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方法文章

风土概念通过葡萄果实代谢组学与转录组学的解析

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DOI：

10.3791/54410

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2016年10月5日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biotechnology Department, University of Verona, 2Lab. of Bioorganic Chemistry, Physics Department, University of Trento, 3S-IN Soluzioni Informatiche

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了非靶向代谢组学、转录组学及多变量统计分析在葡萄果实转录本和代谢物研究中的应用，旨在深入理解风土（terroir）概念。 即环境对浆果品质性状的影响。

摘要

风土（terroir）是指一系列环境因素的综合作用，这些因素会因特定生境和管理方式的不同而影响作物（如葡萄藤（Vitis vinifera））的特征。本文展示了如何通过多元统计分析方法，在科维纳（Corvina）葡萄品种的果实代谢组和转录组中检测到特定的风土特征。该方法首先需要制定合理的采样方案。在本案例中，为尽量减少遗传差异，选用了科维纳品种的一个特定克隆，并在三个不同生长季期间，从代表三个不同大区的七个葡萄园采集样品。推荐采用非靶向液相色谱-质谱（LC-MS）代谢组学方法，因其具有高灵敏度，同时结合使用MZmine软件进行高效的数据处理，以及基于碎片树分析的代谢物鉴定策略。通过包含覆盖约99%所有预测葡萄基因探针的微阵列，可实现全面的转录组分析，从而在不同风土背景下同时分析所有差异表达基因。最后，可采用基于投影法的多元数据分析方法，以克服年份效应的强烈干扰，实现代谢组学与转录组学数据的整合与深入分析，进而识别出具有信息价值的相关性。

引言

基于植物基因组、转录组、蛋白质组和代谢组的大规模数据分析，为理解复杂系统的行为提供了前所未有的洞察，例如葡萄酒的风土特征，其反映了葡萄植株与其环境之间的相互作用。由于即使在同一葡萄克隆种植于不同葡萄园时，葡萄酒的风土特征仍可能存在差异，因此基因组分析作用有限，因为克隆间的基因组是相同的。相反，有必要研究基因表达与果实代谢特性之间的相关性，这些特性决定了葡萄酒的品质特征。在转录组水平上进行基因表达分析得益于所有转录本相似的化学性质，这使得可以通过利用诸如微阵列上固定探针的杂交等通用特性来实现定量分析。相比之下，由于单个蛋白质和代谢物在物理和化学性质上具有巨大的多样性，蛋白质组学和代谢组学中的通用分析方法更具挑战性。在代谢组学中，这种多样性尤为显著，因为单个代谢物在大小、极性、丰度和挥发性方面差异极大，因此目前尚无单一的提取流程或分析方法能够提供全面的整体性研究方案。

在适用于非挥发性代谢物的分析平台中，基于高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）的方法比其他替代技术（如配备紫外检测器或二极管阵列检测器的高效液相色谱法（HPLC-UV、HPLC-DAD）或核磁共振（NMR）波谱法）具有更高的灵敏度，但HPLC-MS的定量分析可能受到基质效应及离子抑制/增强等现象的影响1-3。在利用电喷雾离子源的高效液相色谱-质谱法（HPLC-ESI-MS）分析科维纳葡萄果实的过程中，研究发现保留时间最短的糖类及其他分子被严重低估，这可能也反映了该保留时间区域中分子数量众多；此外，其他分子的丰度可能被低估、高估或不受基质效应影响，但针对基质效应进行的数据归一化处理似乎对整体结果影响有限4,5。本文所述方法针对葡萄果实成熟过程中大量积累、且受风土条件显著影响的中等极性代谢物分析进行了优化。这些代谢物包括花青素、黄酮醇、黄烷-3-醇、原花青素、其他黄酮类化合物、白藜芦醇、芪类化合物、羟基肉桂酸和羟基苯甲酸，它们共同决定了葡萄酒的颜色、风味及与健康相关的特性。其他代谢物（如糖类和脂肪族有机酸）则被忽略，因其在HPLC-MS定量分析中受基质效应和离子抑制现象影响，结果不可靠5。在本方法选定的极性范围内，该方法属于非靶向分析，旨在尽可能检测多种不同的代谢物6。

得益于完整的葡萄基因组序列的获得，转录组学方法得以同时监测成千上万条葡萄转录本7,8。早期基于高通量cDNA测序的转录组学方法，随着下一代测序技术的出现，已发展为一系列统称为RNA-Seq技术的操作流程。该方法正迅速成为转录组学研究的首选。然而，已有大量基于微阵列（microarray）的文献积累，该技术可通过杂交方式并行定量数千条转录本。事实上，在RNA-Seq成为主流技术之前，已开发出多种专用的商业化微阵列平台，使得葡萄转录组能够被深入细致地分析。在众多平台中，仅有两个支持全基因组范围的转录组分析9。其中最先进的芯片允许在单个装置上同时杂交多达12个独立样本，从而降低了每次实验的成本。这12个子阵列各自包含135,000个60碱基长的探针，代表了29,549条葡萄转录本。该装置已被广泛应用于大量研究中10–24。目前这两个平台均已停产，但最近新设计了一款定制微阵列，代表了更近期的发展，其包含数量更多的探针，可覆盖更多新近发现的葡萄基因25。

