下预热
牛血清白蛋白	Equitech	BAH62
磷酸盐缓冲液	Hyclone	SH30256.01
皂苷	Sigma-Aldrich	47036
Cell ID Pt194	Fluidigm		提供浓度为 1 mM
Cell ID Pt195	Fluidigm		提供浓度为 1 mM
Cell ID Pt196	Fluidigm		提供浓度为 1 mM
顺铂	Enzo Life Sciences	ALX-400-040-M250	可溶于 DMSO 至 25 mg/mL
Cell-ID 20-plex Pd 条形码试剂盒	Fluidigm	201060
5-碘-2'-脱氧尿苷	Sigma-Aldrich	I7125	可溶于 0.2 N NaOH 至 74 mg/mL
铑 103 插入剂	Fluidigm	201103A
甲醇	Fisher	BP1105-4	使用前于 -20 °C 冷却
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002
5 mL 圆底管	Falcon	352058
5 mL 35 μm 滤帽管	Falcon	352235
EQ 四元素校准微珠	Fluidigm	201078
透明质酸酶 I-S 型	Sigma-Aldrich	H3506
产气荚膜梭菌胶原酶	Sigma-Aldrich	C9891
一次性手术刀 #10	Sigma-Aldrich	Z69239