高度均一的聚(N-异丙基丙烯酰胺)微凝胶的可控合成与荧光示踪

摘要

非搅拌沉淀聚合法提供了一种快速、可重复的原型制备方法，可用于合成粒径分布窄且对刺激敏感的聚（N-异丙基丙烯酰胺）微凝胶。本实验方案展示了在此类微凝胶合成过程中，利用宽场显微镜系统进行光散射表征及单颗粒荧光追踪的方法。

摘要

对刺激敏感的聚(N-异丙基丙烯酰胺)（PNIPAM）微凝胶在基础研究和多种潜在实际应用中具有重要意义。本研究以荧光标记的PNIPAM微凝胶的单颗粒追踪为例，展示如何通过一种快速非搅拌沉淀聚合法调控微凝胶的尺寸。该方法特别适用于新型反应组分与条件的原型开发，或对产物用量要求不高的应用。本实验方案详细描述了微凝胶的合成过程，以及利用动态光散射和静态光散射测定颗粒尺寸与结构的方法。结果表明，引入功能性共聚单体对颗粒成核过程及最终结构具有显著影响。通过宽场荧光显微镜进行单颗粒追踪，可研究荧光标记的示踪微凝胶在未标记高浓度微凝胶基质中的扩散行为，而此类体系难以通过动态光散射等其他方法有效表征。

引言

刺激响应性聚(N-异丙基丙烯酰胺) (PNIPAM) 微凝胶^1,2在过去二十年中因其在多种智能应用中的潜力而持续受到关注。已展示的应用案例包括可切换的乳液稳定剂^3-8、微透镜⁹、便于细胞收获的细胞培养基底^10,11，以及用于小分子化合物和其他生物医学用途的智能载体¹²。从基础研究的角度来看，这些颗粒已被证明可用于研究胶体相互作用^13-15和聚合物-溶剂相互作用^16-18等课题。

在任何特定应用中成功使用PNIPAM微凝胶及其衍生物通常需要了解颗粒的平均粒径以及粒径分布的宽度。为了正确解读涉及PNIPAM微凝胶的实验结果，必须知晓可能受功能共聚单体影响的颗粒结构。动态光散射和静态光散射（DLS和SLS）特别适用于获取这些信息，因为这些方法快速且相对易于操作，并且能够在颗粒所处的原始环境（分散体系）中以非侵入方式探测其性质。DLS和SLS还能从大量颗粒中收集数据，避免了显微镜方法因样本量小而产生的偏差。因此，本工作的首要目标是为初次接触胶体表征的研究人员介绍光散射技术的良好实践规范。

通常，沉淀聚合在实验室规模下进行，而为特定颗粒性质寻找合适的反应条件可能十分耗时，且需要多次重复合成过程。与大规模批次合成不同，非搅拌沉淀聚合^19,20是一种快速的方法，可同时聚合不同反应物组成的小批量样品，从而获得粒径分布较窄的颗粒。同时进行的聚合反应可最大限度减少实验误差，且高通量的产出意味着能够快速确定适合放大反应的合适反应条件。因此，我们的第二个目标是展示非搅拌沉淀聚合在原型开发以及不需要大量产物的应用中的实用性。

在荧光标记的聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAM）微凝胶应用于胶体相互作用研究的实例中，合成与表征的多个方面得以结合。本文采用高精度的单颗粒追踪技术，研究了标记示踪微凝胶在未标记基质微凝胶分散体系中的扩散行为，涵盖广泛的基质浓度范围，并揭示了浓胶体分散体系中的笼效应。宽场荧光显微镜非常适用于此目的，因为它能够在大量可能不同的基质组分中，表征少数示踪分子的特定行为。这与动态光散射（DLS）、静态光散射（SLS）和流变学等技术形成对比，后者测量的是系统的整体平均性质，因此无法分辨大体系中少量探针颗粒的行为。此外，在本具体实例中，由于粒子浓度较高，导致强烈的多重散射，使任何标准分析失效，因此传统的光散射方法也无法使用。通过采用自动化数据处理和统计方法，即使对于单颗粒追踪技术，当在大样本量上进行平均时，也能实现对整个系统行为的分析。

方案

1. 微凝胶合成

注意：N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）通过正己烷重结晶纯化。其他试剂未经处理直接使用。

