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方法文章

小鼠皮下与鼻内接种卡介苗后的保护效力及肺部免疫应答

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DOI：

10.3791/54440

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2016年9月19日

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, University of Zaragoza

本文内容

摘要

本文详细阐述了在小鼠模型中通过鼻内和皮下接种卡介苗（BCG）来比较其保护效果及肺部免疫反应的方法学。我们的结果表明肺部疫苗接种具有优势，并提示IL-17介导的免疫反应在疫苗诱导的保护作用中发挥一定作用。

摘要

尽管卡介苗（BCG）皮内接种已在全球广泛应用，结核病仍然是世界上最为普遍的传染病之一。临床前研究数据支持将肺结核疫苗作为预防肺部疾病（导致传播的主要形式）的一种有前景的策略。在本研究中，我们描述了在小鼠模型中用于比较鼻内接种与皮下接种卡介苗优势的方法学。我们的数据显示，鼻内接种卡介苗具有更强的保护效力。此外，结果表明，肺部接种可在肺组织中引发更强的免疫应答，包括Th1和Th17型免疫反应，以及呼吸道中免疫球蛋白A（IgA）浓度的升高。我们的数据还显示，在结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）攻击后，保护效力与肺部产生IL-17的细胞数量之间存在相关性，提示该细胞因子在肺部疫苗接种所介导的保护性免疫应答中发挥重要作用。最后，我们详细阐述了为研究小鼠模型中呼吸道疫苗接种所建立的整体工作流程，该流程可推广应用于其他针对黏膜免疫应答或经气管、气溶胶等其他肺部给药途径的结核病疫苗，而不仅限于卡介苗。

引言

结核病（TB）是全球主要的传染病之一，其相关死亡人数超过艾滋病病毒（HIV），加之耐多药菌株日益增多，使结核病成为令人担忧的全球公共卫生问题1。迫切需要开发新的诊断工具、更有效且毒性更小的药物，以及安全有效的新型结核病疫苗，尤其是在发展中国家。

目前，减毒活疫苗卡介苗（Bacille Calmette-Guerin, BCG）是唯一获准用于预防结核病的疫苗，自20世纪70年代以来在全球范围内于新生儿期通过皮内注射接种。卡介苗被认为可有效预防儿童重症结核病（如结核性脑膜炎和粟粒性结核），但对导致疾病传播的肺结核保护效果不一致2。

肺部疫苗接种模拟了结核病（TB）的自然感染途径，是激发局部宿主免疫反应的一种理想策略。在这方面，多种相关结核病动物模型中的不同临床前研究已表明，与皮下或皮内接种途径相比，肺部免疫可带来更高的疫苗保护效果3-6。然而，肺部疫苗接种所触发的保护机制尚未被充分阐明。近年来，多项研究指出，IL17介导的免疫反应是结核病特异性黏膜免疫反应的重要因素，因为在缺乏IL17的小鼠模型中，黏膜疫苗诱导的保护效果显著降低7,8。

最近，我们首次证明了鼻内接种卡介苗（BCG）可保护DBA/2小鼠，该小鼠品系的特点是皮下接种BCG后缺乏保护作用9。这些结果提示，在结核病流行国家，呼吸道结核疫苗接种可能比皮内接种BCG更有效地降低结核病发病率，因为在这些地区皮内接种BCG被认为对肺结核无效。

