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通过π-π堆叠相互作用稳定的两亲性嵌段共聚物胶束制备：基于阴离子聚合合成两亲性共聚物

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DOI：

10.3791/54422

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2016年10月10日

 ,  , 
1Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto

本文内容

摘要

本文描述了甲氧基聚乙二醇（mPEG-b-PPheGE）上苯基缩水甘油醚（PheGE）活性阴离子聚合的关键步骤。所得嵌段共聚物胶束（BCMs）负载了14%（wt%）的阿霉素，并在生理相关条件下实现了长达4天的药物缓释。

摘要

本研究通过在甲氧基聚乙二醇（mPEG-）上对苯基缩水甘油醚（PheGE）进行活性阴离子聚合，合成了包含具有苯基的成核嵌段的两亲性共聚物。b-PPheGE)。共聚物表征结果显示其具有较窄的分子量分布（PDI < 1.03）并确认了mPEG的聚合度122-b（苯基甘氨酸乙酯）15采用已建立的荧光法测定共聚物的临界胶束浓度，并通过动态光散射和透射电子显微镜评估其聚集行为。对共聚物在药物递送应用中的潜力进行了初步评估，包括 体外 生物相容性、载药及疏水性抗癌药物阿霉素（DOX）的释放。制备了稳定的DOX胶束制剂，载药量高达14%（wt%），载药效率 > 在生理相关条件下（酸性和中性pH，存在白蛋白），药物负载率达60%（w/w），并在4天内实现持续释放。较高的药物负载量和持续释放特性归因于阿霉素（DOX）与胶束核心形成嵌段之间的π-π相互作用稳定效应。

引言

在水相介质中，两亲性嵌段共聚物会自组装形成纳米级的嵌段共聚物胶束（BCMs），其结构由疏水性内核和亲水性外壳（或称冠层）组成。胶束的疏水内核可作为疏水性药物的储库，而亲水性冠层则在内核与外部介质之间提供界面。聚乙二醇（PEG）及其衍生物是聚合物中极为重要的一类，也是药物制剂中最广泛应用的材料之一1-3。嵌段共聚物胶束已被证实是一种具有潜力的药物递送平台，目前已有多种基于该技术的制剂进入临床后期开发阶段4。通常情况下，这类共聚物的疏水嵌段由聚己内酯、聚(D,L-丙交酯)、聚氧化丙烯或聚(β-苄基-L-天冬氨酸酯)构成5-9。

Kataoka 团队研究了由 PEO-b-PBLA 和聚乙二醇-b-(聚天冬氨酸-阿霉素偶联物) 形成的球形胶束用于阿霉素（DOX）的递送。10,11 在他们的报告中提出，聚合物偶联药物或 PBLA 与游离 DOX 之间的 π-π 相互作用有助于稳定胶束核心，从而提高药物的载药量和滞留性。已知药物与核心形成嵌段之间的相容性或相互作用是决定关键性能相关参数的重要因素。12 除 DOX 外，多种抗癌治疗药物在其核心结构中包含芳香环（例如，甲氨蝶呤、奥拉帕利、SN-38）。

因此，人们对合成在其成核嵌段中包含苄基环的共聚物具有浓厚兴趣。聚乙二醇（PEG）及其衍生物的阴离子开环聚合能够精确控制分子量，并以较高产率获得低多分散性的材料13,14。环氧乙烷可与苯基缩水甘油醚（PheGE）或苯乙烯氧化物（SO）进行（共）聚合，形成可自组装为胶束的嵌段共聚物，用于增溶疏水性药物15-18。本报告描述了以mPEG-OH为大分子引发剂，对苯基缩水甘油醚单体进行活性阴离子聚合所必需的实验步骤（图1）。随后，对所得嵌段共聚物及其聚集体在药物递送应用中相关的关键性质进行了表征。

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方案

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图1. mPEG-b-PPheGE共聚物制备过程的九个关键步骤示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。

1. 在干燥条件下试剂的准备

  1. 试剂的制备。
    1. 称取15 g mPEG-5K（Mn=5,400 g/mol，PDI 1.03），使用前在50 °C下置于真空烘箱中干燥48小时。
    2. 将200 ml二甲基亚砜（DMSO）用氢化钙（CaH2）（约1 g）干燥，真空处理30分钟，用氩气置换，然后搅拌48小时后使用。
    3. 取50 ml PheGE单体置于干燥洁净的100 ml烧瓶中，加入1 g CaH2，在冰上抽真空密封15分钟，用氩气置换后，在氩气氛围下搅拌24小时，再使用。