转录组学和代谢组学分析产生的大规模数据集需要采用适当的统计方法进行数据分析，包括使用多变量技术来确定不同数据形式之间的相关性。目前最常用的多变量技术是基于投影的方法，这些方法可以是无监督的，例如主成分分析（PCA），也可以是有监督的，例如双向正交偏最小二乘判别分析（O2PLS-DA）26。本文所介绍的实验方案利用PCA进行探索性数据分析，并采用O2PLS-DA来识别样本组之间的差异。

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方案

1. 选择合适的材料并制定采样方案

  1. 首先制定合适的采样方案。由于不存在通用的通用方法，因此需针对每个方案进行个案评估。确保采样方案明确说明采样地点、采样时间及具体的采样程序。本案例研究中所用的采样方案见图1。
    ​注：在本案例研究中，葡萄果实采自意大利维罗纳省三个不同大区（加尔达湖、瓦尔波利切拉和索阿韦）的七个商业葡萄园，品种为单一克隆（Vitis vinifera cv. Corvina，克隆48）。各葡萄园的主要特征总结于表1。样品在三个生长季（2006年、2007年和2008年）的三个时间点采集，分别对应转色期（成熟开始）、中期成熟和完全成熟期。
    1. 针对每个样本（葡萄园/年份/成熟阶段），从两行葡萄藤的不同位置随机采集30个果穗，植株上的高度和位置需随机化。
    2. 从每个果穗中随机选取三个果实，避免选择有明显损伤和/或感染迹象的果实。
    3. 重复步骤1.1.1和1.1.2，以获得三个独立的样本池。
    4. 去除果实种子，并立即将果皮在液氮中速冻。
    5. 使用自动研磨机将每个样本池中的10个冷冻果实研磨成粉，将每份粉末样品均分为两份，一份用于转录组学分析，另一份用于代谢组学分析。
    6. 将粉末样品在-80 °C下保存。
AMBABMCSFAMNPM
宏观区域Soave加尔达湖瓦尔波利切拉加尔达湖瓦尔波利切拉瓦尔波利切拉Soave
海拔高度（m）250120450100130250130
砧木41BS04K5BB420A420AK5BB41B
行向E-WN-SE-WE-WE-WN-SN-S
栽培系统架空系统（棚架）架空系统（棚架）垂直新梢定位（居约式）架空系统（棚架）架空系统（棚架）垂直新梢定位（居约式）垂直新梢定位（居约式）
土壤类型粉质黏土壤土黏土壤土黏壤土粉壤土黏壤土
种植布局（m）3.20 x 1.004.50 x 0.804.00 x 1.253.50 x 1.203.50 x 0.752.80 x 1.001.80 x 0.80
总石灰含量（%）3.919.318.314.4315.927.9
活性石灰含量（%）0.52.69.46.311.33.18.3
砂粒含量（%）15476642291336
粉粒含量（%）43362137396736
黏粒含量（%）42171321322028
土壤 pH8.37.97.88.28.27.87.9
有机质（%）2.92.52.21.22.91.62.5
可交换性磷（mg/kg）26737368484764
可交换性钾（mg/kg）190376620230168154126
可交换性镁（mg/kg）272468848623294293183
可交换性钙（mg/kg）65005380735863464652100552878
浆果还原糖 2006211.25 ± 1.20176.20 ± 0.42187.40 ± 0.00203.70 ± 1.13212.55 ± 0.64195.20 ± 0.00211.65 ± 0.64
浆果还原糖 2007190.00 ± 1.27165.25 ± 0.49153.00 ± 0.42203.60 ± 0.71210.90 ± 0.71192.25 ± 0.64188.70 ± 1.84
浆果还原糖 2008191.35 ± 0.64178.90 ± 0.57170.05 ± 0.49205.15 ± 1.48188.70 ± 0.57169.35± 0.49108.05 ± 1.06
浆果 pH 20063.01 ± 0.012.96 ± 0.012.84 ± 0.002.9 ± 0.002.98 ± 0.003.02 ± 0.003.06 ± 0.01
浆果 pH 20072.97 ± 0.003.00 ± 0.002.74 ± 0.003.07 ± 0.012.98 ± 0.002.87 ± 0.013.09 ± 0.00
浆果 pH 20082.83 ± 0.003.04 ± 0.012.71 ± 0.002.98 ± 0.012.98 ± 0.002.82 ± 0.003.11 ± 0.00
采收日期200620072008
转色期8-87-188-12
中期成熟9-48-89-2
成熟期9-188-299-23