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方案

所有小鼠均在受控条件下饲养，并观察是否有任何疾病的迹象。实验工作遵循欧洲和国家关于实验动物保护的法规，并获得当地伦理委员会的批准。

1. BCG丹麦株甘油定量保存液的制备 结核分枝杆菌 H37Rv

注意：所有所述实验方案均在BSL3条件下进行。

  1. 解冻BCG Danish或H37Rv菌株的甘油冻存液，取100 μl接种于10 ml添加了0.05%（v/v）Tween-80和10%（v/v）ADC（白蛋白、葡萄糖、过氧化氢酶）的7H9培养基中10。
  2. 在37 °C静置培养一周，直至菌液进入对数生长期。
  3. 将10 ml培养物转接至200 ml新鲜培养基中扩大培养，在静置条件下继续培养20天。
  4. 转移至50 ml离心管中，以2500 × g离心15分钟。
  5. 弃去上清液，用残留液体重悬菌体沉淀，每管加入无菌的直径3 mm玻璃珠（每管10–15颗）。
  6. 剧烈涡旋振荡1分钟以分散细菌团块，将每管沉淀重悬于10 ml含0.05%（v/v）Tween-80的PBS中。
  7. 静置10分钟，使较大的细菌聚集体和玻璃珠充分沉降。
  8. 从含有较小团块和单个细菌的4个离心管中各取9.5 ml上清液，合并至一个洁净的50 ml离心管中（最终回收体积为38 ml），以400 × g离心10分钟。
  9. 将35 ml上清液（主要含单个细菌）转移至一个新的50 ml离心管中，加入15 ml含50%（v/v）甘油的PBS，使终浓度为15%（v/v）甘油。
  10. 轻轻混匀后分装为每份1 ml，置于适宜冻存管中，于-80 °C保存（一批可获得约50份甘油保存菌种）。
  11. 为定量甘油保存菌种，于冻存次日取出一份甘油菌种，用含900 μl PBS的1.5 ml离心管进行七次十倍系列稀释。
  12. 取每种稀释液100 μl接种于添加10%（v/v）ADC、制备于直径55 mm培养皿中的7H10固体琼脂培养基10上。
  13. 小心加入直径3 mm玻璃珠（每皿约10颗），轻轻摇动培养皿使液体均匀分布于琼脂表面，随后弃去玻璃珠，并用封口膜密封培养皿。
  14. 在37 °C培养21天，通过计数菌落形成单位（CFU）来确定细菌浓度，选择单菌落可清晰分辨的稀释度进行计数。

2. 小鼠疫苗接种

  1. 解冻预定量的BCG甘油菌液，并用PBS稀释，制备两种悬浮液。根据每只动物皮下接种剂量为100 μl（皮下免疫剂量为每毫升107 CFU）和鼻内接种剂量为40 μl（鼻内免疫剂量为每剂2.5 × 107 CFU），计算最终体积。
  2. 使用专用于啮齿类动物的麻醉工作站，以异氟烷与氧气混合气体对小鼠进行麻醉。使用5%异氟烷诱导麻醉，2%异氟烷维持麻醉状态。 （也可使用其他被认可的麻醉方法）。
  3. 进行皮下疫苗接种时，用1 ml注射器配26 G针头吸取1 ml细菌悬液（107 CFU/ml），并排除气泡。
  4. 将已麻醉的小鼠置于超净台内平坦表面上，呈俯卧位，于小鼠背部一侧皮下接种100 μl疫苗（每剂106 CFU）。 接种后将小鼠放回笼中，并密切观察，确保其从麻醉中正常恢复。
  5. 每次接种小鼠之间需更换注射器针头，并按上述方法排除气泡。
  6. 进行鼻内接种时，将已麻醉的小鼠置于超净台内，呈仰卧位。
  7. 使用微量移液器吸取20 μl含2.5 × 107 CFU/ml的菌液，将接种液逐滴滴入小鼠两鼻孔之间，直至全部体积滴完，每滴之间留出时间让小鼠吸入。 注意：小鼠在此过程中可能出现呼吸困难，因此应让其充分吸收每滴液体后再给予下一滴，以尽可能避免该情况发生。
  8. 再次用微量移液器吸取20 μl菌液，重复上述操作。若小鼠在第一次接种后开始苏醒，应在第二次接种前将其重新放入麻醉舱中。 接种完成后将小鼠放回笼中，并确保其从麻醉中完全恢复。