2. 萘钾的制备

  1. 小心地将用己烷干燥过的金属钠小块（约 1.5 g）切下，以去除多余的矿物油，然后加入含有四氢呋喃（THF）（v = 500 ml）的圆底烧瓶中。
    注意：由于存在起火风险，钠块不得长时间暴露于空气中。
  2. 加入二苯甲酮（约 5 g），用氩气吹扫后，用玻璃塞密封双颈圆底烧瓶。
  3. 在氩气氛围下搅拌 24 小时后，将圆底烧瓶连接至蒸馏装置（图 2），在氩气保护下对深色溶液进行蒸馏，同时保持回流（即，溶液变蓝后继续回流约 2 小时）。通过关闭蒸馏装置中部的左侧阀门，开始收集约 150 ml 所需体积的 THF。
    注意：如果溶液未变蓝，则停止蒸馏，冷却至室温（RT），加入更多二苯甲酮或金属钠后重新开始蒸馏。此现象表明 THF 中仍含有水分。
  4. 在干燥的锥形瓶中加入蒸馏过的 THF（v = 100 ml），并溶解 3.9 g 萘。
    注意：停止蒸馏，冷却至室温（RT），打开右侧阀门以转移 THF 体积。
  5. 如步骤 2.1 所述，切取小块钾（1.1 g），加入含萘的溶液中（最终浓度约 0.3 mol/L）。用带有顶部隔垫的冲洗接头（T 型接头）（可开关）密封锥形瓶，并用氩气吹扫。
  6. 在氩气氛围下搅拌 24 小时后，观察所得的萘钠碱溶液，应呈现均一的深绿色。
  7. 在惰性气氛条件下，用注射器从烧瓶中取出 5 ml 该碱性溶液，加入 10 ml 蒸馏水中。随后向该溶液中加入 1–2 滴酚酞指示剂，溶液变为品红色。
  8. 使用滴定管，以标准盐酸溶液（0.1 N）滴定萘钠溶液，直至溶液变为无色。

3. 高效活性阴离子聚合所需的材料及必要预防措施

  1. 氩气/真空系统装置。
    注意：如图2所示，使用带有中空玻璃活塞的双通玻璃歧管，以在玻璃器皿中切换氩气供应和真空条件。
    1. 使用惰性橡胶管将氩气钢瓶（带压力计）连接至干燥干燥剂柱，并连接至歧管管线。在氩气管线的另一端，连接一个装有矿物油的鼓泡器。
    2. 在玻璃活塞上连接柔性惰性管和针头。在歧管的另一管路上，连接一个浸入低温杜瓦瓶（内装冰/水或液氮）中的玻璃捕集阱，并将其连接至高真空泵。
  2. 单体和DMSO的蒸馏装置。
    注意：采用一种便捷的（即一体化）高真空蒸馏装置（图2）。干燥玻璃器皿配备高真空阀门，以及内置带有内部制冷头的冷凝器。
    1. 通过冷却装置（字母）的进水口（A）和出水口（B）连接水流。将另一个进出口（C）连接至氩气/真空双歧管。在加料/取样口处安装并用金属丝密封隔垫，并在顶部/环路处连接不锈钢套管，用于转移对空气敏感的液体（D）。
    2. 在聚合反应前，分别在半球形加热套中于100 °C和70 °C下对PheGE和DMSO进行真空蒸馏2小时，并同时搅拌。PheGE单体的沸点为254 °C，而DMSO的沸点为189 °C（1 atm下）。
  3. 阴离子聚合用玻璃器皿。
    1. 除蒸馏系统外，仅使用耐高真空的玻璃器皿，包括圆底烧瓶（需为制造商认证产品）、量筒（用于转移溶剂、碱和单体的体积）、套管、隔垫以及用于密封隔垫的金属丝。
      注意：对于活性聚合反应，使用前需在真空条件下小心加热所有玻璃器皿，并在氩气流中冷却。保持热风枪与玻璃器皿的距离约为10 cm。

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图2. 装置组装及关键的蒸馏/转移步骤。 请点击此处查看该图的放大版本。