表1：各葡萄园的主要特征及样品采集日期。m = 米，E-W = 东西向，N-S = 南北向。
葡萄采样过程示意图：三个季节中的葡萄园、成熟阶段及浆果选择。
图1： 采样流程的示意图。 三个葡萄酒生产大区位于意大利威尼托大区维罗纳市周边。三个采样时间点分别为转色期（V），代表葡萄成熟的开始；中期成熟（MR）；以及成熟浆果期（R）。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 制备浆果粉末提取物，分析代谢物并处理数据

  1. 制备用于分析的浆果粉样品。
    1. 在室温下，将浆果样品加入三倍体积（w/v）含0.1%（v/v）甲酸的甲醇溶液，于40 kHz超声水浴中提取15 min，制备代谢物提取液。使用液相色谱-质谱级水和甲酸，以及高效液相色谱级甲醇。
    2. 在 16,000 x g 条件下，4 °C 离心提取物 10 分钟 4 °C.
    3. 将步骤2.1.2中的上清液用两倍体积（v/v）的去离子水稀释，并通过0.2-µm 过滤器
  2. 采用HPLC-ESI-MS分析浆果提取物。
    1. 根据供应商的建议设置 HPLC-ESI-MS 系统。
      注意：本案例研究中，实验装置包括配备自动进样器的高效液相色谱系统，该系统通过在线连接方式与离子阱质谱仪及电喷雾电离源相连。
    2. 将高效液相色谱系统连接至C18保护柱（7.5 x 2.1 mm）2）和反相C18色谱柱（150 x 2.1 mm2，粒径 3 µm).
    3. 配制用作流动相的溶剂。A相为含5%（v/v）乙腈和0.5%（v/v）甲酸的水溶液，B相为100%乙腈。使用液相色谱-质谱级的乙腈、水和甲酸。
    4. 以0.2 ml/min的恒定流速，使用溶剂A和B进行线性梯度洗脱的HPLC分离-1 使用样品进样体积为 30 µl.
      1. 首先用100%溶剂A平衡色谱柱。进样后，建立梯度洗脱程序：0至5分钟内，溶剂B从0%升至10%；5至25分钟内，溶剂B从10%升至20%；25至30分钟内，溶剂B从20%升至25%；30至45分钟内，溶剂B从25%升至70%。
      2. 每个样本进行双份分析。随机化样本分析顺序，以避免仪器因素导致的干扰。每次分析之间用100%溶剂A重新平衡系统，时间为20分钟。
    5. 以交替的负离子和正离子电离模式采集质谱。针对本案例研究中描述的结果，参数设置如下 表2精确的仪器设置取决于特定的平台。
      注意：也可根据特定平台选择其他适用的方法。
      1. 在所有情况下，与任何分离平台一样，必须确保使用适当的重新平衡时间，以保证保留时间的重现性。当样品数量较多（超过10个样品）时，应将样品分为每批9至10个进行分析，并在每批之间运行色谱柱清洗程序（两种洗脱溶剂之间的缓慢梯度）。为获得足够的保留时间重现性，应确保每批的第一个色谱分析为空白分析（即，溶剂的分析）。
    6. 同时在碎裂的负离子和正离子模式下采集质谱，设置碎裂参数（两种离子前体，MS3）。通过碎裂树分析（MS/MS 和 MS3按照制造商说明书操作。
      注意：此方法特别适用于植物代谢物，因为植物代谢物常发生糖基化，因此第一级碎裂（MS/MS）通常会脱去糖基，生成游离的苷元离子，随后的碎裂（MS3有助于通过比对真实标准品数据库来鉴定苷元。
    7. 获取 MS/MS 和 MS3 光谱在 m/z 范围50-1,500，碎裂振幅为1 V。或者，可根据特定平台选用其他合适的方法。
    8. 每个 m/z 信号，比较 MS/MS 和 MS3 根据制造商说明，将碎片化模式和保留时间与真实标准品数据库进行比对。
      注意：许多类型的平台均包含通过分析真实标准品来构建此类文库的软件功能。这可以识别出大量信号，但并非所有信号都会被注释。
    9. 对于其余的匿名信号，比较其 MS/MS 与 MS3 碎片化模式与文献中已发表的数据进行比对，搜索质荷比（m/z）值（即，输入“m/z 353”以查找提及具有该m/z值分子的文献）结合任何一种可免费使用的常见搜索引擎进行检索，或使用在线数据库，如MassBank（www.massbank.jp/en/database.html）和人类代谢组数据库（www.hmdb.ca/search/spectra?type=ms_search）。
质谱仪组件功能参数
电喷雾电离源雾化气体50 psi, 350 °C
干燥气体10 L min-1
离子阱与检测器扫描全扫描模式，13,000 m/z 每秒，范围 50–1,500 m/z
目标质量400 m/z
碰撞气体氦气
真空压力1.4 × 10-5 mbar
毛细管电离源+4,000 V
末端板偏压−500 V
锥孔电极−40 V
毛细管出口−121 V
八极杆 1 直流电压−12 V
八极杆 2 直流电压−1.7 V
透镜 1+5 V
透镜 2+60 V
正离子化模式下的 ICC20.000
负离子化模式下的 ICC7,000

