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CUBIC 协议在全层皮肤样本中以单细胞分辨率可视化蛋白表达

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DOI：

10.3791/54401

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2016年8月4日

 ,  ,  ,  ,  , 
1The School of Medical Sciences, University of New South Wales Australia, 2Neuroscience Research Australia, 3Biomedical Imaging Facility, University of New South Wales Australia

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本报告介绍了一种CUBIC方法，用于透明化全厚度小鼠皮肤活检样本，并在三维空间中以单细胞分辨率可视化蛋白表达模式、增殖细胞及皮脂细胞。该方法可准确评估皮肤解剖结构与病理特征，以及基因修饰小鼠品系中的表皮异常表型。

摘要

皮肤对我们的生存至关重要。表皮外层由表皮间区（interfollicular epidermis）构成，这是一种覆盖我们身体大部分区域的复层鳞状上皮，还包括毛囊和汗腺等表皮附属结构。表皮在生命过程中以及损伤后能够持续再生。这一过程由表达K14的基底层表皮干细胞/祖细胞群体所驱动，这些细胞受到表皮内部以及表皮与真皮之间多种调控机制的严密调控。本文介绍一种简便的方法，用于透明化全层小鼠皮肤活检样本，并在三维空间中以单细胞分辨率可视化K14蛋白的表达模式、Ki67标记的增殖细胞、尼罗红（Nile Red）标记的皮脂细胞以及DAPI标记的细胞核。该方法可准确评估和量化皮肤解剖结构与病理变化，以及基因修饰小鼠品系中异常的表皮表型。CUBIC技术是目前可用于在单细胞分辨率下研究全层皮肤活检样本中分子与细胞相互作用的最佳方法。

引言

皮肤对我们的生存至关重要。它主要由三层构成：最外层的表皮、真皮和皮下组织。表皮是一种高度再生的组织，属于复层鳞状上皮，主要由角质形成细胞组成。角质形成细胞在基底层产生，随后向上穿过基底层以上的各层，在分化过程中逐渐移动，最终在出生约一个月后从最外层的角化层脱落。表皮还发育出多种附属结构，包括毛囊和皮脂腺。毛囊在人的一生中也以周期性方式不断再生1。表皮的再生能力依赖于干细胞和前体细胞的存在，这些细胞位于表皮间毛囊区域的基底层以及毛囊中2。

许多信号通路已被证实参与表皮发育与再生过程。其中一些通路仅在表皮内发挥作用，例如Hedgehog通路。另一些信号事件则发生在真皮与表皮之间3。例如，来自真皮的Wnt信号被认为对毛囊发育至关重要，这些信号由毛乳头在生长期（anagen）起始时分泌，以激活毛囊隆突区干细胞/前体细胞的增殖及毛囊的生长4。深入了解调控表皮发育与再生的细胞和分子机制，有助于更好地理解这些过程在皮肤再生性疾病（如皮肤癌）中如何被干扰。

本文介绍了一种Clear、Unobstructed Brain Imaging 鸡尾酒溶液与Computational 分析（CUBIC）方案5-7 ，用于透明化完整皮肤标本，并通过共聚焦显微镜在单细胞分辨率下实现蛋白质表达模式的三维可视化。CUBIC 方法包括将皮肤组织浸入两种基于氨基醇的化学鸡尾酒溶液中。这些溶液可调节皮肤样本中的折射率，使组织透明而蛋白质保持完整，从而实现单细胞分辨率下的免疫检测。

利用该CUBIC方案，通过抗角蛋白14（K14）和抗Ki67抗体，对野生型小鼠全层皮肤活检样本中表皮间毛囊区及毛囊中的基底细胞层和增殖性角质形成细胞群体进行了成像观察。同时，利用尼罗红染色对野生型皮肤活检样本中的皮脂腺进行了可视化观察。最后，比较了野生型与YAP2-5SA-ΔC增生性皮肤活检样本中基底角质形成细胞群体的差异8。

该CUBIC方案可实现对全层皮肤活检样本中蛋白质表达的单细胞分辨率可视化评估，是研究基因修饰小鼠皮肤表皮解剖结构及形态学缺陷的重要工具，也可用于探究表皮发育与再生过程中的细胞与分子机制。