4. 活性阴离子聚合关键步骤说明：蒸馏与转移

  1. 在干燥的圆底烧瓶/Schlenk 瓶（已烘干）中加入 mPEG-5K（2 mmol，10 g），放入搅拌子，并在瓶口用橡胶隔垫密封三通接头（T 型接头）（开关控制）。
  2. 将烧瓶连接至真空/惰气操作系统（manifold），用氩气吹扫 2–3 分钟以置换瓶内空气。然后将阀门转至抽真空位置，进一步除去残留气体。
  3. 手动旋转烧瓶，并用热风枪均匀加热反应容器，直至 mPEG-5K 完全熔化。
    注意：热风枪应保持距离烧瓶约 10 cm。
  4. 1 分钟后，通过快速切换 manifold 上的阀门至氩气通入位置，打破真空状态。
    注意：应观察到鼓泡器中有持续的氩气流。当气流稳定后，保持阀门处于通氩状态。重复加热与冷却步骤两次，以彻底去除微量水分。
  5. 在反应开始前，将聚合物大分子引发剂在真空下保持约 2 小时，随后置于氩气氛围中备用。
  6. 在通风橱内安装两套高真空蒸馏装置（图 2）；一套用于 DMSO 的蒸馏，另一套用于单体（PheGE）的蒸馏。
  7. 将分别装有 DMSO 和单体的烧瓶连接至两套蒸馏装置，并置于半球形加热套（或油浴）中。将冷凝水连接至装置顶部（进/出接口），并将装置连接至 manifold（氩气/真空）。
  8. 确保每套装置固定牢固且密封良好。通过阀门开启真空系统。
    注意：如步骤 3.3 所述，重复加热与冷却步骤两次，以彻底去除微量水分。
  9. 通过温度控制器设定加热温度，并开始搅拌溶液。DMSO 循环/蒸馏 2 小时后，关闭蒸馏装置中部的高真空阀，收集约 20 ml 溶液（用于清洗装置内壁）。然后将该馏分释放至烧瓶中，并重复操作一次，以确保后续收集的目标馏分纯度。
  10. 用热风枪加热装有 mPEG-5K 的烧瓶（保持真空状态），直至聚合物（mPEG-5K）完全熔化。再次用氩气吹扫。
    注意：此操作有助于后续 DMSO 加入后的溶解过程。
  11. 2 小时后，关闭高真空阀，收集溶剂体积（VDMSO = ~ 100 ml）。停止加热，并通过 manifold 释放真空。如前所述，通过快速开关方式向系统内通入氩气。
  12. 在氩气正压条件下，将套管的一端（连接至装置的旋塞处）接入量筒，或直接接入装有 mPEG-5K 的烧瓶（若蒸馏装置自带刻度），另一端小心浸入新蒸馏的馏分中。
  13. 利用氩气压力将 DMSO 经套管压入反应烧瓶。在烧瓶（或量筒，如需测量）上连接一个额外的鼓泡器，并关闭与 manifold 另一侧鼓泡器相连的玻璃旋塞。
    注意：当套管一端拔出进行转移时，必须确保系统维持正压氩气环境。
  14. 为避免因氩气压力引发意外，每隔约 0.5 分钟打开玻璃旋塞 1–2 秒后重新关闭，以持续推动 DMSO 转移，直至全部完成。转移结束后重新打开旋塞。
    注意：接下来对单体的蒸馏与收集也必须采用相同操作流程。溶剂与单体不可同时收集。
  15. 通过套管转移 5 ml 浓度为 0.3 M 的萘基钾溶液至带有隔垫密封并插入套管（回路）的量筒中。
    注意：操作需遵循 NOTE 4.13 的预防措施。首先需维持从萘基钾溶液瓶到量筒、再从量筒到反应烧瓶的正压氩气环境，以防止空气或水分污染。
  16. 从 manifold 插入另一根针管至量筒（通氩气）。小心移除与蒸馏系统相连的套管，并迅速插入反应烧瓶中。
    注意：此技术适用于碱液和单体的转移。
  17. 逐滴加入碱液，直至溶液变为深色。待颜色缓慢褪去后，再次加入部分碱液使深色重现，重复此过程直至全部碱液转移完毕。
  18. 转移所需体积的单体（VPheGE = 5 ml），以实现 PPheGE 的聚合度约为 n=18–20。
  19. 在 80 °C 下，于氩气氛围中持续搅拌反应 48 小时，以确保聚合反应完全。
  20. 通过滴加甲醇中的 1 N HCl（用石蕊试纸检测至中性 pH）来淬灭反应，并以颜色消失作为反应终止的标志。
  21. 用正己烷（3×50 ml）从 DMSO 溶液中萃取萘。通过减压蒸馏去除约 70 ml DMSO（使用同一装置）。冷却浆状溶液后，加入 50 ml THF。
  22. 将浆状溶液在 5,000 × g 条件下离心 10 分钟以去除盐分。转移上清液，并逐滴加入 500 ml 冷的乙醚中进行沉淀。
  23. 通过过滤或离心收集沉淀物（重复两次），并在 30 °C 下真空干燥 24–48 小时（产率 85%）。
    注意：该共聚物现已可用于表征分析。

