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延迟生长抑制试验定量分析细菌来源抗菌物质对竞争的影响

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DOI：

10.3791/54437

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2016年9月3日

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1Institute of Integrative Biology, University of Liverpool

本文内容

摘要

延迟生长抑制试验可用于评估一种细菌分离株对另一种细菌分离株的竞争作用。通过测量产抑制物分离株周围透明圈的范围来定量抑制作用，或通过判断可见抑制范围进行定性评估。

摘要

当产抑制物的菌株通过争夺必需营养物而胜过其竞争者，或产生竞争者无法耐受的抗菌化合物时，微生物群落中可能发生竞争性排斥。本文介绍一种延迟生长抑制试验，该方法可用于评估一种细菌通过产生抗菌化合物或营养竞争来抑制另一种细菌生长的能力。该技术已被用于研究鼻腔分离菌株与特定物种在群落中被排除之间的相关性。此外，该技术还可用于筛选乳酸菌素产生菌或潜在的新型抗菌物质。该实验首先将待测的产抑制物菌株在琼脂平板上过夜培养，然后喷洒上待测的竞争菌株，再次进行培养。培养结束后，可通过测量产抑制物菌株周围透明圈的大小进行定量分析，以及通过评估抑制圈的清晰程度进行定性分析，以判断抑制效果。本文提供了延迟抑制试验的标准操作流程，描述了减少实验间差异的方法，并定义了一个可用于定性评估抑制程度的清晰度等级标准。

引言

生活在群落中的细菌在种间和种内水平上相互竞争空间和营养资源6。微生物之间的竞争常常导致群落中某些特定物种或菌株被排除。这种排除可能是由于对特定受体或营养物质的竞争，或是由于群落中某一成员产生了抗菌化合物所致6。

研究竞争排斥现象时，通常通过16S rRNA测序来分析物种的存在与缺失3,4,13。然而，种内性状变异（例如是否产生抗菌肽）可能显著影响一个物种抑制另一物种的能力1。由于16S rRNA测序无法区分同一种内的不同菌株，因此无法评估种内性状变异。本文所述技术可用于评估单个菌株排斥其他细菌的潜力。该方法此前已被用于证明鼻腔菌群中具有抑制金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）能力的细菌的存在与S. aureus的缺失之间存在正相关关系7。

延迟生长抑制（竞争）实验可用于鉴定抑制菌株是否产生抗菌化合物或与竞争菌株争夺营养。该实验还可检测正向相互作用，即抑制菌株的存在实际上促进了竞争菌株的生长。此实验可生成定量数据（透明圈大小）和定性数据（抑制程度），这些数据均可与群落中物种存在与否的数据进行叠加分析，以揭示表型（性状）与竞争排斥之间的相关性7。

方案

以下方法经修改7,8，用于检测竞争菌株与产抑制剂菌株之间的相互作用。

注意：本实验方案涉及细菌培养物的气溶胶生成，必须在具备经当地批准的安全防护措施的封闭空间内进行。在二级生物安全柜内将菌液喷洒至琼脂平板，可最大限度减少琼脂平板及周围环境的污染，同时保护研究人员避免吸入喷雾产生的细菌气溶胶，这一点在使用二级生物安全等级微生物时尤为重要。必须穿戴适当的个人防护装备。建议用一次性吸水纸覆盖培养皿周围区域。喷雾操作后建议使用紫外光进行去污染处理。

1. 准备琼脂平板

  1. 根据制造商说明配制脑心浸出液（BHI）琼脂。
  2. 将BHI琼脂在121 °C、15 psi条件下高压灭菌20分钟，或按照高压灭菌器制造商的建议进行灭菌。
  3. 将15 ml无菌BHI琼脂分装至无菌培养皿中，静置使其凝固。
    注意：确保实验中使用的所有琼脂平板均来自同一批次的琼脂，并且每个平板中的琼脂量相同。这可以限制平板间营养物质的差异和抑制剂扩散的变异性，从而保证结果的可比性。

