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方法文章

风土概念通过葡萄果实代谢组学与转录组学的解析

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DOI：

10.3791/54410

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2016年10月5日

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1Biotechnology Department, University of Verona, 2Lab. of Bioorganic Chemistry, Physics Department, University of Trento, 3S-IN Soluzioni Informatiche

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了非靶向代谢组学、转录组学及多变量统计分析在葡萄果实转录本和代谢物研究中的应用，旨在深入理解风土（terroir）概念。 即环境对浆果品质性状的影响。

摘要

风土（terroir）是指一系列环境因素的综合作用，这些因素会因特定生境和管理方式的不同而影响作物（如葡萄藤（Vitis vinifera））的特征。本文展示了如何通过多元统计分析方法，在科维纳（Corvina）葡萄品种的果实代谢组和转录组中检测到特定的风土特征。该方法首先需要制定合理的采样方案。在本案例中，为尽量减少遗传差异，选用了科维纳品种的一个特定克隆，并在三个不同生长季期间，从代表三个不同大区的七个葡萄园采集样品。推荐采用非靶向液相色谱-质谱（LC-MS）代谢组学方法，因其具有高灵敏度，同时结合使用MZmine软件进行高效的数据处理，以及基于碎片树分析的代谢物鉴定策略。通过包含覆盖约99%所有预测葡萄基因探针的微阵列，可实现全面的转录组分析，从而在不同风土背景下同时分析所有差异表达基因。最后，可采用基于投影法的多元数据分析方法，以克服年份效应的强烈干扰，实现代谢组学与转录组学数据的整合与深入分析，进而识别出具有信息价值的相关性。

引言

基于植物基因组、转录组、蛋白质组和代谢组的大规模数据分析，为理解复杂系统的行为提供了前所未有的洞察，例如葡萄酒的风土特征，其反映了葡萄植株与其环境之间的相互作用。由于即使在同一葡萄克隆种植于不同葡萄园时，葡萄酒的风土特征仍可能存在差异，因此基因组分析作用有限，因为克隆间的基因组是相同的。相反，有必要研究基因表达与果实代谢特性之间的相关性，这些特性决定了葡萄酒的品质特征。在转录组水平上进行基因表达分析得益于所有转录本相似的化学性质，这使得可以通过利用诸如微阵列上固定探针的杂交等通用特性来实现定量分析。相比之下，由于单个蛋白质和代谢物在物理和化学性质上具有巨大的多样性，蛋白质组学和代谢组学中的通用分析方法更具挑战性。在代谢组学中，这种多样性尤为显著，因为单个代谢物在大小、极性、丰度和挥发性方面差异极大，因此目前尚无单一的提取流程或分析方法能够提供全面的整体性研究方案。

在适用于非挥发性代谢物的分析平台中，基于高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）的方法比其他替代技术（如配备紫外检测器或二极管阵列检测器的高效液相色谱法（HPLC-UV、HPLC-DAD）或核磁共振（NMR）波谱法）具有更高的灵敏度，但HPLC-MS的定量分析可能受到基质效应及离子抑制/增强等现象的影响1-3。在利用电喷雾离子源的高效液相色谱-质谱法（HPLC-ESI-MS）分析科维纳葡萄果实的过程中，研究发现保留时间最短的糖类及其他分子被严重低估，这可能也反映了该保留时间区域中分子数量众....

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方案

1. 选择合适的材料并制定采样方案

  1. 首先制定合适的采样方案。由于不存在通用的通用方法，因此需针对每个方案进行个案评估。确保采样方案明确说明采样地点、采样时间及具体的采样程序。本案例研究中所用的采样方案见图1。
    ​注：在本案例研究中，葡萄果实采自意大利维罗纳省三个不同大区（加尔达湖、瓦尔波利切拉和索阿韦）的七个商业葡萄园，品种为单一克隆（Vitis vinifera cv. Corvina，克隆48）。各葡萄园的主要特征总结于表1。样品在三个生长季（2006年、2007年和2008年）的三个时间点采集，分别对应转色期（成熟开始）、中期成熟和完全成熟期。
    1. 针对每个样本（葡萄园/年份/成熟阶段），从两行葡萄藤的不同位置随机采集30个果穗，植株上的高度和位置需随机化。
    2. 从每个果穗中随机选取三个果实，避免选择有明显损伤和/或感染迹象的果实。
    3. 重复步骤1.1.1和1.1.2，以获得三个独立的样本池。
    4. 去除果实种子，并立即将果皮在液氮中速冻。
    5. 使用自动研磨机将每个样本池中的10个冷冻果实研磨成粉，将每份粉末样品均分为两份，一份用于转录组学分析，另一份用于代谢组学分析。
    6. 将粉末样品在-80 °C下保存。

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结果

本文所述案例研究获得了一个最终的数据矩阵，共包含552个信号（m/z 特征），包括分子离子及其同位素、加合物和部分碎片，在189个样品（7个葡萄园 × 3个成熟阶段 × 3个生长季 × 3个生物学重复）中进行了相对定量。因此，数据点的总数为104,328。通过断裂树分析，共注释了282个m/z特征，对应于代谢物及其加合物、同位素和碎片。对整个数据矩阵进行主成分分析（PCA）的探索性分析显示，样品在第一和第二主成分（t1-t2，图2A）上按成熟阶段（转色期、中期成熟和成熟期）聚类，而在第三主成分（t1-t3，图2B）上按生长季聚类。