表2：获取质谱的主要参数设置。

操作选择功能参数数值
峰检测质量检测质心法噪声水平3,500
色谱图构建器最高数据点最短时间跨度0.15
最小高度4,000
m/z 容差0.3
峰检测峰解卷积局部最小值搜索色谱阈值70
在保留时间范围内搜索最小值（分钟）0:50
最小相对高度15%
最小绝对高度4,000
峰顶/峰边缘的最小比值2
持续时间范围（分钟）0-10
同位素同位素峰分组器 -m/z 容差1.2
保留时间容差0:50
单调形状否
最大电荷数3
代表性同位素否
对齐联合对齐器 -m/z 容差1.2
m/z 权重10
保留时间容差0:50
保留时间权重5
要求相同电荷态否
要求相同标识否
比较同位素模式否
空缺填补峰查找器 -强度容差20%
m/z 容差0.9
保留时间容差0:40
保留时间校正否
过滤重复峰过滤器 -m/z 容差1.2
保留时间容差0:30
要求相同鉴定结果否

表3：使用特定参数处理葡萄果实负离子模式LC-MS数据文件的Mzmine工作流程。

  1. 处理LC-MS数据。
    1. 获取或下载一种数据处理软件包，该软件包能够从大量原始色谱图中提取相关信息，并构建一个数据矩阵，其中每个检测到的代谢物在各样本中均被定量。
      注意：以下方案步骤专为开源软件 MZmine v2.14（http://mzmine.sourceforge.net）设计。该软件是一款用于质谱数据处理的开源工具，主要侧重于液相色谱-质谱（LC-MS）数据。27
    2. 使用设备制造商提供的软件将LC-MS色谱数据转换为netCDF格式。本文所述结果采用Bruker Daltonics Esquire v5.2和Data Analysis v3.2软件，并按照制造商提供的操作说明进行步骤处理。
      注意：可使用其他转换器（有多种免费转换器可供选择）。
    3. 导入 .cdf 将文件导入软件。
    4. 使用文中报告的参数执行峰检测、峰对齐、空缺填补及峰过滤步骤 表3.
      1. 第一步，选择一个已导入的 .cdf 文件，然后转到“可视化”→“TIC/XIC 视图器”。将光标置于色谱图中最小峰的基部，记录基部离子的最低强度信号。然后转到“原始数据方法”→“峰检测”。
      2. 选择质量检测，为每次扫描填充用于检测单个离子的信号水平，并生成离子列表。
        注意：在进行质谱检测之前，请检查算法——这取决于所使用的质谱仪。在本实验中，我们选择Centroid模式。
      3. 选择色谱图构建器，并通过连接离子列表中的数据点来填充信号水平，为每个质荷比值构建色谱图。请参考质谱仪手册中指定的参数，调整最小时间跨度（Min Time Span）和 m/z 耐受性
      4. 接下来，进入峰列表方法 → 峰检测 → 色谱图解卷积。选择合适的算法（此处为局部最小值搜索），以将每个色谱图分离为独立的峰。
      5. 手动检查色谱图，以确定以下参数的适当数值。将色谱阈值设为30%，以去除噪声；将保留时间范围内的搜索最小值设为2（min），以识别局部最小值的存在，从而区分两个峰。
      6. 将最小相对高度设为 2.0。手动检查色谱图，确定对应于峰而非背景信号的最小绝对高度值，并将该值设为绝对高度（例如，本实验中为 10,000）。
      7. 将峰顶/边缘的最小比值设为1.1，以定义一个峰被识别为真实峰时，其峰顶与峰最低数据点强度之间的最小比值。
      8. 手动检查色谱图，确定在所用色谱条件下各峰的最短持续时间（例如，在本实验中根据化合物不同介于 0.2 至 2 分钟之间），并据此将这些数值用作峰持续时间范围（min），以设定可接受峰长的持续时间范围。
      9. 然后转到峰列表方法 → 同位素 → 同位素峰聚类，以将同位素归为一个峰，通常归入强度最高的峰。注意：参数设置取决于质谱仪的分辨率以及保留时间的重现性。
      10. 最后，进入峰列表方法 → 比对 → 合并比对器，以根据峰的特征进行比对 m/z 并通过匹配评分确定保留时间。
    5. 在对齐峰后，通过点击“峰列表方法”→“填补空缺”→“峰检测器”来填补数据空缺。最后，通过点击“峰列表方法”→“过滤”→“重复峰过滤器”来过滤重复的数据点。
    6. 将生成的数据集导出为 .csv 文件。
    7. 手动更改 .csv 延伸至 .txt 扩展。如果文件扩展名不可见，请更改计算机设置以显示文件扩展名。进入文件夹选项 → 查看 → 高级设置，取消勾选“隐藏已知文件类型的扩展名”选项。
    8. 导入 .txt 将文件导入电子表格。由此生成一个数据矩阵，其中包含通过编号识别的所有检测到的代谢物， m/z 通过峰面积值对所有样品中的值和保留时间进行定量。