2. 准备无菌肉汤

  1. 根据制造商说明配制BHI肉汤。
  2. 将10 ml的BHI分装至28 ml玻璃广口瓶中。
  3. 在121 °C、15 psi条件下高压灭菌20分钟，或根据高压灭菌锅制造商的建议进行灭菌。
    注意：确保实验中使用的所有肉汤均来自同一批次、同时高压灭菌，以减少因营养成分差异导致实验结果波动。

3. 准备无菌雾化瓶

  1. 拆卸蒸发器瓶。
  2. 将5%表面活性清洁剂喷入蒸发器中，以清除内部污染物，并将蒸发器瓶、瓶盖和蒸发器部件浸泡于5%表面活性清洁剂中过夜。
    注意：操作表面活性清洁剂时应佩戴手套及适当的个人防护装备。
  3. 在无菌气流罩下干燥蒸发器、瓶盖和瓶子。
  4. 向瓶中加入70%乙醇，重新安装蒸发器，并将部分乙醇通过蒸发器喷出。
  5. 盖上瓶盖，保留乙醇于瓶内，直至使用前。
  6. 使用前立即用无菌BHI肉汤无菌冲洗瓶体，并将肉汤通过蒸发器喷出。
    注意：此举可防止乙醇影响6.3节中加入瓶内的接种物。

4. 准备细菌过夜培养物

  1. 将竞争菌株和抑制菌株划线接种至无菌BHI琼脂平板上，在37 °C有氧条件下培养约18小时（过夜）。
    注意：该平板可制备细菌储备液，若在4 °C保存，可在同一周内用于多次重复实验。
  2. 在28 ml通用瓶中，取单个所需竞争菌株菌落接种于10 ml无菌BHI液体培养基中。
  3. 将通用瓶置于37 °C有氧条件下，在摇床中以250 rpm振荡过夜培养。

5. 产抑制物菌株的点培养

  1. 按照第4节所述方法制备过夜培养物。
  2. 确保琼脂平板在接种前完全干燥，皿盖上无冷凝水。例如 通过在37 °C条件下孵育平板60分钟；这可以防止接种物从接种部位向平板其他区域扩散。
  3. 将25 µl过夜培养物用移液器加至琼脂平板中央。避免完全按压移液器按钮，以防产生气泡导致培养物飞溅至琼脂表面。
  4. 室温下干燥培养物以限制其扩散。将琼脂平板在37 °C有氧条件下孵育过夜。

6. 准备测试竞争菌株的喷雾接种液

  1. 按照第4节所述方法制备过夜培养物。将过夜培养物用BHI肉汤稀释10倍，得到浓度约为4 x 106 CFU ml-1、OD600为0.3 ±0.05的菌悬液。
    注意：并非所有细菌种类经10倍稀释后均可达到4 x 106 CFU ml-1，应通过将1 x 10-1至1 x 10-6的系列稀释液进行涂布平板计数，计算所需的稀释倍数。
  2. 将稀释后的菌液倒入无菌的塑料喷雾瓶中。
    注意：总体积应大于待喷洒的琼脂平板数量所需体积。每个平板约需250 µl，适用于直径为9 cm的培养皿。

7. 延迟生长抑制试验

  1. 通过每个喷雾瓶喷洒培养物，以确保在将培养物喷洒到琼脂表面之前，喷雾装置中已加载了培养物。
  2. 从距离琼脂表面约15 cm的高度，将约250 µl稀释后的培养物（典型50 ml喷雾瓶喷3次）均匀喷洒在整个琼脂表面。将琼脂平板在37 °C有氧条件下过夜培养。对其他平板重复相同操作，喷洒相同次数。

8. 解读延迟生长抑制试验结果

  1. 测量喷洒的竞争菌株的生长抑制圈直径（以毫米为单位）（图1A-C，"X"至"X"），并减去抑制物产生菌中央菌斑的直径（图1A-C，"Y"至"Y"）。
    注：图1E展示了该数据可能的呈现方式
  2. 记录抑制圈的清晰度评分。
    注：该评分表示观察到的抑制程度。图1A-D中展示了示例，代表性结果部分建议了可用于标准化的菌株。可采用以下标准进行清晰度评分：评分为0表示竞争菌株的生长被完全抑制；评分为1表示生长几乎被完全抑制，仅在澄清区中存在个别菌落；评分为2表示可见生长减弱区域，该区域内的菌落呈融合或接近融合状态，但密度减少超过>50%；评分为3表示仅有轻微生长抑制，菌落仍融合，密度减少不足50%，但抑制圈仍可见且可测量；评分为4表示无可见的生长抑制；评分为5表示竞争菌株在待测抑制物产生菌附近生长增强。示例见图1。这些评分具有实验者的主观性。

