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方法文章

小型动物模型中的尿路感染：雄性和雌性小鼠的经尿道导管插入术

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DOI：

10.3791/54432

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2017年12月1日

 ,  , 
1Unité d’Immunobiologie des Cellules Dendritiques, Department of Immunology, Institut Pasteur, INSERM U818, 2Genentech

本文内容

摘要

已建立的小鼠经尿道插管模型可用于研究膀胱病理状态，包括尿路感染，但该模型仅适用于雌性小鼠。本文介绍一种新的雄性小鼠经尿道灌注模型，将有助于推动在临床上和流行病学上存在显著性别差异的领域的研究。

摘要

尿路感染（UTI）在全球范围内极为常见，导致显著的发病率以及与医疗保健相关的高额费用。能够准确反映疾病发生和进展过程的小型动物模型，有助于解析宿主与病原体之间的相互作用，并研究感染过程中免疫反应的产生。在小鼠中，通过膀胱内灌注尿路致病性E. coli（占社区获得性尿路感染病因的85%以上）可重现人类感染过程中的多个阶段。然而直到最近，尿路感染模型仅能在雌性动物中建立。这一限制阻碍了对尿路感染及其他膀胱疾病（如膀胱癌）中性别相关差异的研究。本文介绍了一种对雄性小鼠进行膀胱灌注的方法，从而实现雌性和雄性动物之间的直接比较；同时提供了一套详细的流式细胞术检测膀胱组织的实验方案，以更深入地理解宿主对感染的免疫应答。上述方法将有助于识别导致尿路感染及其他膀胱相关疾病中性别差异的宿主因素。

引言

尿路感染（UTI）是发达国家最常见的感染性疾病之一1。在新生儿和老年人群中，女性与男性的感染率相似2。然而，育龄期成年女性社区获得性尿路感染的发病率远高于男性2,3。鉴于该疾病主要影响女性，基础与临床研究长期以来主要集中于女性尿路感染。然而，男性尿路感染是一个重要但研究不足的医疗挑战4。事实上，由于男性尿路感染常伴随更高的发病率，此类感染通常被定义为复杂性感染4,5。

随着人们对性別差异在生理学和病理学中核心作用的认识不断深入，探索这一长期被忽视的疾病特征需要新的方法。性別差异在免疫和感染中起着至关重要的作用；女性自身免疫性疾病的发病率更高，而男性则更容易感染某些传染病，例如结核病、疟疾和艾滋病病毒6,7。膀胱癌是另一种泌尿系统疾病，其在男性中的发病率显著高于女性，多项研究已表明雄激素在恶性肿瘤发生中具有重要作用8,9,10,11,12。然而值得注意的是，由于无法对雄性小鼠进行反复导尿，目前膀胱癌的膀胱内治疗研究仅在雌性动物中开展13。

尿路感染发病机制的研究在很大程度上依赖于啮齿类动物感染模型（例如，小鼠和大鼠）。尿路感染的啮齿类动物模型可采用最初从人类感染中分离的尿路致病菌，例如尿路致病性 E. coli （尿路致病性大肠杆菌，UPEC）， 克雷伯菌, 肠球菌, 金黄色葡萄球菌，或 变形杆菌属14通常，细菌会被引入膀胱 通过 尿道插管。感染后，可取出膀胱和肾脏以评估感染的特定参数，如细菌定植、组织损伤或宿主免疫反应15,16然而，普遍而言，尿路感染研究仅使用雌性动物。事实上，许多研究指出，由于解剖学原因，雄性小鼠无法进行导尿管插入13,17,18,19最近描述了一种用于雄性动物灌注的外科手术方法，即打开腹部，通过轻柔按压腹腔开口处将膀胱外置，并向膀胱内注射细菌。20该方法能够实现雄性感染，但需要进行外科手术干预。因此，该方法的主要局限性在于炎症的影响，例如切口可能诱发抗炎性伤口愈合反应，从而影响感染的结果。21由于我们的研究兴趣包括探讨疾病反应中的性别差异，我们建立了一种雄性小鼠膀胱内细菌灌注方法，该方法更接近于长期以来用于雌性啮齿类动物的非手术经尿道灌注技术。22.