3. 为转录组分析制备浆果粉末提取物并处理数据

  1. 提取浆果样品的总 RNA 并测定 RNA 质量。
    1. 提取浆果样品的总 RNA。
      注意：在本案例研究中，使用了一种专有试剂盒及经过改良的实验流程，以确保完全去除干扰 RNA 分析的分子（如多糖和多酚）。以下说明专用于该试剂盒18。
      1. 称取每份样品 400 mg 浆果粉末，将其分为两份，每份 200 mg，分别放入两个微量离心管中。
      2. 向每 200 mg 粉末中加入 900 µl 含 β-巯基乙醇的裂解液（试剂盒提供），立即剧烈涡旋至少 30 秒。将样品在 56 °C 下加热 5 分钟，同时以 800 rpm 摇动。
      3. 将样品在台式微量离心机中以最大转速离心 10 分钟，沉淀细胞碎片。
      4. 用移液器将 700 µl 上清液转移至试剂盒提供的过滤柱（蓝色固定环）中，该柱置于 2 ml 收集管内。盖上盖子，在台式微量离心机中以最大转速离心 1 分钟，以去除残留碎片。使用同一过滤柱但更换新的收集管重复此步骤两次，最终得到三个管，每管含有约 700 µl 澄清裂解液。
      5. 向每管澄清裂解液中加入 750 µl 结合液（试剂盒提供），立即通过上下吹打至少五次充分混匀。将 700 µl 混合液转移至试剂盒提供的结合柱（红色固定环）中，该柱置于 2 ml 收集管内。盖上盖子，在台式微量离心机中以最大转速离心 1 分钟，使 RNA 结合到柱上。
      6. 倾去穿流液，将收集管倒置并在吸水纸上轻拍数秒，以排尽残留液体。
      7. 将柱重新放回收集管中，将剩余混合液加入同一结合柱中，并重复离心和倾倒步骤。重复操作，直至全部混合液均通过同一红色结合柱过滤。
      8. 随后按照试剂盒说明书的其余步骤操作，用 50 µl 洗脱缓冲液（试剂盒提供）洗脱 RNA，并于 -80 °C 保存，以备后续质量控制步骤使用。
    2. 使用分光光度计测定 RNA 的浓度和纯度。记录吸光度比值，以评估蛋白质（A260/280）和多酚/多糖（A260/230）的污染程度。
      注意：适用于微阵列杂交的 RNA，其两个比值均应至少达到 1.8。
    3. 测定 RNA 的完整性。
      注意：可使用多种系统进行检测。本案例研究中采用了一种数字信号采集系统，结合荧光染料进行毛细管电泳分析。适用于微阵列杂交的 RNA，其 RNA 完整性数值（RIN）应至少为 8。
  2. 制备样品并将 RNA 杂交至定制微阵列。
    1. 将微阵列分析的总 RNA 起始量设定为 200 ng，通过加入去离子无 RNase 水稀释步骤 3.1.1.8 所得 RNA 溶液实现。将适量 RNA 加入 1.5 ml 微量离心管中，终体积为 1.5 µl。
    2. 向每个 RNA 样品中加入 2 µl 稀释的 spike 混合液，并按照制造商说明书合成第一链 cDNA，将其转录为 cRNA，并用氰基 3CTP 标记 cRNA。
    3. 根据制造商说明书纯化标记后的 cRNA，并用 30 µl 无 RNase 水洗脱。
    4. 使用分光光度计测定每份 cRNA 的产量和比活性，记录三个数值：氰基 3 染料浓度（pmol µl-1）、RNA 纯度（A260/280）和 cRNA 浓度（ng µl-1）。使用制造商说明书中的公式计算 cRNA 产量（µg）和比活性（pmol Cy3 每 µg cRNA）。
      注意：推荐的产量和比活性因具体微阵列格式而异。本案例研究选用 4 片装 44K 格式，推荐产量为 1.65 µg，比活性为 9 pmol Cy3/µg cRNA。
    5. 使用合适的探针设计软件设计定制微阵列。
      1. 为实现本案例研究所描述的结果，设计一种新的定制微阵列，基于 4 片装 44K 格式，使用基于网络的定制微阵列设计工具和寡核苷酸文库。设计探针以匹配 34,651 个目标转录本，包括来自 Pinot noir V1 芯片的 29,971 个预测转录本、通过 Corvina 转录组重建在 Pinot 品种中鉴定出的 4,500 个新位点，以及 180 个 Corvina 特有基因25。