3. 小鼠经鼻接种 H37Rv 菌株

  1. 解冻预先定量的H37Rv甘油菌液，并用PBS稀释，制备浓度为每毫升2,500 CFU的细菌悬液。根据每只动物接种剂量为40 μl，计算所需的终体积。
  2. 按2.5–2.7所述方法经鼻内接种H37Rv。每只小鼠的最终攻毒剂量为102 CFU/40 µl。

4. 肺部诱导免疫反应的分析

  1. 肺组织单细胞悬液制备
    注意：评估疫苗诱导的肺部适应性免疫应答需要制备单细胞悬液。为此，我们使用组织解离仪（如 GentleMACS）。
    1. 通过颈椎脱位法（或其他公认的安乐死方法）处死小鼠，并通过触碰眼球确认角膜反射消失以确保小鼠已死亡。
    2. 在超净工作台内，使用无菌剪刀和镊子取出肺组织，置于洁净表面。清除气管和结缔组织后，将肺组织转移至含有 PBS 的 1.5 ml 离心管中（处理前保持冰上放置）。
    3. 为制备细胞悬液，将肺组织放入适用于器官解离的专用管（C-解离管），加入 5 ml 解离缓冲液，其成分为 10 mM HEPES-NaOH（pH 7.4）、150 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl2 和 1.8 mM CaCl2。
    4. 加入 100 μl 胶原酶 D（100 mg/ml，终浓度为 2 mg/ml）和 40 μl DNA酶 I（20,000 IU/ml，终浓度为 160 IU/ml）。
      注意：胶原酶 D 和 DNase I 的储存液分别通过将冻干酶溶解于 PBS 或含 50%（v/v）甘油、20 mM Tris-HCl（pH 7.5）和 1 mM MgCl2 的溶液中配制而成。
    5. 将管子放入组织解离仪中，使用预设程序 m_lung_01 进行肺组织破碎，随后将管子置于 37 °C 水浴中孵育 30 分钟。
    6. 再次将管子放入解离仪中，使用预设程序 m_lung_02 完全均质化肺组织，获得单细胞悬液。
    7. 将细胞悬液通过装在 50 ml 离心管上的 70 μm 尼龙细胞筛过滤，并用 10 ml RPMI 1640 培养基冲洗滤网。
    8. 以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
    9. 加入 1 ml 红细胞裂解液，涡旋混匀，在室温下孵育 1 分钟。
    10. 加入 10 ml RPMI 1640 培养基，以 400 × g 离心 5 分钟。
    11. 将细胞重悬于 0.5 ml 完全 RPMI 1640 培养基中，该培养基补充有 10% 热灭活胎牛血清（FCS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 μg/ml 链霉素、100 IU/ml 青霉素和 50 μM 2-巯基乙醇。
      注意：FCS 通过在 56°C 孵育 30 分钟进行灭活。
    12. 计数细胞，并加入完全 RPMI 1640 培养基，使最终细胞密度达到 107 个细胞/ml。
      注意：细胞计数我们采用自动细胞计数仪。
    13. 将 100 μl 细胞悬液分装至 U 型底 96 孔无菌培养板中（每孔含 106 个细胞）。
    14. 每孔加入 50 μl 含 15 μg/ml 商业 H37Rv 纯化蛋白衍生物（PPD）的完全 RPMI 1640 培养基（终浓度为 5 μg/ml）。
  2. ELISA 法检测细胞因子时的上清液收集
    1. 将步骤 4.1.14 所得培养板在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 48 小时。
    2. 以 400 × g 离心 5 分钟，收集 100 μl 上清液。
    3. 于 -80 °C 保存。
    4. 分别将上清液用检测缓冲液稀释 1/10 和 1/2，用于 IFNγ 和 IL-17A 的测定。根据制造商说明书（ELISA 开发试剂盒）使用商用 ELISA 试剂盒测定细胞因子浓度。
  3. 流式细胞术检测细胞内染色以分析产细胞因子的 CD4+ 细胞
    1. 将步骤 4.1.14 所得培养板在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 18 小时。
    2. 向每孔加入 1.5 μl Brefeldin A（1 mg/ml 储存液，溶于 DMSO），使终浓度为 10 μg/ml，继续孵育 6 小时。
    3. 将步骤 4.3.2 的培养板以 3,200 × g 离心 1 分钟，弃去上清液。
    4. 将细胞重悬于 50 μl 抗小鼠 CD4-FITC 抗体溶液中（用含 10% FCS 的 RPMI 1640 培养基按 1:500 稀释），4 °C 孵育 10 分钟。
    5. 将步骤 4.3.4 的培养板以 3,200 × g 离心 1 分钟，弃去上清液，每孔加入 100 μl 固定液，4 °C 孵育 20 分钟。
    6. 用 150 μl/次的破膜缓冲液洗涤细胞两次。
      注意：10 倍浓缩储存液需用去离子水稀释配制成 1 倍工作液。
    7. 将细胞重悬于 50 μl 破膜缓冲液中，其中含抗小鼠 IFNγ-APC 和抗小鼠 IL-17A-APC.Cy7 抗体（两种抗体均按 1:250 稀释）。
    8. 室温孵育 1 小时。
    9. 用 150 μl/次的破膜缓冲液洗涤细胞两次。
    10. 将细胞重悬于 200 μl PBS 中，用于流式细胞术检测。

