CUBIC协议可视化在全山皮肤配方单细胞分辨率蛋白表达

Summary

这份报告描述了三次协议，以澄清全层小鼠皮肤活检，并在3D单细胞分辨率的可视化表达方式，增殖细胞，皮脂腺细胞和。这种方法使皮肤的解剖学和病理学的准确评估，并在转基因小鼠品系的表皮异常表型。

Abstract

皮肤是我们的生存至关重要。外表皮层由滤泡表皮，这是覆盖最我们的身体，和表皮附属物的复层鳞状上皮，例如毛囊和汗腺。表皮经历整个生命，并且响应于损伤的再生。这是通过K14表达被紧紧由表皮内和表皮和真皮之间活动多调节机制调节基底表皮干细胞/祖细胞群启用。本文介绍了一种简单的方法来阐明全层小鼠皮肤活检，和可视化K14蛋白的表达模​​式，Ki67的标记的增殖细胞，尼罗红标记的皮脂腺细胞，并在3D单细胞分辨率DAPI细胞核标记。这种方法可以准确的评估和皮肤的解剖学和病理学的量化，并在转基因小鼠品系的表皮异常表型。立方协议是日E，可到目前为止，调查在单细胞分辨率的全层皮肤活检的分子和细胞相互作用最好的方法。

Introduction

皮肤是我们的生存至关重要。它由三个主要层的外表皮，真皮​​和皮下组织。表皮是一个高度可再生的组织。这是一个鳞状复层上皮，主要由角质形成细胞。角质形成细胞诞生于基底层，并通过基底层向上移动，而差异化，最终他们在他们出生后一个月外角化层脱落。表皮开发了一些附加物，包括毛囊和皮脂腺。毛囊也再生以循环的方式在整个生命^1。表皮的再生能力是由位于滤泡表皮和毛囊²基底层干细胞和祖细胞的存在使能。

许多信号传导途径已牵涉在表皮发育和再生。其中的一些发生内仅表皮，如Hedgehog通路。其他信号事件采取真皮和表皮³之间。例如，从真皮的Wnt信号被认为是对毛囊发育重要的，它们是由毛乳头在生长期激活的发作分泌毛囊膨出干/祖细胞的增殖和毛囊生长^4。要明白，控制表皮发育和再生，以便更好地理解它们是如何可能在再生皮肤疾病被扰动如皮肤癌的细胞和分子机制是很重要的。

本文介绍了一个C李尔，U nobstructed 乙雨我 maging鸡尾酒和C omputational分析（立方）协议^5-7澄清整装皮肤的准备，并在激光共聚焦显微镜单细胞分辨率的3维可视化表达模式。三次方法涉及皮肤浸泡组织中的两个基于氨基醇化学鸡尾酒。这些解决方案调整皮肤样品中的折射率，而使组织透明和蛋白质的完整，从而允许在单细胞分辨率的免疫检测。

在滤泡表皮和毛囊使用该立方协议，基底和增殖角化细胞种群在使用抗Keratin14（K14）和抗Ki67抗体野生型小鼠的全层皮肤活检成像。在野生型皮肤活检皮脂腺用尼罗红染色也观察。最后，在野生型和增生YAP2-5SA-ΔC皮肤活检的基部角质细胞群体进行比较^8。

这一立方协议允许在单细胞分辨率的全层皮肤活检蛋白表达的视觉评估，并以欣赏的转基因皮肤表皮的解剖和形态缺陷的重要工具小鼠，并调查表皮发育和再生基础的细胞和分子机制。