我们的模型基于一种已确立的方法学，能够直接比较雌性和雄性动物在尿路感染（UTI）中的宿主免疫反应。该方法将有助于解析感染过程中基于性别的差异，并可能为两性在感染易感性和反应性方面显著差异提供分子和细胞层面的线索。此外，该模型的价值不仅限于尿路感染研究，还可用于建立其他膀胱相关疾病的研究模型，例如膀胱癌、前列腺炎、膀胱活动低下或过度活跃综合征以及间质性膀胱炎。

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方案

小鼠实验根据动物实验伦理委员会（Comité d'éthique en expérimentation animale Paris Centre et Sud）批准的第2012-0024号实验方案进行，符合欧盟2010/63号指令的要求。

1. 导管的制备

  1. 为每组待感染的小鼠准备一个儿科静脉穿刺导管。按照制造商说明，利用内置弹簧装置将每个导管的针头卸下。丢弃针头，仅保留塑料静脉导管部分。
  2. 在超净工作台中对导管进行紫外线（U.V.）照射灭菌，通常持续 25 - 30 分钟。
    注意：导管可重复用于多只小鼠，但在不同实验组、不同性别或不同细菌菌株之间应使用新的导管。

2. 用于感染的尿路致病性 E. coli 的制备

  1. 感染前至少两天，使用无菌接种环从冻存的细菌菌种中挑取尿路致病性大肠杆菌（UPEC），划线接种于含有适当抗生素的Luria肉汤（LB）琼脂平板上。在37 °C下培养过夜。平板可在4 °C下保存最多一周。
  2. 在100 ml无菌锥形瓶中，用LB平板上的单个菌落接种10 ml含适当抗生素的LB液体培养基，并于37 °C静置培养过夜（约16–18小时）。
    注意：静置培养有利于表达I型菌毛，而I型菌毛是感染所必需的23。振荡培养的菌液中菌毛表达效率较低，从而导致感染率不稳定。
  3. 测定过夜培养物在600 nm处的光密度（OD）600，并利用预先确定的生长曲线计算每毫升中的细菌数量。例如，对于UPEC菌株UTI89，OD600 = 0.35相当于每毫升2 × 108 CFU，因此，OD600 = 2.4的过夜培养物相当于每毫升13.7 × 108 CFU。每次使用新的感染菌株时，均应通过实验确定OD600与活菌数之间的关系。
  4. 根据拟感染动物数量确定所需细菌量，每只小鼠需在50 μl PBS中接种约107菌落形成单位（CFU）。计算时应包括导管和注射器乳头部分约130 µl的死体积，以及用于测定接种量的100 µl额外体积。
    1. 将细菌悬液在台式微量离心机中以17,000 × g离心1分钟，弃上清后将菌体沉淀重悬于PBS中，调整浓度至每毫升含2 × 108 CFU。取部分悬液进行系列稀释，涂布于含适当抗生素的LB琼脂平板，以确定每次感染的准确接种量。
  5. 将细菌接种液吸入1 ml注射器中，并将导管连接至注射器末端。轻弹注射器以排除气泡，推动活塞以填充导管内的死腔空间，然后开始灌注操作。

3. 小鼠的准备

  1. 麻醉小鼠 通过 腹腔注射 100 mg/kg 氯胺酮和 5 mg/kg 赛拉嗪。可提供辅助加热。 
  2. 通过中等力度捏压小鼠足垫，确保每只小鼠完全镇静。当小鼠无反应时，表明其已完全镇静，达到该状态通常需要 3 - 5 分钟。
  3. 将小鼠仰卧放置，对下腹部施加中等压力以排空膀胱中的尿液。充盈的膀胱在髂嵴之间的皮下触感类似于一颗豌豆。
    注意：已使用吸入式异氟烷对雌性小鼠进行插管15,22然而，尚未验证吸入异氟烷是否能使雄性小鼠在此操作中达到充分的麻醉效果。