5. 支气管肺泡灌洗液（BAL）中免疫球蛋白的分析

  1. 获取支气管肺泡灌洗（BAL）样本
    1. 通过颈椎脱位（或其他公认的安乐死方法）处死小鼠，并通过触碰眼球确认无眨眼反射以确保小鼠已死亡。
    2. 使用无菌精细镊子和剪刀暴露气管，在气管上做一小切口，注意不要完全切断。操作时应避免出血，以防污染BAL样本。
    3. 将连接至含800 μl冰浴PBS的无菌1 ml注射器的套管插入气管。
    4. 缓慢将PBS注入肺部，然后通过极其缓慢地回抽注射器活塞回收BAL液体，以避免肺塌陷。
      注：回收500至600 μl为理想范围。
    5. 将回收的BAL液体转移至1.5 ml离心管中，并确认液体无色，表明未被血液污染（转移后保持在冰上直至处理）。
    6. 以400 × g离心5分钟，将上清液转移至新管中。
    7. 将上清液于-80 °C保存。
  2. 测定BAL上清液中的IgA
    注：所有试剂均在室温下使用。
    1. 使用PBS稀释的PPD溶液（10 μg/ml）100 μl包被高蛋白结合力的聚苯乙烯平底96孔板，用于检测M. tuberculosis特异性IgA；或使用PBS稀释10倍的BAL上清液100 μl包被，用于总IgA测定。
    2. 于4 °C孵育过夜。
    3. 弃去上清液，将板在纸巾上轻拍干燥，每孔用200 μl PBS洗涤。
    4. 每孔加入200 μl含1%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）和0.05%（v/v）Tween-80的PBS缓冲液（封闭缓冲液）进行封闭。
    5. 室温孵育1小时。
    6. 每孔用200 μl含0.05%（v/v）Tween-80的PBS缓冲液（洗涤缓冲液）洗涤一次。
    7. 向PPD包被的孔中加入100 μl未稀释的BAL上清液，室温孵育2小时。
      注：若同时进行总IgA与PPD特异性IgA检测，则在此孵育期间，总IgA检测孔中应保留100 μl洗涤缓冲液。
    8. 用洗涤缓冲液每孔200 μl洗涤三次。0170004
    9. 每孔加入100 μl用封闭缓冲液稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记抗小鼠IgA抗体（1/10,000稀释）。
    10. 室温孵育1小时。
    11. 用洗涤缓冲液每孔200 μl洗涤五次。
    12. 每孔加入100 μl 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）显色底物，室温避光孵育20分钟。
    13. 每孔加入100 μl 0.5N H2SO4终止反应，使用酶标仪在450 nm波长读取吸光度。