Protocol

伦理学声明:所有涉及动物主题程序遵循的动物护理和伦理委员会（ACEC）在新南威尔士大学澳大利亚的批准下ACEC协议13 / 64B的准则。

1.透明小鼠皮肤组织的制备

注意:在本研究中使用的所有小鼠在C57BL / 6遗传背景

1. 小鼠皮肤组织的集合。
   1. 入道安乐死颈椎脱位小鼠。
   2. 小心地从与微调，注意不要伤到皮肤相关的皮肤区域中删除毛发。
   3. 清洗皮肤与磷酸盐缓冲液（PBS）70％乙醇消毒。
   4. 提起背颈部皮肤钳，使切口，用剪刀。
   5. 背解剖老鼠的皮肤（约1.5×4厘米）的大面积。
   6. 展平皮肤真皮面朝下放在滤纸上，并记下样品的前后方向。
   7. 三周围的解剖皮肤μm过滤纸，并将其放置在15ml试管填充有在PBS新鲜制备的4％低聚甲醛（PFA）的解决方案。
   8. 在4℃的冰箱中固定1小时，在室温下，或过夜。
   9. 洗涤皮肤2×5分钟的PBS在15毫升管。
      注:以下（1.1.10 - 1.1.12）是组织的长期存储可选步骤。
   10. 脱水在PBS解剖皮肤中在室温下1小时的洗涤步骤在15毫升管增加的乙醇（25％，50％70％）的浓度。
   11. 在4℃储存于PBS 70％乙醇15毫升管缺水的肌肤，直到进一步使用。
   12. 结算前4小时，再水合的皮肤组织在PBS中于室温下1小时的洗涤步骤减小的在一个15毫升管乙醇（70％，50％，25％，0％）的浓度。
2. 清除小鼠皮肤活检
   1. 3.85克尿素3.85克的N-，N，N-溶解准备CUBIC1结算解决方案'，N'N'-四（2-羟丙基）乙二胺在5.38毫升上设置为60的加热器蒸馏水 - 70℃。用热搅拌器。
   2. 添加2.31克聚乙二醇单对异辛基苯基醚/的Triton X-100的溶液，一旦它是明确的，冷却到室温。
   3. 切开小鼠皮肤用锋利的剃刀刀片成尺寸约为0.2×0.5厘米活检，并在5毫升在一个15毫升管CUBIC1结算溶液淹没。为了优化毛囊的可视化，确保了活检的较长侧沿试样的前 - 后方向切割。
   4. 放置在37℃下在杂交烘箱的旋转平台上。
   5. 7天之后更改结算解决方案。准备使用前新鲜CUBIC1解决方案。
   6. 入住后7日内组织的透明度。如果有必要，离开活检CUBIC1结算解决方案，直到组织是完全透明的。
   7. 一旦皮肤活检是透明的，除去CUBIC1溶液，并加入4毫升1-×PBS中洗涤组织4次6小时于37℃。
   8. 在37℃下洗皮肤组织在20％重量/在PBS V蔗糖在一个15毫升管4小时。
   9. 冻结在-80℃冷冻过夜在15ml管安装平台最佳切削温度（OCT）化合物的组织。
      注意:此步骤会增加活检的渗透率为在后续步骤中抗体的渗透。

2.免疫荧光染色

1. 解冻从1.2.9组织），以室温下搅拌2 - 3小时。
2. 在15ml试管用5毫升的PBS 8小时，在室温下洗涤​​组织以除去OCT化合物。
3. 转印活检到2ml的管中，并孵育在1ml兔抗Keratin14或兔抗Ki67抗体组织，无论稀释1:在PBST（PBS + 0.1％的Triton-X100）在37 100 3天在振荡器上°℃烘箱。
4. 转印活检到15毫升管中，一个第二洗组织4次，6小时在5毫升的PBST振荡器上在37℃的烘箱。
5. 在37℃的烘箱在PBST 100和孵育3天振荡器上:转印活检到2ml的管中，加入1 ml的抗 - 兔Alexa594稀释的二级抗体。
6. 转印活检到15毫升管中，并洗净组织4次，6小时在PBST 5毫升振荡器上在37℃的烘箱。
7. 转印活检到2ml的管中，加入1 ml 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）核染剂溶液（1:1,000）在PBST和在37℃的烘箱振荡器上孵育过夜。
8. 除去DAPI复染溶液，和1ml的PBST加至2毫升管洗组织4次6小时在摇床上在37℃的烘箱。
   注意:可选步骤:活检可以存储在黑暗中在1×PBS中的0.02％叠氮化钠，至少3周。

