小型动物模型中的尿路感染：雄性和雌性小鼠的经尿道导管插入术

摘要

已建立的小鼠经尿道插管模型可用于研究膀胱病理状态，包括尿路感染，但该模型仅适用于雌性小鼠。本文介绍一种新的雄性小鼠经尿道灌注模型，将有助于推动在临床上和流行病学上存在显著性别差异的领域的研究。

摘要

尿路感染（UTI）在全球范围内极为常见，导致显著的发病率以及与医疗保健相关的高额费用。能够准确反映疾病发生和进展过程的小型动物模型，有助于解析宿主与病原体之间的相互作用，并研究感染过程中免疫反应的产生。在小鼠中，通过膀胱内灌注尿路致病性E. coli（占社区获得性尿路感染病因的85%以上）可重现人类感染过程中的多个阶段。然而直到最近，尿路感染模型仅能在雌性动物中建立。这一限制阻碍了对尿路感染及其他膀胱疾病（如膀胱癌）中性别相关差异的研究。本文介绍了一种对雄性小鼠进行膀胱灌注的方法，从而实现雌性和雄性动物之间的直接比较；同时提供了一套详细的流式细胞术检测膀胱组织的实验方案，以更深入地理解宿主对感染的免疫应答。上述方法将有助于识别导致尿路感染及其他膀胱相关疾病中性别差异的宿主因素。

引言

尿路感染（UTI）是发达国家最常见的感染性疾病之一¹。在新生儿和老年人群中，女性与男性的感染率相似²。然而，育龄期成年女性社区获得性尿路感染的发病率远高于男性^2,3。鉴于该疾病主要影响女性，基础与临床研究长期以来主要集中于女性尿路感染。然而，男性尿路感染是一个重要但研究不足的医疗挑战⁴。事实上，由于男性尿路感染常伴随更高的发病率，此类感染通常被定义为复杂性感染^4,5。

随着人们对性別差异在生理学和病理学中核心作用的认识不断深入，探索这一长期被忽视的疾病特征需要新的方法。性別差异在免疫和感染中起着至关重要的作用；女性自身免疫性疾病的发病率更高，而男性则更容易感染某些传染病，例如结核病、疟疾和艾滋病病毒^6,7。膀胱癌是另一种泌尿系统疾病，其在男性中的发病率显著高于女性，多项研究已表明雄激素在恶性肿瘤发生中具有重要作用^8,<....

方案

小鼠实验根据动物实验伦理委员会（Comité d'éthique en expérimentation animale Paris Centre et Sud）批准的第2012-0024号实验方案进行，符合欧盟2010/63号指令的要求。

1. 导管的制备

1. 为每组待感染的小鼠准备一个儿科静脉穿刺导管。按照制造商说明，利用内置弹簧装置将每个导管的针头卸下。丢弃针头，仅保留塑料静脉导管部分。
2. 在超净工作台中对导管进行紫外线（U.V.）照射灭菌，通常持续 25 - 30 分钟。
   注意：导管可重复用于多只小鼠，但在不同实验组、不同性别或不同细菌菌株之间应使用新的导管。

2. 用于感染的尿路致病性 E. coli 的制备

1. 感染前至少两天，使用无菌接种环从冻存的细菌菌种中挑取尿路致病性大肠杆菌（UPEC），划线接种于含有适当抗生素的Luria肉汤（LB）琼脂平板上。在37 °C下培养过夜。平板可在4 °C下保存最多一周。
2. 在100 ml无菌锥形瓶中，用LB平板上的单个菌落接种10 ml含适当抗生素的LB液体培养基，并于37 °C静置培养过夜（约16–18小时）。
   注意：静置培养有利于表达I型菌毛，而I型菌毛是感染所必需的²³。振荡培养的菌液....

结果

在本实验方案的开发过程中，对6至8周龄的雌性和雄性C57Bl/6小鼠进行了接种，并在感染后1小时至30天的不同时间点评估了膀胱中的细菌负荷。这些研究的结果已在其他文献中详细描述（Zychlinsky Scharff et al.，待发表）。本文展示了感染24小时后的代表性数据。值得注意的是，在感染后24小时，雄性和雌性小鼠之间的细菌负荷相当（图1）。感染后24小时，每组内部的细菌负荷变异较小，这与此前在雌性小鼠中报道的结果相似^15,16。

如果在感染前注意充分排空小鼠膀胱中的尿液，则雌性小鼠中接种物明显泄漏的情况很少见。然而，在本方案的建立阶段，雄性小鼠的接种常导致大量细菌接种物从尿道泄漏。为了确定感染时接种物的丢失是否会影响细菌定植或感染的建立，我们为每次接种操作引入了评分系统。每次.......

讨论

雄性小鼠经尿道灌注为研究性别对膀胱黏膜疾病的影响提供了许多新的研究机会，但也存在若干挑战。首要的局限在于，该操作最初可能在技术上较为困难，导致导管插入时引发过度炎症反应。可通过使用染色溶液（如伊文思蓝染料）对死亡小鼠进行灌注练习，以提高操作技术。为确认灌注是否成功，应肉眼检查膀胱，并可通过结核菌素注射器抽取液体以评估灌注体积。缓慢、轻柔操作的重要性再怎么强调也不为过：插入导管时不应有任何阻力，也切勿施加外力，否则将导致过度炎症和组织损伤。若操作正确，导管应能无阻力地顺利滑入尿道。若感到阻力或阻塞，最佳做法是退出导管并重新尝试插入。

通过将灌注质量与感染后24小时的细菌负荷相关联，我们证明了即使在感染时损失少量细菌接种物的不完美操作技术，仍可导致膀胱中出现显著的细菌定植。在使用本方案时，研究者应力求实现无泄漏的灌注。然而，该实验方法的稳健性确保了即使灌注操作不够完美，仍可获得有用的数据和可解释的结果。

与目前唯一已发表的雄性膀胱感染替代方法相比，我们的技术具有显著优势，即采用非侵入性、非手术的方式。我们通过经尿道灌注的方法，遵循.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD Insyte Autoguard 防护型静脉导管 24 G，外径 0.7 mm，长 14 mM	BD Medical	381811 或 381411*	* 目录编号因国家而异
接种环	Greiner Bio-One	731171
LB Miller 肉汤	Difco	244620
LB Miller 琼脂	Difco	244520
比色皿	Bio-rad	223-9955
注射器	B Braun	9166017V
持针钳（Adson）	Fine Science Tools	11006-12
5 ml 聚丙烯离心管	Falcon	352063
Tissue Ruptor 一次性探头	Qiagen	990890
15 ml 旋盖离心管	Thermo Scientific	362694
DNase	Invitrogen	18047019
Liberase TM	Sigma-Aldrich	5401119001	应分装后于 -20 °C 保存，避免反复冻融
100 µM MACS SmartStrainers	Miltenyi	130-098-463	适用于 15 ml 离心管，优先选用
100 µm 细胞筛网	Falcon	352360	适用于 50 ml 离心管，若无 MACS Smart Strainers 可替代使用
96 孔板	Falcon	353077
Fc 封闭抗体	BD Pharmingen	553142	抗 CD16/CD32
抗小鼠 CD45 抗体	BD Biosciences	561487	提供多种不同荧光标记选项
带滤芯盖的 5 ml 聚苯乙烯离心管	Falcon	352235
胰岛素注射器	Terumo	BS05M2913
手持式匀浆器	Qiagen	9001272	TissueRuptor
流式细胞仪	BD Biosciences	N/A	Fortessa SORP
流式细胞术分析软件	BD Biosciences	N/A	Diva