1. 聚(NIPAM)基质微凝胶的传统批次合成
   1. 在装有回流冷凝器、搅拌器和橡胶隔膜的500 ml三颈圆底烧瓶中，将1.8 g NIPAM和24 mg N,N'-双丙烯酰胺（BIS）溶于245 ml经0.2 µm再生纤维素（RC）膜滤器过滤的重蒸馏水中。
   2. 通过隔膜插入一支温度计和一根120 mm长的氮气进气针。
   3. 在搅拌下将溶液加热至60 °C，并通入氮气40分钟以去除溶液中的氧气。
   4. 同时，在5 ml过滤后的重蒸馏水中溶解155 mg过硫酸钾（KPS），并用氮气鼓泡以除去其中的氧气，制备引发剂溶液。
   5. 将全部5 ml KPS溶液转移至一支经氮气冲洗过的注射器中，并装上120 mm长的针头。
   6. 将氮气进气针提升至液面以上，通过橡胶隔膜迅速将KPS溶液注入反应器中。
   7. 在60 °C、持续通氮气和缓慢搅拌条件下，使聚合反应进行1小时。
   8. 使用布氏漏斗和滤纸趁热过滤反应液，以去除大颗粒聚集体，然后让分散液自然冷却。
   9. 将分散液在257,000 × g条件下离心并重新分散三次，每次40分钟，最后将沉淀物重新分散于最小可行体积的重蒸馏水中，通常为2–4 ml。
   10. 将分散液冷冻干燥后保存。
2. 非搅拌条件下荧光标记聚(NIPAM)微凝胶的合成
   1. 在玻璃容器中称取257.7 mg NIPAM、3.5 mg BIS和1.5 mg甲基丙烯酰氧乙基硫代氨基甲酰基罗丹明B（染料），加入10 ml过滤后的重蒸馏水。
   2. 将染料–单体溶液超声处理15分钟，以使染料充分溶于水中。
   3. 在另一个玻璃容器中制备不含染料的相同溶液。
   4. 使用不含染料的单体溶液对含染料的单体溶液进行系列稀释，获得不同染料浓度的浓度梯度。本研究中染料浓度范围为0.02–0.1 mmol/L。
   5. 将8.4 mg KPS溶于10 ml过滤后的重蒸馏水中，制备引发剂溶液。
   6. 取0.5 ml上述浓度梯度溶液与0.5 ml KPS溶液混合，加入直径为10 mm的试管中，用橡胶隔膜密封，得到最终反应溶液。
   7. 将连接至加热循环器的双层玻璃容器中的油浴预热至63 °C。
   8. 通过120 mm长的针头向各反应溶液中通入氮气20分钟，以去除氧气。
   9. 将试管插入浮置平台，并将平台浸入预热的油浴中，将温度设定为60 °C。由于室温下的反应溶液会降低油浴温度，因此初始油浴温度需略高。为实现高精度的颗粒尺寸调控，反应初期的温度控制必须严格，通常控制在±0.1 °C范围内。
   10. 让反应进行适当时间，通常1小时即可完成。
   11. 迅速将反应试管转移至60 °C的烘箱中，并取一滴热分散液加入10 ml已预热至超过PNIPAM体积相变温度（VPTT，32–34 °C）的过滤重蒸馏水中¹，用于动态光散射（DLS）在收缩状态下的表征。
   12. 让其余分散液冷却至室温，然后转移至离心管中。
   13. 将溶液在257,000 × g条件下离心三次，每次40分钟，最后将微凝胶稀释于2 ml过滤后的重蒸馏水中，作为示踪颗粒使用。