4. 雌性小鼠的经尿道灌注

  1. 用非优势手将拇指放在小鼠尾部，同一只手的一根手指放在小鼠腹部，向相反方向施加轻柔压力，以牢固固定小鼠。
  2. 将导管尖端垂直于小鼠尿道口放置。施加轻柔压力，将导管滑入尿道，直至导管接头处到达尿道口，同时缓慢降低注射器，使其与操作台面平行。导管无需润滑。切勿推挤或强行插入导管。导管应能顺畅、轻松地滑入尿道，几乎无阻力。
    1. 在注入接种物（步骤4.3）之前，一旦导管就位，用非优势手上已置于小鼠腹部的手指，非常轻柔地将腹部皮肤向小鼠头部方向牵拉。如果导管位于尿道内，构成尿道口的组织不会移动；而如果导管误插入阴道，则该组织会随牵拉向上并远离导管。此快速检测应在每只小鼠上进行。
  3. 当导管接头处到达尿道口时，缓慢注入50 µl细菌接种液。缓慢注入可最大程度减少膀胱输尿管反流至肾脏。在数5下时间内缓慢撤出导管，以防泄漏。将小鼠以仰卧位放回笼中。

5. 雄性小鼠的经尿道灌注

  1. 用两把镊子分别夹住小鼠外生殖器的头侧和尾侧。向后退缩包皮，充分暴露阴茎头。当阴茎完全外露后，松开镊子。
  2. 重新放置镊子，将突出的阴茎固定成与动物体垂直的方向，轻柔但稳固地夹持阴茎。观察尿道外口，小心地将导管插入阴茎顶端的小开口中。轻柔地将导管沿阴茎向小鼠体内方向推进，同时用镊子保持轻微张力。导管无需润滑。切勿强行插入导管；导管应能顺畅滑入尿道，此为正确插入的标志。
  3. 当导管接头处到达阴茎尖端时，缓慢注入50 µl接种液，同时保持阴茎位置稳定。此时可根据预先设定的灌注质量评分标准（如图2所示）评估灌注质量。
  4. 缓慢撤出导管，用约5秒时间完成，以防止接种液泄漏。将小鼠仰卧放置于笼中。动物通常在麻醉给药后30–45分钟开始恢复。

6. 感染器官中菌落形成单位（CFU）的测定

  1. 在预定的时间点，按照批准的标准操作程序（例如，颈椎脱位或二氧化碳过量）处死小鼠。用70%乙醇充分润湿腹部，以减少毛发污染。
  2. 使用剪刀在小鼠腹部下三分之一处做一切口，长度至少2 cm，并无菌取出膀胱及其它所需器官（包括但不限于肾脏、睾丸、精囊、包皮腺），放入含有1 mL无菌PBS的5 mL聚丙烯 snap-cap 管中。所有样本均需保持在冰上。
  3. 使用手持式匀浆器对器官进行匀浆，直至几乎无固体组织残留，时间约为15–60秒，具体时长取决于器官类型。脂肪组织不易匀浆，通常呈现有光泽的浅黄白色，易于识别。在匀浆前或匀浆后应将其弃去。每次处理不同实验组或器官组之间，需先用乙醇清洗匀浆器，再用PBS冲洗。
    注意：通常使用手持式匀浆器或珠磨式匀浆器。尽管通过感染后24小时细菌CFU的直接比较表明，这些系统均可获得相似结果，但在常规开展本方案前，应通过实验确定在保持细菌活性的前提下匀浆宿主组织的最佳条件。
  4. 对匀浆后的器官悬液进行系列稀释。将稀释液接种至LB琼脂平板（如需要可含抗生素），于37 °C培养过夜（约15小时）。尿路致病性大肠杆菌（UPEC）菌株倍增速度极快，因此需注意避免培养时间过长，以免影响单个菌落的计数。