6. 肺组织中细菌载量的测定

  1. 肺组织匀浆与涂板
    1. 攻毒后四周，通过颈椎脱位（或其他公认的安乐死方法）处死小鼠，并通过触碰眼球确认无眨眼反射以确保小鼠已死亡。
    2. 将小鼠仰卧固定在超净工作台内平坦且已消毒的表面上。
    3. 切开胸部皮肤，暴露胸腔区域。
    4. 使用无菌剪刀和镊子剪除肋骨，取出肺和心脏。将器官置于洁净表面。
    5. 去除心脏、气管及结缔组织以清理肺组织，然后将肺转移至含有1 ml去离子水的1.5 ml离心管中（处理前保持在冰上）。
    6. 使用无菌镊子将每只小鼠的肺组织转移至适合组织匀浆的离心管（M-解离管）中，每管加入1 ml去离子水。
    7. 将离心管放入组织解离仪中，使用预设程序RNA_1对肺组织进行匀浆处理。
    8. 在1.5 ml离心管中进行五次十倍系列稀释，起始为取100 μl肺匀浆加入900 μl去离子水中。
    9. 按照6.1.11–6.1.14步骤进行稀释液涂板。
  2. 通过PCR区分BCG与H37Rv
    注：在6.1.6步骤获得的经鼻腔途径接种BCG疫苗组的平板中，我们通过特异性PCR对代表性数量的菌落进行了BCG与H37Rv的鉴别分析，以确保用于评估疫苗保护效果的菌落形成单位（CFU）仅来源于H37Rv。该PCR靶向扩增RD9区域，该基因组区域在BCG与结核分枝杆菌（M. tuberculosis）之间存在差异，H37Rv扩增产物为2618 bp，BCG为465 bp11。
    1. 根据下述每样本所需体积配制所有样本的主混合液（Master Mix），然后分装至PCR管中（每管9 μl）。
      注：5×缓冲液：2 μl；正向引物25 μM（GTGTAGGTCAGCCCCATCC）：0.32 μl；反向引物25 μM（GCCCAACAGCTCGACATC）：0.32 μl；Taq DNA聚合酶（5单位/μl）：0.04 μl；去离子H2O：6.32 μl。
    2. 用无菌牙签挑取单个菌落，并将带有样本的牙签浸入含有主混合液的PCR管中。
    3. 使用以下程序运行PCR反应：95 °C孵育10分钟（此步骤用于诱导细菌裂解），随后再次95 °C孵育10分钟（此步骤用于诱导细菌裂解），接着进行35个循环（95 °C变性30秒，58 °C退火1分钟，72 °C延伸4分钟）。
    4. 将PCR产物上样至含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶中，电泳以观察扩增片段。

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结果

本研究描述了卡介苗（BCG）两种给药途径的比较：皮下注射和鼻内接种。皮下注射途径与目前全球临床使用的卡介苗皮内注射途径相似。鼻内接种的目的是模拟结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的自然感染途径，旨在直接在肺部诱导免疫反应，因为肺是该病原体的主要靶器官。

图1 描述了所遵循的工作流程。使用8至10周龄雌性DBA/2小鼠，以106 通过皮下或鼻内途径接种 BCG Danish 后的菌落形成单位（CFU）测定。接种八周后，处死一组小鼠以分析疫苗诱导的肺部免疫反应。首先收集支气管肺泡灌洗（BAL）样本，随后收获肺组织。为评估疫苗提供的保护效力，我们对另一组小鼠进行低剂量鼻内攻击接种 M. tuberculosis H37Rv 菌株。一个月后，处死动物并采集肺组织。在此过程中，每只动物的左肺用于测定细菌载量，右肺用于评估攻毒后疫苗诱导的免疫应答。目的是获取每只...