3.尼罗红染色

1. 溶解在二甲基亚砜（DMSO）尼罗红粉末1μm的最终浓度克/毫升
2. 加入1μl尼罗红溶液到1ml PBS中至1微克/毫升的最终浓度。
3. 从1.2.9解冻组织），以室温下搅拌2 - 3小时，并用5ml PBS洗涤，在室温下8小时。
4. 转移活检到2ml的管中，并在1ml尼罗红染色溶液淹没组织在室温下2.5小时。
5. 洗2毫升管的皮肤活检用1ml PBST 4次在室温下30分钟。
6. 除去从2毫升管的PBST溶液，加入1毫升的DAPI核复染溶液（1:1,000）在PBST，在室温下孵育过夜。
7. 除去DAPI复染溶液，并在2毫升管中添加的PBST 1毫升洗皮肤组织4次在室温下6小时。
   注意:可选步骤:活检可以存储在黑暗中在1×PBS中的0.02％叠氮化钠，至少3周。

4.成像

1. 准备CUBIC2结算解决方案，其中包含50个％（重量/体积）蔗糖，25％（重量/体积）脲，10％（重量/体积）2,2'，2'' - nitrilotriethanol和0.1％（体积/体积）的Triton X-100。
2. 孵育在37℃的烘箱中进行24小时的摇床上，在2毫升管1毫升CUBIC2溶液的皮肤组织。此步骤将连组织的折射率。
3. 检查组织的清晰度。一旦它是清楚的，在整个皮肤活检（0.2×0.5厘米）在其长边放置到玻璃盖玻片，使得毛囊的长度方向平行于盖玻片表面（＃1 24×60毫米）
   注:可选步骤:抗体染色切片可以存储在CUBIC2溶液中约7天。尼罗红染色的活检只能存储在1天CUBIC2溶液，并应尽快成像。
4. 制备成像室（ 图1）
   注:成像室的准备所需耗材主要有:蓝色粘性，玩面团或相似，且2盖玻片（24×50毫米）（Figure 1A）。
   1. 制备蓝色粘性的两个薄带（直径约1mm×2厘米），和两个盖玻片（ 图1B）。
   2. 放置在一个盖玻片蓝色钉条，允许皮肤活检（ 图1C）足够的空间。 4.4.3）
   3. 放置皮肤活检中条之间关于在CUBIC2溶液滴（ 图1C）的盖玻片。
   4. 覆盖皮肤活检与第二盖玻片（ 图1D）。
5. 与安装的皮肤活检成像室放置到共聚焦显微镜的阶段，移动组织进入光通道。
6. 扫描用水银或卤素光源和标准表面荧光过滤器（ 例如，DAPI / GFP / CY3 / CY5）识别感兴趣荧光染色区样品。
7. 使用10X和20X物镜（NA 0.75）和标准共聚焦荧光成像技术（ 例如 ，与DA感兴趣图像区域PI染色样品照亮有405nm激光器和收集425之间的荧光信号 - 475纳米，并用的Alexa Fluor 594或尼罗红染色的样品照射与561纳米的激光，并收集570之间的荧光信号 - 620纳米）。
8. 生成的使用显微镜Z堆叠图像采集软件每个关心区域的图像的Z堆叠（ 例如 ，使用NIS元件成像软件4.13如下所述）。
   1. 确保最佳的激光功率和PMT HV /偏移设置已经选定，收集样品荧光。
   2. 从"采集控制"打开"ND采集"工具栏。
   3. 选择"Z系列设置"选项卡（确保所有其他选项卡选择）。
   4. 虽然现场扫描，聚焦到样品的顶部，然后按"顶部"按钮。
   5. 聚焦到样品的底部，然后按"底部"按钮。
   6. 输入所需的步长（或按优化步长按钮）。
   7. 预SS的"立即运行"按钮。
   8. 保存生成的Z-堆栈作为单独的TIFF图像堆栈（每图像Z堆栈1荧光染料）。
9. 使用图像的Z堆栈重建的使用三维分析软件感兴趣的3D体积的区域（ 例如 ，使用如下所述了Imaris 7.2.3 64位）。
   1. 启动分析软件。
   2. 在工具栏的三维体积代选择"超越"按钮。
   3. 敞开的第一彩色图象Z堆叠（ 例如 ，DAPI）。
   4. 使用"添加频道"工具来添加额外的颜色通道，每个荧光染料一个通道。因而含有DAPI和Alexa Fluor 594的荧光的样本将需要两个信道。
   5. 使用"图片属性"工具来设置正确的像素（像素），尺寸（XYZ），在4.7以上决定。
   6. 根据需要使用"显示调整"工具来改变颜色通道（如 DAPI通道设置为蓝色，的Alexa Fluor 594通道，红色）。
   7. 宝习得在图像窗口中的3D体积，使用计算机鼠标根据需要点击并拖动音量。
   8. 在工具栏中使用"快照"工具来生成3D图像的屏幕截图。
   9. 在工具栏中使用"动画"工具来生成3D样本轮换的电影。