5. 共聚物的表征

  1. 在铝制样品盘中称取5-10 mg共聚物（记录实际质量），并用铝盖密封。将样品盘和参比盘（空盘）装入差示扫描量热仪中。
  2. 设定一个方法（“加热/冷却/加热”）循环程序：1）以10 °C/min的速率从40 °C加热至100 °C，2）以10 °C/min的速率冷却至-70 °C，3）再以10 °C/min的速率加热至100 °C。重复步骤2）和3）两次。根据第三次循环的热流曲线（如适用）确定熔点（Tm）、结晶温度（Tc）和玻璃化转变温度（Tg），以及熔融焓（ΔHf）。
  3. 将聚合物溶解于THF中（2 mg/ml），并通过0.2-µm PTFE滤膜过滤。取50 µl样品注入凝胶渗透色谱系统，利用样品的保留时间和以一系列聚苯乙烯标准品绘制的校准曲线测定聚合物的分子量。19
  4. 将（共）聚合物（15 mg/ml）溶解于d6 DMSO中，用于1H NMR波谱分析。19
  5. 使用1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（DPH）作为荧光探针测定共聚物的临界胶束浓度（CMC）。9
    1. 在避光条件下配制DPH的THF储备液（2.32 mg/L），并向一系列小瓶中各加入100 µl该储备液。
    2. 配制共聚物的THF储备液，并向一系列小瓶（每瓶已含一份DPH储备液）中分别加入等体积（2 ml）的储备液，使最终共聚物浓度范围为0.01至1,000 µg共聚物/ml。
    3. 随后涡旋混合共聚物-DPH溶液，并逐滴加入含搅拌子的10 ml双蒸水中。然后在氮气氛围下避光剧烈搅拌48小时，使THF缓慢蒸发。每个溶液中DPH的最终浓度为0.232 mg/L。
    4. 使用双扫描微孔板荧光分光光度计，在激发波长λex = 350 nm、发射波长430 nm处测量各样品的荧光发射强度，并绘制荧光强度对聚合物浓度对数的曲线图。两条线性斜率的交点即为该共聚物的CMC值。

6. 将阿霉素载入 BCM 的操作步骤

  1. 将12 mg DOX溶解于1 ml乙腈中，加入10 µl三乙胺，在避光条件下搅拌2小时。
  2. 将共聚物（45 mg）溶解于1 ml四氢呋喃（THF）中，同样搅拌相同时间。将共聚物溶液加入DOX溶液中，并用额外的THF（0.5 ml）冲洗含有残留共聚物的小瓶。
  3. 在搅拌条件下，将共聚物-药物混合物（2.5 ml）逐滴加入含有15 ml生理盐水（0.9% NaCl）的20 ml小瓶中。
  4. 将溶液转移至透析袋（截留分子量3.5 kDa），并在500 ml生理盐水（0.9%）中进行透析。
    注意：6小时后更换外部生理盐水，继续在室温避光条件下搅拌透析24小时。
  5. 将透析液转移至50 ml离心管中，在5,000 × g条件下离心15分钟。
  6. 将上清液转移至超滤系统（容量10 ml），该系统内含透析膜（截留分子量10 kDa）。将搅拌适配器放入超滤系统中，盖紧盖子并通入氮气流。
  7. 将BCM溶液浓缩至4 ml体积，加入6 ml新鲜生理盐水，重复此操作两次。
  8. 将BCM溶液再次浓缩至4 ml，用0.5 ml生理盐水冲洗滤室，并将冲洗液加入溶液中。储存于棕色小瓶中，置于室温避光处，待后续使用。

7. DOX-BCMs 中阿霉素载药效果的评价

  1. 将DOX-BCM溶于二甲基甲酰胺中（400 µl中加入100 µl），以破坏胶束结构，随后在测定前用盐酸水溶液（0.1 N）稀释（900 µl 0.1 N HCl中加入100 µl）。
  2. 使用台式微孔板分光光度系统在490 nm处测定药物载量。采用以下公式计算药物载药量（DLC）和载药效率（DLE）：
    DLC （wt%）=（载药量 / BCM总重量）× 100%
    DLE （%）=（载药量 / 投料药物重量）× 100%