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讨论

尽管目前针对结核病的卡介苗（BCG）是人类历史上应用最广泛的疫苗，结核病仍然是全球由传染病引起的死亡和发病的主要原因之一。这一矛盾现象的原因在于该疫苗对肺结核缺乏保护作用，而肺结核正是导致疾病传播的主要形式。迫切需要开发对肺结核形式有效的新型疫苗策略，因为这类疫苗将对全球结核病的传播产生最大的遏制作用。

我们的数据清楚地表明，改变卡介苗（BCG）的给药途径以模拟自然感染途径，可能是一种预防肺结核的有效策略。我们的结果与其他研究者在不同动物模型（包括豚鼠和非人灵长类动物）中获得的类似数据一致6,9,12。

值得注意的是，我们的未发表数据表明，鼻内给药的体积是该方案中的关键步骤。这些结果表明，在鼻内递送重悬于10 μl（而非40 μl）中的100个H37Rv细菌后，仅约20%的动物中可回收到肺部菌落形成单位（CFUs）（数据未显示）。

重要的是，鼻内给药作为一种临床疫苗递送途径，其可能的局限性之一是与中枢神经系统相邻近13,14。在...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由“西班牙经济与竞争力部”[资助号 BIO2014-5258P] 和“欧盟委员会”通过 H2020 项目[TBVAC2020 643381 资助号]资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Middlebrook 7H9 肉汤BD271310
Middlebrook ADC 增菌液BD211887
Tween 80ScharlauTW00800250
直径3毫米的玻璃珠Scharlau038-138003
Middlebrook 7H10 琼脂BD262710
1毫升注射器，26号针头，0.45 × 10毫米BD301358
GentleMACS 组织解离仪Miltenyi Biotec130-093-235
C型管Miltenyi Biotec130-093-237
M型管Miltenyi Biotec130-093-236
胶原酶D罗氏11088882001
DNaseIApplichemA3778,0100
Falcon 70 µm细胞筛康宁352350
RPMI 1640SigmaR0883
红细胞裂解缓冲液SigmaR7757
GlutaMAX 补充剂Gibco35050-061100倍浓缩
青霉素-链霉素溶液SigmaP4333100倍浓缩
胎牛血清生物工业公司04-001-1A
2-巯基乙醇SigmaM3148-25ML
Scepter 2.0 手持式自动细胞计数器默克密理博PHCC20040
Scepter 细胞计数器传感器，40 µmMilliporePHCC40050
结核分枝杆菌 - 结核菌素纯蛋白衍生物Statens Serum Institut (SSI)2390
小鼠 IFN-γ ELISA 开发试剂盒 Mabtech3321-1H
小鼠 IL17A ELISA 检测试剂盒 Mabtech3521-1H
布雷菲德菌素ASigmaB7651
FITC 标记大鼠抗小鼠 CD4BD553047
BD Cytofix/Cytoperm 试剂盒BD555028
APC-Cy7 标记的大鼠抗小鼠 IL-17ABD560821
APC 小鼠抗小鼠 IFNγBD554413
泪道橄榄形鲁尔锁接头 0.60 x 30 mm，23G x 1 1/4”UNIMED27.134用作支气管肺泡灌洗的气管插管
高蛋白结合聚苯乙烯平底96孔板 MAXISORPNUNC430341
牛血清白蛋白SigmaA4503
山羊抗小鼠 IgA（α-链特异性的−过氧化物酶抗体SigmaA4789
3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB） SigmaT0440
MyTaq DNA聚合酶BiolineBIO-21107试剂盒包含5倍浓度缓冲液

参考文献

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IL 17 IgA H37Rv
小鼠皮下与鼻内接种卡介苗后的保护效力及肺部免疫应答
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