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方案

伦理声明：所有涉及动物受试者的实验程序均遵循澳大利亚新南威尔士大学动物护理与伦理委员会（ACEC）批准的 ACEC 方案 13/64B 的相关指南。

1. 透明小鼠皮肤组织的制备

注意：本研究中使用的所有小鼠均为 C57BL/6 遗传背景

  1. 小鼠皮肤组织的采集。
    1. 通过颈椎脱位法人道处死小鼠。
    2. 使用修剪器小心去除相关皮肤区域的毛发，注意避免损伤皮肤。
    3. 用磷酸盐缓冲液（PBS）中配制的70%乙醇清洗皮肤以去污。
    4. 用镊子提起背部颈区皮肤，并用剪刀做切口。
    5. 解剖获取较大面积的背部小鼠皮肤（约1.5 × 4 cm）。
    6. 将皮肤真皮面朝下展平于滤纸上，并标记样本的前后方向。
    7. 沿解剖所得皮肤修剪滤纸，然后将其放入盛有新配制的4%多聚甲醛（PFA）PBS溶液的15 ml离心管中。
    8. 在室温下固定1小时，或在4 °C冰箱中过夜固定。
    9. 在15 ml离心管中用PBS洗涤皮肤，每次5分钟，共洗2次。
      注意：以下步骤（1.1.10 - 1.1.12）为组织长期保存的可选步骤。
    10. 在15 ml离心管中，使用浓度递增的乙醇（25%、50%、70%）PBS溶液对解剖后的皮肤进行脱水处理，每次洗涤1小时，室温操作。
    11. 将脱水后的皮肤保存于含70%乙醇的PBS溶液的15 ml离心管中，置于4 °C冰箱中，直至后续使用。
    12. 在透明化处理前4小时，于15 ml离心管中使用浓度递减的乙醇（70%、50%、25%、0%）PBS溶液对皮肤组织进行再水化处理，每次洗涤1小时，室温操作。
  2. 小鼠皮肤活检组织的透明化处理
    1. 通过在60–70 °C加热条件下，将3.85 g尿素和3.85 g N,N,N',N'-四(2-羟丙基)乙二胺溶于5.38 ml蒸馏水中，配制CUBIC1透明化溶液。使用加热磁力搅拌器。
    2. 待溶液澄清并冷却至室温后，加入2.31 g聚乙二醇单对异辛基苯基醚/Triton X-100。
    3. 用锋利的剃须刀片将小鼠皮肤切成约0.2 × 0.5 cm大小的活检样本，并将其浸入装有5 ml CUBIC1透明化溶液的15 ml离心管中。为优化毛囊的可视化效果，应确保活检样本的长边沿样本的前后方向切割。
    4. 将离心管置于37 °C杂交炉中的旋转平台上。
    5. 7天后更换透明化溶液。使用前需新鲜配制CUBIC1溶液。
    6. 7天后检查组织的透明度。如有必要，继续将活检样本保留在CUBIC1透明化溶液中，直至组织完全透明。
    7. 当皮肤活检样本完全透明后，移除CUBIC1溶液，并加入4 ml 1× PBS，在37 °C下洗涤组织4次，每次6小时 。
    8. 在15 ml离心管中，用含20% w/v蔗糖的PBS溶液在37 °C下洗涤皮肤组织4小时 。
    9. 将组织置于包埋剂OCT（Optimal Cutting Temperature Compound）中，放入15 ml离心管，于-80 °C超低温冰箱中过夜冷冻。
      注意：此步骤将提高后续实验中抗体对活检组织的渗透性。

2. 免疫荧光染色

  1. 将1.2.9）中的组织在室温下解冻2 - 3小时。
  2. 在15 ml离心管中用5 ml PBS于室温下洗涤组织8小时，以去除OCT包埋剂。
  3. 将组织活检样本转移至2 ml离心管中，加入1 ml兔抗Keratin14抗体或兔抗Ki67抗体（均以PBST（PBS + 0.1% Triton-X100）按1:100稀释），在37 °C培养箱中振荡孵育3天。
  4. 将组织活检样本转移至15 ml离心管中，用5 ml PBST在37 °C培养箱中振荡洗涤4次，每次6小时。
  5. 将组织活检样本转移至2 ml离心管中，加入1 ml Alexa594标记的抗兔二抗（以PBST按1:100稀释），在37 °C培养箱中振荡孵育3天。
  6. 将组织活检样本转移至15 ml离心管中，用5 ml PBST在37 °C培养箱中振荡洗涤4次，每次6小时。
  7. 将组织活检样本转移至2 ml离心管中，加入1 ml DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）核复染溶液（1:1,000稀释于PBST中），在37 °C培养箱中振荡孵育过夜。
  8. 移除DAPI复染液，向2 ml离心管中加入1 ml PBST，在37 °C培养箱中振荡洗涤4次，每次6小时。
    注意：可选步骤：组织活检样本可在含0.02%叠氮化钠的1×PBS中避光保存，至少可保存3周。