9. 重复实验

  1. 至少进行三次生物学重复实验，以确定所得结果的可重复性。
    注意：若在不同日期进行重复实验，应在平板从培养箱取出后立即进行测量和评分，随后将平板储存于 4 °C 或在丢弃前拍摄高质量照片。保存平板或拍摄照片可便于在不同日期之间进行结果比较，这对于确认跨天数/实验的可重复评分尤为重要。需注意，平板的储存可能会影响实验结果。
    注意：为获得清晰的照片，应将无盖平板垂直放置于漫射光环境下的哑光黑色背景上，使用高分辨率相机（≥800 万像素），并具备对焦近镜头物体的能力（微距模式）。或者，也可使用某些配备白光透射光源的凝胶成像系统，以获得高质量且高度可重复的图像。

结果

实验结果应表现为在中心点样产抑制物菌株附近的重叠竞争菌株之间存在差异（图1）。这些差异可解释为完全抑制（图1A）、部分抑制（图1B 和 图1C）、无抑制作用（图1D）或正向关联。在 图1B 和 图1D 中分别使用了实验室广泛使用的菌株 S. epidermidis Tü3298 与 S. epidermidis Rp62A，以及 S. epidermidis Rp62A 与 S. aureus Newman。我们建议可采用这些菌株来验证本实验方案。

根据所测试的物种不同，完全抑制和部分抑制最有可能是由抑制菌株产生的抗菌肽、抗生素或其他可扩散的生长抑制物质所导致。部分抑制也可能与抑制菌株对营养物质的吸收或螯合作用导致竞争菌株营养供应减少有关6。

比较不同产抑制物分离株对同一竞争菌株产生的抑菌圈大小，可反映以下任一方面的差异：产抑制物菌株产生的抗菌物质数量、抑制物在培养基中的扩散能力、所产生的抑制物的类型，以及竞争菌株对所产抑制物的耐受水平。比较同一产抑制物菌株对不同竞争菌株产生的抑菌圈大小，可反映竞争菌株对该抑制物的耐受水平。

结果会因所使用的抑制菌株和竞争菌株的不同而有所差异。使用相同抑制菌株和竞争菌株的重复实验 ideally 应具有相同的透明度评分（见第8.2节），这表明整个实验过程中采用了良好的实验技术。

如果细菌接种不一致，则不应使用这些平板。例如，若测试的竞争菌培养物浓度过低，抑菌圈将比通常观察到的更大，且边缘不够清晰（图2A）；这会影响任何比较性抑菌圈测量结果的可靠性。如果产抑制物菌株的点样在过夜培养前未完全干燥，则该抑制菌株可能扩散，无法形成边界清晰的菌点（图2B），这通常会影响抑菌圈的测量，也可能影响清晰度评分。如果竞争菌株喷洒不均匀，则可能导致细菌分布不均（图2C）。若竞争菌株浓度过高，有可能导致其在抑制菌株上方生长（图2C），在极端情况下，甚至可能导致竞争菌株与抑制菌株功能角色的部分反转。

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图1： 延迟生长抑制试验可获得的定性与定量结果范围。 生长抑制的结果范围可从（A）完全抑制（评分为0）、（B）部分抑制（评分为1）、（C）部分抑制（评分为2）到（D）无抑制（评分为4）。标签表示抑制菌株（Y）的生长边缘以及抑制圈最外缘（X）。抑制圈的尺寸范围从0 mm到超过10 mm，如（E）所示，该图展示了A、B、C和D中拍摄的平板的测量结果。结果显示了近期分离的葡萄球菌（A、C），或常见的实验室葡萄球菌分离株S. epidermidis Tü3298（抑制菌）与S. epidermidis Rp62A（竞争菌）（B），以及S. epidermidis Rp62A（抑制菌）与S. aureus Newman（竞争菌）（D）的结果。请点击此处查看此图的放大版本。

