CUBIC 协议在全层皮肤样本中以单细胞分辨率可视化蛋白表达

摘要

本报告介绍了一种CUBIC方法，用于透明化全厚度小鼠皮肤活检样本，并在三维空间中以单细胞分辨率可视化蛋白表达模式、增殖细胞及皮脂细胞。该方法可准确评估皮肤解剖结构与病理特征，以及基因修饰小鼠品系中的表皮异常表型。

摘要

皮肤对我们的生存至关重要。表皮外层由表皮间区（interfollicular epidermis）构成，这是一种覆盖我们身体大部分区域的复层鳞状上皮，还包括毛囊和汗腺等表皮附属结构。表皮在生命过程中以及损伤后能够持续再生。这一过程由表达K14的基底层表皮干细胞/祖细胞群体所驱动，这些细胞受到表皮内部以及表皮与真皮之间多种调控机制的严密调控。本文介绍一种简便的方法，用于透明化全层小鼠皮肤活检样本，并在三维空间中以单细胞分辨率可视化K14蛋白的表达模式、Ki67标记的增殖细胞、尼罗红（Nile Red）标记的皮脂细胞以及DAPI标记的细胞核。该方法可准确评估和量化皮肤解剖结构与病理变化，以及基因修饰小鼠品系中异常的表皮表型。CUBIC技术是目前可用于在单细胞分辨率下研究全层皮肤活检样本中分子与细胞相互作用的最佳方法。

引言

皮肤对我们的生存至关重要。它主要由三层构成：最外层的表皮、真皮和皮下组织。表皮是一种高度再生的组织，属于复层鳞状上皮，主要由角质形成细胞组成。角质形成细胞在基底层产生，随后向上穿过基底层以上的各层，在分化过程中逐渐移动，最终在出生约一个月后从最外层的角化层脱落。表皮还发育出多种附属结构，包括毛囊和皮脂腺。毛囊在人的一生中也以周期性方式不断再生¹。表皮的再生能力依赖于干细胞和前体细胞的存在，这些细胞位于表皮间毛囊区域的基底层以及毛囊中²。

许多信号通路已被证实参与表皮发育与再生过程。其中一些通路仅在表皮内发挥作用，例如Hedgehog通路。另一些信号事件则发生在真皮与表皮之间³。例如，来自真皮的Wnt信号被认为对毛囊发育至关重要，这些信号由毛乳头在生长期（anagen）起始时分泌，以激活毛囊隆突区干细胞/前体细胞的增殖及毛囊的生长⁴。深入了解调控表皮发育与再生的细胞和分子机制，有助于更好地理解这些过程在皮肤再生性疾病（如皮肤癌）中如何被干扰。

本文介绍了一种Clear、Unobstructed Brain Imaging 鸡尾酒溶液与Computational 分析（CUBIC）方案^5-7 ，用于透明化完整皮肤标本，并通过共聚焦显微镜在单细胞分辨....

方案

伦理声明：所有涉及动物受试者的实验程序均遵循澳大利亚新南威尔士大学动物护理与伦理委员会（ACEC）批准的 ACEC 方案 13/64B 的相关指南。

1. 透明小鼠皮肤组织的制备

注意：本研究中使用的所有小鼠均为 C57BL/6 遗传背景

1. 小鼠皮肤组织的采集。
   1. 通过颈椎脱位法人道处死小鼠。
   2. 使用修剪器小心去除相关皮肤区域的毛发，注意避免损伤皮肤。
   3. 用磷酸盐缓冲液（PBS）中配制的70%乙醇清洗皮肤以去污。
   4. 用镊子提起背部颈区皮肤，并用剪刀做切口。
   5. 解剖获取较大面积的背部小鼠皮肤（约1.5 × 4 cm）。
   6. 将皮肤真皮面朝下展平于滤纸上，并标记样本的前后方向。
   7. 沿解剖所得皮肤修剪滤纸，然后将其放入盛有新配制的4%多聚甲醛（PFA）PBS溶液的15 ml离心管中。
   8. 在室温下固定1小时，或在4 °C冰箱中过夜固定。
   9. 在15 ml离心管中用PBS洗涤皮肤，每次5分钟，共洗2次。
      注意：以下步骤（1.1.10 - 1.1.12）为组织长期保存的可选步骤。
   10. 在15 ml离心管中，使用浓度递增的乙醇（25%、50%、70%）PBS溶液对解剖后的皮肤进行脱水处理，每次洗涤1小时，....

结果

对成年野生型小鼠的全层背部皮肤活检样本进行透明化处理，然后用可结合基底角质形成细胞标志物角蛋白14（K14）的抗体进行染色，并用DAPI染色液对细胞核进行复染（图2和视频1）。

在整个样本中均可见DAPI阳性细胞核（图2A，C），K14染色仅见于单层细胞厚的表皮基底层，以及皮脂腺周围（黑色星号）、毛囊外根鞘和次级毛囊胚（图2B，C），与先前报道一致⁹。K14染色强度在表皮基底层、远端毛囊和次级毛囊胚中较高（白色星号），而在毛囊隆突区（图2C中的Bu）相对较低。通过DAPI标记也可清晰观察到真皮乳头（图2C中的箭头）。

为了观察增殖中的细胞，对处于休止期的成年野生型小鼠背部全层皮肤活检样本进行透明化处理，并使用抗Ki67抗体染色，细胞核则用DAPI溶液复染（图3和

讨论

调控皮肤发育和稳态的机制通常采用二维方法进行研究，例如组织切片、组织学染色或抗体标记，这些方法仅能有限地观察皮肤形态、细胞群体或蛋白质表达。目前已开发出多种方法，以提高在三维表皮全组织标本中以单细胞分辨率可视化细胞和蛋白质空间分布的能力^10-13。然而，其中一些方法需要将表皮与真皮分离，这在技术上具有挑战性，尤其是在使用有毛皮肤时，且常常导致组织损伤和毛囊破裂。此外，表皮与真皮的分离也妨碍了对胚胎发育及组织稳态过程中二者之间发生的细胞与分子相互作用的研究。

“平铺法”是另一种方法，即分离出全厚度的小鼠皮肤组织，进行免疫染色后，使用苯甲酸苄酯和苯甲醇（BBBA）透明化处理，同时保留免疫荧光信号¹⁴。该方法无需在技术上较难实现的表皮与真皮分离步骤。然而，BBBA具有高毒性，可使某些荧光蛋白变性，并会污染显微镜物镜，因而无法实现组织中细胞与分子相互作用研究所必需的高分辨率成像。

本报告介绍了一种CUBIC方案^5-7 ，使用相对安全且廉价的试剂，对来自任意解剖区域和年龄.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6418
96% 乙醇（未变性）	Chem-supply	UN1170
尼罗红	Sigma-Aldrich	72485-100MG
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	Roche	10236276001
N,N,N’,N’-四(2-羟丙基)乙二胺	Merck Millipore	821940
聚乙二醇单对异辛基苯基醚	Merck Millipore	648462
吐温 X-100	Merck Millipore	648462
蔗糖	Sigma-Aldrich	S0389
最佳切割温度（OCT）包埋剂	Tissue-Tek	4583
抗角蛋白14抗体	Covance	PRB-155P
抗Ki67抗体	Abcam	ab16667
驴抗兔Alexa 594	Life Technologies	A21207
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D2650
尿素	Merck Millipore	66612
2,2′,2′’-次氮基三乙醇	Merck Millipore	137002
共聚焦显微镜	Nikon Instruments Inc	Nikon A1 - 共聚焦显微镜
cruZer6 面部修剪器	Braun	Braun cruZer6 Face
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	438456