7. 膀胱组织的流式细胞术分析

  1. 在 PBS 中配制含有 34 单位/mL 胶原酶和 100 µg/mL DNase 的消化缓冲液，置于冰上。为每只待分析的小鼠准备一个 15 ml 锥形管，并向每管中分装 1 ml 消化缓冲液。
  2. 在预定时间点，按照批准的标准操作程序（例如，颈椎脱位或过量二氧化碳）处死小鼠。用 70% 乙醇充分润湿腹部，以最大限度减少毛发污染。
  3. 使用剪刀在小鼠腹部下三分之一区域做至少 2 cm 的切口，并完整取出膀胱。用剪刀充分剪碎膀胱组织，将其切成 2 - 3 mm2 大小的碎片，通常约为 8 块。
    1. 将每份剪碎的膀胱组织加入含有消化缓冲液的管中。轻轻振荡，使组织沉入消化缓冲液中。所有膀胱组织解剖和剪碎完成前，保持样品置于冰上。
  4. 将剪碎的膀胱组织在 37 °C 下孵育 60 - 75 分钟，每隔 15 分钟手动剧烈振荡 5 秒。当组织呈现透明玻璃样、类似湿滤纸的外观时，表明消化完成。过度消化会去除细胞表面用于鉴定的关键蛋白，应避免。
  5. 通过加入 2 - 3 mL 冰冷的流式细胞术缓冲液（含 2% 胎牛血清（FBS）和 0.2 mM EDTA 的 PBS）来灭活消化酶，并轻轻混匀。将试管置于冰上。
  6. 为确保获得单细胞悬液并去除任何结缔组织，将管内液体通过置于 15 mL 锥形管上的 100 µm 滤膜过滤。用注射器活塞末端轻轻压挤残留组织通过滤膜。再用额外 2 mL 流式细胞术缓冲液冲洗滤膜。样品始终保持在冰上。
  7. 在 200 × g、4 °C 条件下离心洗涤样品 7 分钟。将沉淀重悬于 100 µL 含 Fc 封闭剂（稀释至 5 µg/mL）的流式细胞术缓冲液中，并转移至 96 孔圆底板。10 - 15 分钟后，向每个样品中加入 100 µL 所需的抗体混合液。将样品在冰上避光孵育 30 - 45 分钟。
    注：Fc 封闭剂是一种用于防止抗体 Fc 段与表达 Fc 受体的细胞结合的试剂，其目的是减少非特异性抗体结合。所用抗体的选择取决于实验中检验的假设，应参考文献并结合研究目的进行选择。在 图 3 中，为检测整体免疫细胞浸润情况，使用了抗 CD45 抗体，该抗体识别一种泛免疫细胞蛋白。
  8. 在 200 × g、4 °C 条件下离心洗涤样品 7 分钟。将细胞沉淀重悬于 200 µL 流式细胞术缓冲液中，并在上机前通过置于 5 ml 聚苯乙烯管上的 40 µm 细胞筛网过滤。
  9. 在流式细胞仪上采集全部样品。良好的消化通常可从正常小鼠膀胱中获得 200,000 - 400,000 个细胞，其中包含 8,000 - 10,000 个 CD45+ 免疫细胞，而感染器官中的细胞数量更多16（图 3）。
    注：用于流式细胞术分析的样品不能用于评估菌落形成单位（CFU）。不建议将膀胱一分为二进行处理，因为目前尚无证据表明尿路致病性大肠杆菌（UPEC）定植或免疫细胞浸润在组织内分布均匀。