        注意：此过程涉及生成 34,651 条特异性 60-mer 探针，包括 29,798 条 Pinot noir 预测转录本、4,392 条新的 Pinot 位点和 179 条 Corvina 特有基因。
    6. 根据 4 片装格式规范制备杂交体系，步骤如下。
      1. 将 1.65 µg Cy3 标记的 cRNA 置于终体积为 41.8 µl 的去离子无 RNase 水中。加入 11 µl 10x 封闭剂和 2.2 µl 25x 片段化缓冲液。在 60°C 恒温水浴中孵育 30 分钟以片段化 RNA。立即在冰上冷却 1 分钟。
      2. 最后加入 55 µl 2x 杂交缓冲液，通过移液充分混匀，并在室温下以 15,500 x g 离心 1 分钟。迅速将微量离心管置于冰上，立即使用，不得储存。
    7. 按以下步骤加载定制微阵列。
      1. 将带有标签朝上的垫片玻片装入杂交室底部。缓慢将步骤 3.2.6.2 所得 100 µl 杂交样品加入每个垫片孔中，使用移液器尖端加样，避免产生气泡。
      2. 将定制微阵列缓慢倒置放置，确保数字条形码朝上。确认夹心结构正确对齐。最后将杂交室盖子盖上，并用手拧紧夹具。旋转组装好的杂交室，观察气泡移动情况。
    8. 将组装好的玻片室放入杂交炉内的旋转架中，设定温度为 65 °C，转速为 10 rpm。杂交反应持续 17 小时。
    9. 按以下步骤进行微阵列玻片洗涤。
      1. 首先准备三个玻片染色皿，分别加入适当的洗涤缓冲液：两个皿中加入室温的洗涤缓冲液 1，一个皿中加入预热（37 °C）的洗涤缓冲液 2。
      2. 拆开杂交室并取出夹心结构。将微阵列玻片数字条形码朝上，将其浸入第一个装有室温洗涤缓冲液 1 的染色皿中，借助干净镊子将垫片与微阵列玻片分离。迅速将微阵列玻片转移至玻片架中，并放入第二个装有室温洗涤缓冲液 1 的染色皿中。
      3. 将染色皿置于磁力搅拌器上，中等搅拌洗涤 1 分钟。迅速将玻片架转移至第三个装有预热（37 °C）洗涤缓冲液 2 的染色皿中，同样中等搅拌洗涤 1 分钟。
      4. 缓慢从染色皿中取出玻片架，并小心取出玻片，避免产生液滴。
        注意：洗涤缓冲液中不得添加 Triton X-102，且省略乙腈洗涤步骤。
    10. 将洗涤后的芯片避光、室温保存。
  3. 扫描微阵列并提取关键特征。
    1. 将微阵列玻片放入合适的扫描仪中，按照微阵列制造商说明书推荐的参数设置扫描每个阵列。为实现本研究所述结果，将每张微阵列玻片放入玻片架中，以方便扫描操作。
    2. 将输出的 .shp 文件导入适当的软件中，该软件能够将数字信号转换为数值型荧光信号。检查质量控制报告，确保杂交过程成功。
      1. 为实现本研究所述结果，使用特征提取软件说明书推荐的参数设置，并检查质量控制报告，确保 表 4 所列参数处于制造商规定的正常范围内。
指标名称上限下限描述
AnyColorPrcntFeatNonUnif1.00NA在任一通道中表现为特征非均匀性离群值的特征所占百分比
DetectionLimit2.000.10低于线性浓度范围的加标样本的平均值加1个标准差
absGE1E1aSlope1.200.90E1a探针信号与浓度拟合曲线斜率的绝对值
MedCVProcSignal8.00NA处理后信号的中位数%CV
gNegCtrlAveBGSubSig5.00-10.00所有正常负对照的背景校正后信号的平均值（BGSubSignal通过从特征平均信号中减去称为BGUsed的值计算得出）
gNegCtrlAveNetSig40.00NA所有正常负对照的净信号的平均值
gNegCtrlSDevBGSubSig10.00NA所有正常负对照的背景校正后信号的标准差
gNonCntrlMedCVProcSignal8.00NA非对照探针处理后信号的中位数%CV
gSpatialDetrendRMSFilter15.00NA背景去趋势拟合的残差