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图2： 因操作技术不佳导致结果不一致的示例。 如果（A）竞争菌株浓度过低，（B）抑制菌株在孵育前未完全干燥或培养皿表面有湿气，或（C）竞争菌株喷洒不均匀且密度过高，则结果可能与预期不同。请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

该细菌物种竞争实验方案的一个关键步骤是，在加入竞争菌株之前，需对抑制菌株进行过夜培养，此步骤使其区别于其他方法。 抑制菌株需要这段生长期以产生抑制性化合物。由于竞争菌株被接种在同一培养基的表面，该方法使研究人员能够观察到抑制菌株干扰竞争菌株生长的全部潜力 。因此，该实验反映了自然界中发生的情况：一个菌株已完全占据某一生态位，而另一个菌株必须能够抵消任何抑制性因素，才能成功入侵该生态位。

本方案中有两个步骤若操作不当，最有可能导致错误结果。首先，汽化器瓶灭菌不完全可能会将污染细菌引入检测体系。可通过在第3.6步中将用于冲洗汽化器瓶的肉汤置于无菌容器中孵育，以确认瓶子是否已完全灭菌。如果需要更强的灭菌效果，在第3.2步所述使用表面活性清洁剂清洗之前，可先用消毒剂溶液（如Virkon）进行额外清洗。

可能导致错误结果的第二个步骤是竞争菌株的稀释（步骤6.1）。如果稀释比例不理想，则可能难以清晰测定抑制作用。本实验已利用多种来自鼻腔分离株作为抑制物产生菌，针对广泛种类的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，以S. aureus SH1000作为竞争菌株进行了优化7,8。随后，该方法还测试了多种凝固酶阴性和凝固酶阳性的葡萄球菌作为竞争菌株或抑制物产生菌。当测试上述未提及的属作为竞争菌株时，可能需要对接种物的稀释比例进行一定优化。

如果重复实验之间的清晰度评分存在显著差异，可能需要通过将竞争菌株的接种物调整至特定的光密度值来实现标准化。然而，这将延长实验的准备时间，并可能减少每次实验可处理的菌株数量。使用麦氏比浊标准通过肉眼将培养物调整至适当的OD值，可能是一种快速的替代方法。

该技术的一个局限性在于，它仅适用于可培养的细菌。因此，许多研究采用16S rRNA测序来预测竞争排斥相互作用3,4,13。然而，基因组学和宏基因组学技术通常只能将群落成员区分到物种水平，和/或无法反映特定种内性状的变异。尽管可以通过筛查某一编码特定性状的基因是否与某细菌物种的存在或缺失相关联来开展研究5，但这种方法需要预先了解可能与该物种排斥相关的基因。

该技术的一项安全考虑是，由于会产生含细菌的气溶胶，因此只能在配备二级生物安全柜或采取类似安全防护措施的实验室中使用。存在其他可替代的技术用于检测分离株之间的竞争关系，这些方法能够考虑种内性状变异，且不会产生细菌气溶胶。其中一种方法是同时拮抗试验2。在此方法中，先将一种分离株的接种物涂布于琼脂平板上，待其干燥后，再将第二种分离株的接种物点种或穿刺接种于其表面。这将形成两种菌株直接竞争的环境（即同时拮抗），二者均会竞争率先产生抑制性化合物并争夺营养物质。相较于同时拮抗试验，延迟生长抑制试验的优势在于，抑制性分离株在竞争菌株入侵之前已完全定植，因而始终具有竞争优势。这种情况更贴近自然环境中的实际情形，因为在大多数生态位中，通常是一种分离株先建立定植，随后才引入另一种菌株，而不是两种分离株同时被引入8。

另一种避免细菌气溶胶产生的替代方法是将竞争菌株加入顶层琼脂中，然后将顶层琼脂倾倒而非喷洒在抑制菌株上。然而，为确保平板表面均匀覆盖，所加入的顶层琼脂体积需约为 3 ml。在此体积中，竞争菌株不会在与抑制菌株相同的培养基上生长，因此不会因营养减少而受影响。此外，在抑制性化合物扩散进入顶层琼脂之前，竞争菌株也不会直接接触这些抑制物质。此类实验不能被描述为延迟抑制或同时拮抗作用。