8. 评估 体外 DOX-BCMs 中 DOX 的释放

  1. 研究DOX从BCMs中的释放 37 °C 在0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中，分别对含有0.1%（w/v）Tween 80的PBS（pH 7.4）、BCMs + BSA（50 mg/ml）的PBS（pH 7.4）以及0.1 M乙酸盐缓冲液（pH = 5.5）进行处理。20,21
  2. 稀释 BCM-DOX 制剂（700 µl) 加入选定缓冲液（2.3 ml），使总体积达到 ≈ 透析袋中含有 0.6–0.7 mg 的 DOX。
  3. 将溶液放入透析袋中，用夹子密封，然后将透析袋浸入200 ml相应的外部培养基中。
  4. 在预定时间点从透析袋外移除 2 ml 溶液，并加入等体积的新鲜缓冲液。
  5. 将分装样品保存于 -20 °C 在进行紫外-可见分光光度法分析之前（Abs490 nm). 药物累计释放百分比（Er）可使用以下公式计算：
    figure-protocol-3
    注意：在 mDOX 表示 BCMs 中 DOX 的含量，V0 是释放介质的总体积（200 ml），Vt 是更换培养基的体积（Vt = 2 ml），Ci 为校正前浓度，Cn 表示样品中阿霉素（DOX）的浓度。

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结果

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图3. 以mPEG大分子引发剂引发苯基缩水甘油醚的阴离子聚合反应制备mPEG-b-(PheGE)15，用于制备负载阿霉素的嵌段共聚物胶束。 示意图展示了使用萘基钾作为自由基阴离子对mPEG的羟基进行去质子化，随后引发苯基缩水甘油醚（PheGE）单体的聚合反应。图中还展示了用醋酸铀酰（1% w/v）染色后的嵌段共聚物胶束（BCMs）的代表性透射电子显微镜图像（TEM），以及通过动态光散射（DLS）测定的胶束粒径分布。 请点击此处查看该图的放大版本。

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讨论

由于阴离子聚合能很好地控制分子量，因此它是工业上制备基于环氧烷单体（如 PEG 和 PPG）的聚合物最常用的方法之一。要成功实现聚合，必须采用最佳且严格的反应条件。所有试剂的严格纯化以及合适的实验装置对于保持聚合反应的“活性”特征至关重要。当前实验装置的主要局限性通常与依赖套管转移的技术有关。在适当的压强下，套管转移在学术研究环境中的实验室规模操作是安全的。采取这些预防措施可在聚合过程中实现更好的可重复性和控制性（低 PDI）。此外，这些转移和纯化步骤也可用于制备如 mPEG-b-PCL、mPEG-b-PLLA 和 mPEG-b-PAGE 等嵌段共聚物19,29。然而，这种便捷的方法可能不适用于某些需要更严格条件（例如，苯乙烯）的单体的聚合反应。在这些情况下，通常更倾向于采用安瓿断裂密封（break-seal）技术进行阴离子聚合30。在工业生产中，为控制这些步骤，通常使用类似系统（不锈钢/玻璃）通过密闭阀门相互连接。

对于环氧烷单体，其一般机理是氧负离子（自由离子或离...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

CA 承认获得了加拿大自然科学与工程研究理事会的发现基金资助。CA 承认获得了葛兰素史克（GSK）药物制剂与药物递送领域的讲席职位。作者声明不存在竞争性财务利益。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM/HAMF12Gibco, Life Technologies12500添加10% FBS。在37 °C水浴中预热。
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）Sigma-AldrichT4049在37 °C水浴中预热
胎牛血清（FBS）Sigma-AldrichF1051加拿大来源
MDA-MB-468细胞系ATCCHTB-132
MTS四氮唑试剂PROMEGAG111B
吩嗪硫酸乙酯（PES）Sigma-AldrichP4544>95%
mPEG5K（Mn 5,400 g/mol）Sigma-Aldrich81323PDI=1.02
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichD4540>99.5%
萘Sigma-Aldrich147141>99%
苯基缩水甘油醚Sigma-AldrichA32608>85%
二苯甲酮Sigma-Aldrich427551>99%
钾Sigma-Aldrich451096>98%
四氢呋喃Caledon Laboratory Chemicals8900 1ACS
己烷Caledon Laboratory Chemicals5500 1ACS
氢化钙（CaH2）ACPC-0460>99.5%
乙醚Caledon Laboratory Chemicals1/10/4800ACS
酶标仪BioTek Instruments
差示扫描量热法（DSC）TA Instruments IncDSC Q100
凝胶渗透色谱法（GPC）Waters2695分离模块 / 2414检测器 两根色谱柱：Agilent Plgel 5 µm Mixed-D
核磁共振波谱法（NMR）Varian Mercury 400MHz
氘代氯仿Sigma-Aldrich15185899.96%
氘代DMSOSigma-Aldrich15691499.96%
真空泵Gardner Denver Welch Vacuum Tech, Inc.极限压力 1×10-4 torr
含指示剂的干燥剂，8目Sigma-Aldrich238988在230 °C下再生2小时

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