表4：用于验证微阵列杂交质量需检查的主要参数。

  1. 处理微阵列数据。
    1. 在完成所有微阵列芯片的扫描并确认质量控制结果合格后，通过选择 gProcessedSignal 每个单个子阵列结果文件中的数值，代表各探针的原始荧光强度。
    2. 在电子表格中，对 75 进行数据归一化处理th 每个芯片内的百分位数P 值），并计算所有值的平均值 P 所有不同子数组间的值用于计算 R 比率。
    3. 然后，在同一张电子表格中，对每一个进行归一化处理 gProcessedSignal 价值于 R 其自身子数组的比值。

4. 对代谢组学和转录组学数据进行详细的统计分析

  1. 准备统计分析软件。
    注意：在本案例研究中，使用了能够执行主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交双正交偏最小二乘判别分析（O2PLS-DA）的软件。
    1. 导入代谢组学和转录组学数据。进入 文件 → 新建常规项目 → 新建常规项目，以导入使用 MZmine 软件获得的数据矩阵。然后点击 编辑 → 转置整个矩阵 → 主页，并分配适当的主 ID 和次级 ID → 完成。
    2. 对数据进行均值中心化处理，并使用帕累托（pareto）缩放方法进行标准化。在主页窗口中，进入 编辑 → M1，根据数据情况更改相应的参数。对于本文描述的结果，将 缩放（Scale） 从单位方差（Unit Variance）更改为帕累托（Par）。
    3. 使用单位方差（Unit Variance）设置对转录组学数据进行标准化。
  2. 执行多变量统计分析。
    1. 按照图2所示实施主成分分析（PCA）。在本案例研究中，PCA揭示了样本之间的主要差异，反映了不同的成熟阶段和生长季节。
      1. 在工作集（Workset）窗口中，选择 PCA-X 作为模型类型。点击自动拟合（Autofit）。注意 R2X(cum) 和 Q2(cum) 的数值，它们反映了模型的质量。
        注意：通常情况下，数值越高表示模型越好，但 R2X(cum) 值过高的模型可能存在过拟合现象。根据经验法则，当 Q2(cum) 值开始下降时，应停止增加主成分数量。
      2. 然后选择 得分（Scores） → 散点图（Scatter），查看显示样本可能聚类情况的图表。
      3. 检查 PCA 得分图。如果获得了良好的模型（Q2cum > 0.5），则使用相同的样本分类构建 O2PLS-DA 模型（步骤 4.2.2）。
    2. 使用按宏观区域分类的样本构建两个 O2PLS-DA 模型，并通过包含 200 次置换的置换检验对模型进行验证。
      1. 通过进入 主页窗口 → 新建为（New As） → M1 → 观测值（Observations） 来分配类别。设置所需的类别。然后将 模型类型（Model Type） 从 PCA-X 更改为 O2PLS-DA。点击自动拟合（Autofit）。确保 PLS-DA 模型的组分数与 O2PLS-DA 模型相同。
      2. 为验证 O2PLS-DA 模型，进入 分析（Analyze） → CV-ANOVA，查看右侧的 p 值。此外，在主页窗口中点击 新建为（New As） → M2，并将 模型类型 从 O2PLS-DA 更改为 PLS-DA。点击自动拟合。
      3. 进入 分析（Analyze） → 置换（Permutations），执行 200 次置换（取消选中“重新计算置换”选项）。
        注意：最终输出显示一个窗口，其中 R2 值通常应在 Y 轴上低于 0.4 处相交，而 Q2 应与 Y 轴的负半部分相交。如果 R2 和/或 Q2 值不正确，应减少 PLS-DA 和 O2PLS-DA 模型中的组分数。
      4. 在项目窗口中选择 M2，点击 得分（Scores） → 散点图（Scatter），查看图表及样本类别的位置。要观察哪些代谢物表征一个或多个特定类别，请进入 图表/列表（Plot/List） → 散点图（Scatter）。
      5. 将 数据类型选择（Select Data Type） 更改为 观测值和载荷（Observations and Loadings） → 添加系列（Add Series），并将 X 轴和系列中的项目分别修改为 pq(corr)，预测组分（Pred Comp）设为 1，当存在更多组分时，分别设为 2 或更高。
      6. 在图表上按住鼠标右键，进入 属性（Property） → 颜色（Color），选择“按术语”（By Terms）以区分分子和类别的图示符号。进入 布局（Layout） → 格式化图表（Format Plot） → 坐标轴和/或样式（Axis and/or Styles），根据需要修改图表特征。
    3. 根据代谢组学 O2PLS-DA 分析结果，以柱状图形式展示特定代谢物或代谢物类别相对水平的差异。
    4. 根据转录组学 O2PLS-DA 分析结果，检索并将差异调控的基因归类至基因本体（Gene Ontology, GO）分类28。
    5. 手动识别代谢物水平与基因表达之间的关系。

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结果

本文所述案例研究获得了一个最终的数据矩阵，共包含552个信号（m/z 特征），包括分子离子及其同位素、加合物和部分碎片，在189个样品（7个葡萄园 × 3个成熟阶段 × 3个生长季 × 3个生物学重复）中进行了相对定量。因此，数据点的总数为104,328。通过断裂树分析，共注释了282个m/z特征，对应于代谢物及其加合物、同位素和碎片。对整个数据矩阵进行主成分分析（PCA）的探索性分析显示，样品在第一和第二主成分（t1-t2，图2A）上按成熟阶段（转色期、中期成熟和成熟期）聚类，而在第三主成分（t1-t3，图2B）上按生长季聚类。