此前已有类似方法用于评估临床分离的S. aureus菌株对杆菌肽的耐药水平10。本文所述方案与文献10所述方法的主要区别在于，后者仅将竞争菌株分为敏感型（完全抑制，透明度评分为0）和耐药型（部分至无抑制，透明度评分为1–5）。因此，延迟生长抑制试验也可用于筛选对特定抗菌物质产生菌具有不同耐药水平的菌株，甚至可用于寻找对多重耐药病原菌具有活性的新型抗菌物质。

有研究提出，可以通过调控宿主微生物群来清除细菌群落中不理想的成员9。已有研究表明，在相当一部分人群中，使用棒状杆菌或表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）可有效消除鼻腔内金黄色葡萄球菌（S. aureus）的定植11,12。因此，通过本文所述此类技术，研究能够竞争性排斥宿主正常菌群中有害成员的特定菌株，可能为未来开发新型治疗手段提供方向。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

JCM 由英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC-IPA）与联合利华公司（Unilever Plc）联合资助（项目编号：BB/L023040/1）。HAG 由沙特阿拉伯高等教育部提供的博士生奖学金资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
脑心浸出液肉汤Lab Mlab049营养丰富的通用培养基
琼脂Merck Milipore101614
培养皿Sarstedt82.1473.001
塑料香水喷雾瓶未知-高10 cm、直径3.5 cm的透明塑料喷雾瓶，带盖，购自超市旅行用品区
通用瓶已停产，可选用替代品 SLS BOT500628 ml 玻璃圆柱形瓶（直径约280 mm，高850 mm），平底，带塑料螺旋盖
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参考文献

  1. Bolnick, D. I., et al. Why intraspecific trait variation matters in community ecology. Trends Ecol Evol. 26 (4), 183-192 (2011).
  2. Christensen, G. J. M., et al. Antagonism between Staphylococcus epidermidis and Propionibacterium acnes and its genomic basis. BMC Genomics. 17 (152), (2016).
  3. Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PloS Comput Biol. 8 (7), (2012).
  4. Frank, D. N., Feazel, L. M., Bessesen, M. T., Price, C. S., Janoff, E. N., Pace, N. R. The Human nasal microbiota and Staphylococcus aureus carriage. PLoS One. 5 (5), e10598(2010).
  5. Fredheim, E. G., Flaegstad, T., Askarian, F., Klingenberg, C. Colonisation and interaction between S. epidermidis and S. aureus in the nose and throat of healthy adolescents. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 34, 123-129 (2015).
  6. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).
  7. Libberton, B., Coates, R. E., Brockhurst, M. A., Horsburgh, M. J. Evidence that intraspecific trait variation among nasal bacteria shapes the distribution of Staphylococcus aureus. Infect Immun. 82 (9), 3811-3815 (2014).
  8. Libberton, B., Horsburgh, M. J., Brockhurst, M. A. The effects of spatial structure, frequency dependence and resistance evolution on the dynamics of toxin-mediated microbial invasions. Evol appl. 8, 738-750 (2015).
  9. Liu, C. M., et al. Staphylococcus aureus and the ecology of the nasal microbiome. Sci Adv. 1, e1400216(2015).
  10. Nascimento, J. S., Ceotto, H., Nascimento, S. B., Giambiagi-deMarval, M., Santos, K. R., Bastos, M. C. Bacteriocins are alternative agents for control of multiresistant staphylococcal strains. Lett Appl Microbiol. 42, 215-221 (2006).
  11. Park, B., Iwase, T., Liu, G. Y. Intranasal application of S. epidermidis prevents colonization by methicillin-resistant Staphylococcus aureus in mice. PLoS One. 6 (10), e25880(2011).
  12. Uehara, Y., et al. Bacterial interference among nasal inhabitants: eradication of Staphylococcus aureus from nasal cavities by artificial implantation of Corynebacterium sp. J Hosp Infect. 44, 127-133 (2000).
  13. Wos-Oxley, M. L., et al. A poke into the diversity and associations within human anterior nare microbial communities. ISME J. 4, 839-851 (2010).

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