2. 光散射表征

1. 通过动态光散射测定塌缩状态下的流体动力学半径
   1. 用丙酮蒸气清洗比色皿和玻璃器皿。
   2. 加热10 ml过滤后的（例如， 200 纳米或更小的RC滤器）通过PNIPAM的VPTT的双蒸水。
   3. 使用预热的针头（0.9 x 40 mm）和注射器（1 ml），将一滴热分散液转移至过滤水中。
   4. 将DLS测角仪的折射率匹配浴温度调节至50 °C，并在不使样品冷却的情况下将其转移至仪器中。
   5. 找到通过测试测量能够获得足够散射强度以获取相关图的最大散射角。
      1. 插入样品比色皿（直径10 mm的玻璃管，内含1 ml颗粒分散液）。将检测器臂移至小散射角（此处为30°）。
      2. 检查光束轮廓以排除多重散射：主光束周围无弥散光晕，无多重散射现象。 等等。 检查计数范围是否适合在最低散射角下进行测量（约在30至600 kHz之间；软件窗口右上角）。
      3. 将测角仪臂移动至最高散射角（此处选择120°）。检查计数率是否仍足以满足测量要求（介于30至600 kHz之间）。若强度过低，则将测角仪臂移至较低的散射角。
   6. 通过甲苯浴的玻璃在最小散射角处目视检查光束，若观察到入射光束周围有发光现象，则表明发生了多重散射。此时应降低激光强度或采用更高稀释度的样品。
   7. 在最小与最大散射角之间获取 20 个相关图例如，30° - 140°），最低采集时间为60秒。如有必要，对弱强度大散射角情况应增加采集时间。
2. 数据分析 ³⁷
   1. 根据散射角计算散射矢量的模长 ，其中 n 是分散体系的折射率， 激光在真空中的波长 散射角。
   2. 如果测量软件提供了强度相关函数 ，将其转换为电场关联函数  根据 参数 是与探测器区域内散射光的空间相干程度相关的、不具显著意义的仪器参数。
   3. 对相关图进行累积量分析， 即，对每个电场相关函数的对数拟合二阶多项式 通过线性最小二乘法。 表现为拟合的截距，其精确值对数据分析而言并不重要。将拟合限制在有意义的滞后时间内 τ 值, 例如，使得关联幅度为最大幅度的10–20%。一阶项的系数是关联函数的平均衰减速率。 .
   4. 找到平均扩散系数的最可能值  通过线性最小二乘法拟合颗粒的 。如果 对抗 在误差范围内，若曲线不呈线性且不经过原点，则表明粒径分布较宽，流体动力学半径难以准确定义。 
   5. 根据斯托克斯-爱因斯坦关系式计算平均流体动力学半径 , 其中 是玻尔兹曼系数， 绝对温度和 分散液的黏度在 . 传播标准偏差 到 .   
3. 静态光散射法测定颗粒结构
   1. 用丙酮蒸气清洗比色皿和玻璃器皿。使用直径20 mm或更大的比色皿，以尽量减少圆柱透镜效应。
   2. 使用200 nm RC滤膜或更小孔径的滤膜过滤约20 ml双蒸水至玻璃小瓶中，并将一滴纯化的分散液转移至该小瓶中。在用于样品制备前，先用10 ml水冲洗滤膜，以去除生产过程中残留的杂质。
   3. 检查样品是否受到环境光源干扰。若观察到蓝色色调，则样品浓度可能过高，应相应稀释。
   4. 通过用过滤水多次冲洗比色皿来制备背景水样，然后根据比色皿类型及仪器中激光位置加入适量样品体积。激光必须穿过样品，且不被液面弯月面折射。
   5. 使用甲苯样品校准仪器。
   6. 在可用的角度范围内测量水的散射（背景）。
   7. 在多个波长下，优先在可获得的角度范围内测量样品的散射强度。将散射图谱归一化至前向散射强度后，称为形态因子。
   8. 若已知颗粒结构，应采用适当的模型表达式，对在不同波长下测得的数据集进行全局拟合计算。
   9. 对于未知粒子结构，使用正则化直接法（如 FitIt!） ³³）或更通用的间接傅里叶逆变换 ^21,22 常规结合对成对距离分布函数的解卷积（仅适用于球形颗粒） ^23,24 用于颗粒类型的粗略分类。
   10. 若拟合或反演程序提供了粒子半径分布函数的估计值，计算多分散指数（分布的标准差除以其平均值）。

3. 通过宽场荧光显微镜进行颗粒追踪

注意：粒子示踪实验中使用的示踪粒子和基质粒子在 20 °C 下的流体动力学半径分别为 465 ± 7 nm 和 405 ± 7 nm。

1. 样品制备
   1. 通过将已知量的冻干未标记微凝胶重新分散于已知量的双蒸水中，制备浓缩的基质微凝胶分散液。加入少量标记的示踪颗粒。
   2. 在显微镜下确认示踪微凝胶的合适浓度。最佳浓度需在尽可能多同时获取粒子轨迹数量与示踪剂浓度足够低之间取得平衡，以确保在采集过程中示踪粒子轨迹发生交叉的概率可忽略不计。
   3. 通过在烘箱中蒸发水分制备浓缩分散液。通过比较蒸发前样品的原始重量与分散液的重量，确定其质量浓度。
2. 数据采集与分析
   1. 使用合适放大倍数和孔径的物镜来激发示踪剂，并同时收集样品的荧光信号。本研究中采用100X/1.3 NA油浸物镜。
   2. 将保湿室置于可放入商用显微镜的xyz压电平移台上。
   3. 为防止样品干燥，将经等离子清洗的盖玻片放入保湿 chamber 中，并用移液器吸取 10 µl 所需浓度的聚(NIPAM) 分散液滴加到盖玻片上。
   4. 根据荧光染料的激发和发射光谱，选择合适的激光器进行激发，并适当调整激光功率。激光强度应足够低，以避免染料快速发生光漂白，但同时又需足够强，以实现精确的单颗粒定位（见下文）。本研究中采用561 nm的二极管泵浦固体激光器，并将激光功率恒定保持在16 mW。约 0.5 kW cm^-2 在所有测量中，针对样品进行操作。
   5. 为获得均匀的样品照明，请使用此处所述的关键照明装置。具体操作为：将激光器耦合至多模光纤（NA 0.22 ± 0.02，纤芯直径 0.6 mm），利用涡旋振荡器抖动光纤以在时间上平均化激光散斑，再将光纤末端投影至样品平面。
   6. 通过轻微上移物镜，利用盖玻片背面反射信号校准z轴距离，并将焦点移至样品内部数微米处，然后使用z轴补偿器固定z位置。这可避免盖玻片界面效应的影响。
   7. 根据荧光信号的强度调整检测器参数，例如曝光时间。本实验中，使用 EMCCD 相机，曝光时间为 0.1 秒，采用电子倍增模式，增益设为 50。
   8. 采集多段视频，每段包含适当数量的帧，以获得足够的滞后时间，用于计算样品不同区域中微凝胶的均方位移。本研究中采用的采集帧数为500帧或1,000帧。
   9. 使用高斯拟合方法对每帧中的粒子进行定位以分析数据 ²⁵ 并使用适当的粒子追踪算法 ²⁶ 以获得均方位移。 ²⁷ 通过计算所有影片中所有轨迹的平均值来求取均值和标准差。采用线性回归法，从长滞后时间的扩散系数进行计算 ，其中  是均方位移， D 平均扩散系数和 τ 滞后期
   10. 估算异常参数 γ 从反常扩散方程 通过将数据转换为对数尺度，得到 异常参数 由曲线图的导数给出。可通过数据点的有限差分法估算导数，或通过多项式函数拟合数据点后进行解析求导。通过绘制不同多项式阶数下的拟合残差及残差范数，确定多项式拟合函数的适当阶数。
   11. 对不同浓度的微凝胶基质重复相同的步骤。