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讨论

本文描述了用于解读葡萄果实风土概念的代谢组学、转录组学及统计分析方案。采用高效液相色谱-电喷雾电离质谱（HPLC-ESI-MS）进行代谢组学分析，其灵敏度足以同时检测大量代谢物，但相对定量结果会受到基质效应以及离子抑制/增强的影响。然而，已有类似方法被用于描述科维纳（Corvina）葡萄果实的成熟过程及采后萎蔫过程，且对基质效应的校正对最终结果影响有限5。此外，最近一项大规模、多仪器、多实验室联合研究采用相同样品，比较了核磁共振（NMR）与液相色谱-质谱联用（LC-MS）在非靶向代谢组学中的稳健性，结果表明不同仪器和技术所得结果具有一致性6。本文所述案例研究涵盖了三个生长季中，来自三个宏观产区共七个葡萄园的葡萄果实，在三个成熟阶段的样品采集与分析。本研究在宏观产区层面（加尔达湖和索阿韦各包含两个葡萄园，瓦尔波利切拉包含三个葡萄园）采用主成分分析（PCA）和正交双偏最小二乘判别分析（O2PLS-DA）等多元统计方法探究风土特征。不同葡萄园之间的差异更为细微，需采用更复杂且更敏感的统计方法才能有效识别10。所提出方案中的多个步骤至关重要，在回答有关风土对葡萄品质影响的生物学问...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得益于欧盟资助的COST行动FA1106“通过整合系统方法确定番茄和葡萄果实品质发育调控机制”的协调网络活动。本研究由卡里韦罗纳银行基金会资助的“植物功能基因组学中心完善”项目以及由意大利农业和林业政策部资助的“主要意大利本土葡萄品种及其风土（Vigneto）的价值提升”项目支持。SDS由意大利大学与研究部FIRB RBFR13GHC5项目“葡萄树在基因型与环境互作中的表观基因组可塑性”资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
研磨机IKAIKA A11 basic
HPLC自动进样器Beckman Coulter -System Gold 508 Autosampler
HPLC系统Beckman Coulter -System Gold 127 Solvent Module HPLC
C18保护柱Grace -Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column
C18色谱柱Grace -Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
质谱仪Bruker Daltonics -Bruker Esquire 6000；质谱仪配备ESI离子源，分析器为离子阱。
提取溶剂和HPLC缓冲液Sigma34966甲醇 LC-MS级
Sigma94318甲酸 LC-MS级
Sigma34967乙腈 LC-MS级
Sigma39253水  LC-MS级
Minisart RC 4 注射器滤器 (0.2 μm)Sartorius17764
数据采集 (a) 和处理 (b) 软件Bruker Daltonics-Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a)；Esquire 3.2 数据分析和MzMine 2.2软件 (b)
Spectrum植物总RNA试剂盒Sigma-AldrichSTRN250-1KT用于葡萄果皮总RNA提取
Nanodrop 1000Thermo Scientific1000
BioAnalyzer 2100Agilent TechnologiesG2939A
RNA 6000 Nano试剂Agilent Technologies5067-1511
RNA芯片Agilent Technologies5067-1511
Agilent基因表达洗涤缓冲液1Agilent Technologies5188-5325
Agilent基因表达洗涤缓冲液2Agilent Technologies5188-5326
低输入快速扩增标记试剂盒 单色Agilent Technologies5190-2305
试剂盒RNA Spike In - 单色Agilent Technologies5188-5282
基因表达杂交试剂盒Agilent Technologies5188-5242
RNeasy Mini Kit (50)Qiagen74104用于cRNA纯化
Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer 微阵列芯片Agilent TechnologiesG2514F-048771 
eArrayAgilent Technologies-https://earray.chem.agilent.com/earray/
垫片载玻片Agilent TechnologiesG2534-60012用于实现Agilent SurePrint微阵列四重杂交
恒温水浴锅Julabo-
杂交室Agilent TechnologiesG2534-60001
微阵列杂交炉Agilent TechnologiesG2545A
杂交炉旋转架Agilent TechnologiesG2530-60029
旋转架转换杆Agilent TechnologiesG2530-60030
染色试剂盒Bio-Optica10-2000载玻片染色皿和载玻片架
磁力搅拌装置AREX加热磁力搅拌器F20540163 
恒温烘箱Thermo ScientificHeraeus - 6030
Agilent微阵列扫描仪Agilent TechnologiesG2565CA
扫描仪转盘，48位Agilent TechnologiesG2505-60502
载玻片架Agilent TechnologiesG2505-60525
特征提取软件 v11.5Agilent Technologies-集成于Agilent微阵列扫描仪G2565CA中
SIMCA + V13软件Umetrics

参考文献

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风土概念通过葡萄果实代谢组学与转录组学的解析
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