3. 尼罗红染色

  1. 将尼罗红粉末溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成终浓度为 1 mg/ml 的溶液。
  2. 取 1 µl 尼罗红溶液加入 1 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成终浓度为 1 µg/ml 的染色工作液。
  3. 将步骤 1.2.9) 中的组织于室温下解冻 2–3 小时，并用 5 ml PBS 在室温下洗涤 8 小时。
  4. 将组织活检样本转移至 2 ml 离心管中，加入 1 ml 尼罗红染色液，完全浸没组织，在室温下孵育 2.5 小时。
  5. 在 2 ml 离心管中用 1 ml PBST 溶液洗涤皮肤活检样本，每次 30 分钟，共洗涤 4 次，均在室温下进行。
  6. 吸去 PBST 溶液，向 2 ml 离心管中加入 1 ml DAPI 核复染溶液（1:1,000 稀释于 PBST 中），于室温下避光孵育过夜。
  7. 去除 DAPI 复染液，向 2 ml 离心管中加入 1 ml PBST 溶液，洗涤皮肤组织 4 次，每次 1.5 小时，共 6 小时，均在室温下进行。
    注意：可选步骤：活检样本可在含 0.02% 叠氮化钠的 1×PBS 中避光保存，至少可稳定存放 3 周。

4. 成像

  1. 配制CUBIC2透明化溶液，其中包含50% (w/v) 蔗糖、25% (w/v) 尿素、10% (w/v) 2,2′,2′′-三羟乙基氨基甲烷和0.1% (v/v) Triton X-100。
  2. 将皮肤组织置于含有1 ml CUBIC2溶液的2 ml离心管中，在37 °C培养箱内振荡孵育24小时。此步骤可使组织的折射率均一化。
  3. 检查组织的透明度。一旦组织变得透明，将整块皮肤活检样本（0.2 × 0.5 cm）沿其长边放置在玻璃盖玻片上，使毛囊的长度方向与盖玻片表面平行（#1，24 × 60 mm）
    注意：可选步骤：经抗体染色的活检样本可在CUBIC2溶液中保存约7天；经尼罗红染色的活检样本在CUBIC2溶液中最多只能保存1天，应尽快成像。
  4. 制备成像室（图1)
    注意：制备成像室所需的耗材包括：蓝丁胶、橡皮泥或类似物，以及2片盖玻片（24 × 50 mm）图1A).
    1. 准备两条细长的蓝色橡皮泥条（直径约1 mm × 2 cm），以及两张盖玻片（图1B).
    2. 在一张盖玻片上放置蓝色橡皮泥条，预留出足够的空间用于皮肤活检图1C). 4.4.3)
    3. 将皮肤活检样本置于盖玻片上两层条带之间的 CUBIC2 溶液液滴中（图1C).
    4. 用第二块盖玻片覆盖皮肤活检样本（图1D).
  5. 将装有固定皮肤活检样本的成像腔室置于共聚焦显微镜载物台上，并移动组织至光路中。
  6. 使用汞灯或卤素光源以及标准的落射荧光滤光片扫描样品（例如， DAPI/GFP/CY3/CY5）以鉴定荧光标记的目标区域。
  7. 使用10倍和20倍物镜（NA 0.75）以及标准共聚焦荧光成像技术选取图像感兴趣区域（例如使用DAPI染色的样本采用405 nm激光激发，并收集425–475 nm范围内的荧光信号；使用Alexa Fluor 594或Nile Red染色的样本采用561 nm激光激发，并收集570–620 nm范围内的荧光信号。
  8. 使用显微镜Z轴层扫图像采集软件，对每个感兴趣区域生成图像Z轴层扫数据例如，使用NIS元素成像软件4.13（如下所述）。
    1. 确保已选择最佳的激光功率以及PMT高压/偏移设置，以采集样品荧光信号。
    2. 打开 "ND采集" 工具栏来自 "采集控制".
    3. 选择 "Z系列设置" 标签（确保未选中所有其他标签）。
    4. 活体扫描过程中，将焦距对准样品顶部并按下 "顶部" 按钮
    5. 聚焦到样品底部并按下 "底部" 按钮。
    6. 输入所需的步长（或点击优化步长按钮）。
    7. 按压 "立即运行" 按钮
    8. 将得到的Z轴层叠图像保存为单独的Tiff图像栈（每幅图像栈对应一种荧光染料）。
  9. 使用图像Z轴堆栈，通过3D分析软件重建感兴趣区域的三维体积例如，使用 Imaris x64 7.2.3 进行分析，具体方法如下所述。
    1. 启动分析软件。
    2. 选择 "超越" 工具栏中用于生成三维体积的按钮。
    3. 打开第一个彩色图像Z轴序列（例如，DAPI）。
    4. 使用“添加通道”工具添加额外的颜色通道，每种荧光染料对应一个通道。因此，含有 DAPI 和 Alexa Fluor 594 两种荧光染料的样本需要两个通道。
    5. 使用 "图像属性" 用于设置正确的像素（体素）尺寸（XYZ），具体数值由上述步骤 4.7 确定。
    6. 使用 "显示调节" 根据需要更改通道颜色的工具（例如， 将DAPI通道设为蓝色，Alexa Fluor 594通道设为红色。
    7. 在图像窗口中定位三维图像时，可根据需要使用计算机鼠标点击并拖动图像。
    8. 使用 "快照" 使用工具栏中的工具生成3D图像的屏幕截图。
    9. 使用 "动画" 使用工具栏中的工具生成三维样本旋转的动画。