结果

在反应初期的成核阶段，便已确定了该批次中PNIPAM微凝胶颗粒的数量，从而决定了最终的颗粒体积²⁰。疏水性共聚单体染料甲基丙烯酰氧乙基硫代氨基甲酰基罗丹明B会通过降低批次中的颗粒数密度来影响成核过程。对于两种不同初始NIPAM浓度，随着染料浓度的增加，颗粒浓度的降低表现为塌缩状态下平均最终颗粒体积的增大，如图1所示。体积的增大可归因于该疏水性共聚单体染料，它在反应初期促进了微凝胶核的聚集，从而降低了颗粒浓度并增大了最终颗粒体积。

成功的DLS测量结果如图2所示。对于体积最小的六个粒子批次，平均衰减速率Γ₂与q²呈线性依赖关系，且在误差范围内y轴截距为零，表明这些批次的粒径分布相对较...

讨论

添加少量功能性共聚单体可显著影响聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAM）微凝胶的粒径和结构。同时进行的小规模试管聚合是评估此类变化的有效方法，有助于快速确定目标粒径所需的反应物组成，以便根据需要放大反应规模。当使用热分解引发剂（如KPS）时，颗粒质量大致呈指数依赖于聚合温度 ²⁰，因此必须在反应器内建立稳定且精确的温度控制，以确保良好的重复性。若能尽量减少与批次合成相关的干扰因素——例如在大型反应器中过度搅拌反应混合物以消除温度梯度，或使用过量引发剂溶液导致引发阶段反应温度变化——则常规间歇反应与非搅拌反应所得的最终颗粒体积通常具有较好的一致性。

动态光散射是一种成熟且快速的方法，用于测定大量粒子的扩散行为 原位然而，必须在多个散射角度采集数据。若仅在某一任意角度进行动态光散射（DLS）测量，而该角度恰好与散射函数的极小值重合，或在粒径分布较宽的情况下，将导致测得的表观扩散系...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙酮	VWR Chemicals	KRAF13455
双丙烯酰胺	AppliChem	A3636
正己烷	Merck	104374
N-异丙基丙烯酰胺	Fisher Scientific	AC412785000	用正己烷重结晶
甲基丙烯酰氧乙基硫代氨基甲酰罗丹明B	Polysciences	23591
过硫酸钾	Merck	105091
硅油 47 V 350	VWR Chemicals	83851
甲苯	Sigma Aldrich	244511
F12 制冷/加热循环器	Julabo	9116612
显微镜	Olympus	IX83
XY(Z) 压电系统	Physik Instrumente	P-545.3R7
100倍油浸物镜	Olympus	UPLSAPO
四线分光镜	AHF Analysentechnik	F68-556T
Cobolt Jive 150 激光器	Cobolt	0561-04-01-0150-300
多模光纤	Thorlabs	UM22-600
iXON Ultra 897 EMCCD 相机	Andor	DU-897U-CS0-BV
激光测角仪	SLS Systemtechnik	Mark III
CF40 冷冻紧凑型循环器	Julabo	9400340
激光测角仪系统	ALV GmbH	ALV / CGS-8F
多τ相关器	ALV GmbH	ALV-7004
光散射电子设备	ALV GmbH	ALV / LSE 5004
光子计数模块	PerkinElmer	SPCM-CD2969	2个单元以伪互相关模式运行
633 nm 氦氖激光器	JDS Uniphase	1145P
F32 制冷/加热循环器	Julabo	9312632