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结果

在本实验方案的开发过程中，对6至8周龄的雌性和雄性C57Bl/6小鼠进行了接种，并在感染后1小时至30天的不同时间点评估了膀胱中的细菌负荷。这些研究的结果已在其他文献中详细描述（Zychlinsky Scharff et al.，待发表）。本文展示了感染24小时后的代表性数据。值得注意的是，在感染后24小时，雄性和雌性小鼠之间的细菌负荷相当（图1）。感染后24小时，每组内部的细菌负荷变异较小，这与此前在雌性小鼠中报道的结果相似15,16。

如果在感染前注意充分排空小鼠膀胱中的尿液，则雌性小鼠中接种物明显泄漏的情况很少见。然而，在本方案的建立阶段，雄性小鼠的接种常导致大量细菌接种物从尿道泄漏。为了确定感染时接种物的丢失是否会影响细菌定植或感染的建立，我们为每次接种操作引入了评分系统。每次...

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讨论

雄性小鼠经尿道灌注为研究性别对膀胱黏膜疾病的影响提供了许多新的研究机会，但也存在若干挑战。首要的局限在于，该操作最初可能在技术上较为困难，导致导管插入时引发过度炎症反应。可通过使用染色溶液（如伊文思蓝染料）对死亡小鼠进行灌注练习，以提高操作技术。为确认灌注是否成功，应肉眼检查膀胱，并可通过结核菌素注射器抽取液体以评估灌注体积。缓慢、轻柔操作的重要性再怎么强调也不为过：插入导管时不应有任何阻力，也切勿施加外力，否则将导致过度炎症和组织损伤。若操作正确，导管应能无阻力地顺利滑入尿道。若感到阻力或阻塞，最佳做法是退出导管并重新尝试插入。

通过将灌注质量与感染后24小时的细菌负荷相关联，我们证明了即使在感染时损失少量细菌接种物的不完美操作技术，仍可导致膀胱中出现显著的细菌定植。在使用本方案时，研究者应力求实现无泄漏的灌注。然而，该实验方法的稳健性确保了即使灌注操作不够完美，仍可获得有用的数据和可解释的结果。

与目前唯一已发表的雄性膀胱感染替代方法相比，我们的技术具有显著优势，即采用非侵入性、非手术的方式。我们通过经尿道灌注的方法，遵循...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Matthieu Rousseau 博士对本文稿的审阅，以及树突状细胞免疫生物学实验室在本方案和项目开发过程中提供的有益见解。本工作部分得到了欧盟第七框架计划玛丽·居里行动项目（PCIG11-GA-2012-3221170）和免疫肿瘤学实验室卓越计划（MAI）的资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BD Insyte Autoguard 防护型静脉导管 24 G，外径 0.7 mm，长 14 mMBD Medical381811 或 381411** 目录编号因国家而异
接种环Greiner Bio-One731171
LB Miller 肉汤Difco244620
LB Miller 琼脂Difco244520
比色皿Bio-rad223-9955
注射器B Braun9166017V
持针钳（Adson）Fine Science Tools11006-12
5 ml 聚丙烯离心管Falcon352063
Tissue Ruptor 一次性探头Qiagen990890
15 ml 旋盖离心管Thermo Scientific362694
DNaseInvitrogen18047019
Liberase TMSigma-Aldrich5401119001应分装后于 -20 °C 保存，避免反复冻融
100 µM MACS SmartStrainers Miltenyi130-098-463适用于 15 ml 离心管，优先选用
100 µm 细胞筛网 Falcon352360适用于 50 ml 离心管，若无 MACS Smart Strainers 可替代使用
96 孔板Falcon353077
Fc 封闭抗体BD Pharmingen553142抗 CD16/CD32
抗小鼠 CD45 抗体BD Biosciences561487提供多种不同荧光标记选项
带滤芯盖的 5 ml 聚苯乙烯离心管Falcon352235
胰岛素注射器TerumoBS05M2913
手持式匀浆器Qiagen9001272TissueRuptor
流式细胞仪BD BiosciencesN/AFortessa SORP 
流式细胞术分析软件BD BiosciencesN/ADiva

参考文献

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