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结果

对成年野生型小鼠的全层背部皮肤活检样本进行透明化处理，然后用可结合基底角质形成细胞标志物角蛋白14（K14）的抗体进行染色，并用DAPI染色液对细胞核进行复染（图2和视频1）。

在整个样本中均可见DAPI阳性细胞核（图2A，C），K14染色仅见于单层细胞厚的表皮基底层，以及皮脂腺周围（黑色星号）、毛囊外根鞘和次级毛囊胚（图2B，C），与先前报道一致9。K14染色强度在表皮基底层、远端毛囊和次级毛囊胚中较高（白色星号），而在毛囊隆突区（图2C中的Bu）相对较低。通过DAPI标记也可清晰观察到真皮乳头（图2C中的箭头）。

为了观察增殖中的细胞，对处于休止期的成年野生型小鼠背部全层皮肤活检样本进行透明化处理，并使用抗Ki67抗体染色，细胞核则用DAPI溶液复染（图3和

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讨论

调控皮肤发育和稳态的机制通常采用二维方法进行研究，例如组织切片、组织学染色或抗体标记，这些方法仅能有限地观察皮肤形态、细胞群体或蛋白质表达。目前已开发出多种方法，以提高在三维表皮全组织标本中以单细胞分辨率可视化细胞和蛋白质空间分布的能力10-13。然而，其中一些方法需要将表皮与真皮分离，这在技术上具有挑战性，尤其是在使用有毛皮肤时，且常常导致组织损伤和毛囊破裂。此外，表皮与真皮的分离也妨碍了对胚胎发育及组织稳态过程中二者之间发生的细胞与分子相互作用的研究。

“平铺法”是另一种方法，即分离出全厚度的小鼠皮肤组织，进行免疫染色后，使用苯甲酸苄酯和苯甲醇（BBBA）透明化处理，同时保留免疫荧光信号14。该方法无需在技术上较难实现的表皮与真皮分离步骤。然而，BBBA具有高毒性，可使某些荧光蛋白变性，并会污染显微镜物镜，因而无法实现组织中细胞与分子相互作用研究所必需的高分辨率成像。

本报告介绍了一种CUBIC方案5-7 ，使用相对安全且廉价的试剂，对来自任意解剖区域和年龄...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢澳大利亚生物资源中心（Garvan研究所，澳大利亚）、生物资源中心（新南威尔士大学澳大利亚）以及动物护理 & 伦理委员会对动物实验的支持。本研究由澳大利亚国家健康与医学研究委员会（项目资助 APP1062720）资助。Cesar P. Canales 博士获得智利CONICYT奖学金（#72101076）。Bassem Akladios 先生获得澳大利亚新南威尔士大学国际研究生奖学金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
多聚甲醛Sigma-Aldrich P6418
96% 乙醇（未变性）Chem-supplyUN1170
尼罗红Sigma-Aldrich 72485-100MG
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）Roche10236276001
N,N,N’,N’-四(2-羟丙基)乙二胺Merck Millipore821940
聚乙二醇单对异辛基苯基醚Merck Millipore648462
吐温 X-100Merck Millipore648462
蔗糖Sigma-Aldrich S0389
最佳切割温度（OCT）包埋剂Tissue-Tek4583
抗角蛋白14抗体CovancePRB-155P
抗Ki67抗体 Abcamab16667
驴抗兔Alexa 594Life TechnologiesA21207
二甲基亚砜Sigma-Aldrich D2650
尿素Merck Millipore66612
2,2′,2′’-次氮基三乙醇Merck Millipore137002
共聚焦显微镜Nikon Instruments IncNikon A1 - 共聚焦显微镜
cruZer6 面部修剪器BraunBraun cruZer6 Face
叠氮化钠Sigma-Aldrich 438456

参考文献

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  2. Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).
  3. Hardy, M. H. The secret life of the hair follicle. Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).
  4. Lim, X., Nusse, R. Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).
  5. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
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  7. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  8. Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis. J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).
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  10. Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
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  13. Schweizer, J., Marks, F. A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis. J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).
  14. Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. (88), e51749(2014).

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K14 Ki67 DAPI

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