Results

成年野生型小鼠的全层背部皮肤活检进行了澄清，与抗体结合基础角质标记Keratin14（K14）染色，细胞核复染用DAPI染色溶液（ 图2和电影1）。

DAPI阳性细胞核整个样品（ 图2A，C）是可见的，和K14染色只在滤泡表皮的单细胞厚基底层是可见的，并概述皮脂腺（黑星号），外根鞘毛囊，和在二次发病菌（ 图2B，C）中 ，如先前所发表的^9。 K14染色强度是在滤泡表皮，远侧毛囊和次级头发病菌（白星号）高，并且它是在毛囊（卜在图2C）的凸出区域相对较低。真皮乳头也明显visiblE到DAPI标记（ 如图2C箭头）。

为了显现增殖细胞，全厚度背部皮肤活检成年野生型小鼠的休止期得到澄清并用抗Ki67抗体染色，并且细胞核复染用DAPI溶液（ 图3，和电影2）。<...

Discussion

控制皮肤发育和稳态的调节机制是最常见的2D采用组织切片和组织染色标记的抗体，它能使皮肤只形态，细胞群或蛋白表达的限制升值的影响。许多方法已被开发，以改善细胞和蛋白质中的单细胞分辨率的空间组织的可视化在表皮整体坐骑^{三月10日至13日}的尺寸。其中的一些但涉及从真皮，这在技术上是挑战性的表皮层的分离特别是在使用有毛皮肤，并经常导致毛囊的组织损伤和破裂。而且，表皮和真皮也妨碍学习胚胎发育和组织稳态期间它们之间发生的细胞和分子的相互作用的分离。

在'平片的做法"是另一种方法，其中全厚鼠标皮肤解剖和免疫染色，然后用苯甲酸苄酯和苯甲醇（BBBA），同时保持免疫荧光信号¹⁴澄清。此方法不需要从真皮表皮的技术上具有挑战性的分离。然而，BBBA是剧毒，它变性一些荧光蛋白，它污染显微镜物镜，不允许进行调查的组织细胞和分子的相互作用所需要的样品的高分辨率成像。

这份报告描述了三次协议^5-7澄清任何所需解剖区域和年龄使用相对安全和廉价的试剂全层小鼠皮肤活检。该技术简单协议允许的蛋...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6418
乙醇 96%（未变性）	化学供应	UN1170
尼罗河红	Sigma-Aldrich	72485-100MG
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI）	罗氏	10236276001
N，N，N'，N'-四基（2-羟丙基）乙二胺	Merck Millipore	821940
聚乙二醇单对异辛基苯醚	Merck Millipore	648462
Triton X-100	Merck Millipore	648462
蔗糖	Sigma-Aldrich	S0389
最佳切割温度 （OCT） 复合	组织-Tek	4583
抗 Keratin14 抗体	Covance	PRB-155P
抗 Ki67 抗体	Abcam	ab16667
驴抗兔 Alexa 594	Life Technologies	A21207
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D2650
尿素	Merck Millipore	66612
2,2′，2′'-次氮基三乙醇	Merck Millipore	137002
共聚焦显微镜	尼康仪器公司	尼康 A1 - 共聚焦显微镜
cruZer6 面部修剪器	Braun	Braun cruZer6 面部
叠氮化钠	Sigma-Aldrich