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讨论

本文描述了用于解读葡萄果实风土概念的代谢组学、转录组学及统计分析方案。采用高效液相色谱-电喷雾电离质谱（HPLC-ESI-MS）进行代谢组学分析，其灵敏度足以同时检测大量代谢物，但相对定量结果会受到基质效应以及离子抑制/增强的影响。然而，已有类似方法被用于描述科维纳（Corvina）葡萄果实的成熟过程及采后萎蔫过程，且对基质效应的校正对最终结果影响有限5。此外，最近一项大规模、多仪器、多实验室联合研究采用相同样品，比较了核磁共振（NMR）与液相色谱-质谱联用（LC-MS）在非靶向代谢组学中的稳健性，结果表明不同仪器和技术所得结果具有一致性6。本文所述案例研究涵盖了三个生长季中，来自三个宏观产区共七个葡萄园的葡萄果实，在三个成熟阶段的样品采集与分析。本研究在宏观产区层面（加尔达湖和索阿韦各包含两个葡萄园，瓦尔波利切拉包含三个葡萄园）采用主成分分析（PCA）和正交双偏最小二乘判别分析（O2PLS-DA）等多元统计方法探究风土特征。不同葡萄园之间的差异更为细微，需采用更复杂且更敏感的统计方法才能有效识别10。所提出方案中的多个步骤至关重要，在回答有关风土对葡萄品质影响的生物学问.......

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得益于欧盟资助的COST行动FA1106“通过整合系统方法确定番茄和葡萄果实品质发育调控机制”的协调网络活动。本研究由卡里韦罗纳银行基金会资助的“植物功能基因组学中心完善”项目以及由意大利农业和林业政策部资助的“主要意大利本土葡萄品种及其风土（Vigneto）的价值提升”项目支持。SDS由意大利大学与研究部FIRB RBFR13GHC5项目“葡萄树在基因型与环境互作中的表观基因组可塑性”资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
研磨机IKAIKA A11 basic
HPLC自动进样器Beckman Coulter -System Gold 508 Autosampler
HPLC系统Beckman Coulter -System Gold 127 Solvent Module HPLC
C18保护柱Grace -Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column
C18色谱柱Grace -Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
质谱仪Bruker Daltonics -Bruker Esquire 6000；质谱仪配备ESI离子源，分析器为离子阱。
提取溶剂和HPLC缓冲液Sigma34966甲醇 LC-MS级
Sigma94318甲酸 LC-MS级
Sigma34967乙腈 LC-MS级
Sigma39253水  LC-MS级
Minisart RC 4 注射器滤器 (0.2 μm)Sartorius17764
数据采集 (a) 和处理 (b) 软件Bruker Daltonics-Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a)；Esquire 3.2 数据分析和MzMine 2.2软件 (b)
Spectrum植物总RNA试剂盒Sigma-AldrichSTRN250-1KT用于葡萄果皮总RNA提取
Nanodrop 1000Thermo Scientific1000
BioAnalyzer 2100Agilent TechnologiesG2939A
RNA 6000 Nano试剂Agilent Technologies5067-1511
RNA芯片Agilent Technologies5067-1511
Agilent基因表达洗涤缓冲液1Agilent Technologies5188-5325
Agilent基因表达洗涤缓冲液2Agilent Technologies5188-5326
低输入快速扩增标记试剂盒 单色Agilent Technologies5190-2305
试剂盒RNA Spike In - 单色Agilent Technologies5188-5282
基因表达杂交试剂盒Agilent Technologies5188-5242
RNeasy Mini Kit (50)Qiagen74104用于cRNA纯化
Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer 微阵列芯片Agilent TechnologiesG2514F-048771 
eArrayAgilent Technologies-https://earray.chem.agilent.com/earray/
垫片载玻片Agilent TechnologiesG2534-60012用于实现Agilent SurePrint微阵列四重杂交
恒温水浴锅Julabo-
杂交室Agilent TechnologiesG2534-60001
微阵列杂交炉Agilent TechnologiesG2545A
杂交炉旋转架Agilent TechnologiesG2530-60029
旋转架转换杆Agilent TechnologiesG2530-60030
染色试剂盒Bio-Optica10-2000载玻片染色皿和载玻片架
磁力搅拌装置AREX加热磁力搅拌器F20540163 
恒温烘箱Thermo ScientificHeraeus - 6030
Agilent微阵列扫描仪Agilent TechnologiesG2565CA
扫描仪转盘，48位Agilent TechnologiesG2505-60502
载玻片架Agilent TechnologiesG2505-60525
特征提取软件 v11.5Agilent Technologies-集成于Agilent微阵列扫描仪G2565CA中
SIMCA + V13软件Umetrics

参考文献

  1. Jessome, L. L., Volmer, D. A. Ion suppression: A major concern in mass spectrometry. Lc Gc N Am. 24 (5), 498-510 (2006).
  2. Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go? Trends Biotech. 29 (6), 267-275 (2011....

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