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方法文章

标准化结肠升支支架腹膜炎大鼠模型——一种诱导脓毒症急性肾损伤的简单可行的动物模型

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DOI：

10.3791/54448

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2022年2月15日

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1Department of General, Visceral, Transplantation, Vascular and Paediatric Surgery, Department of Surgery I, University of Würzburg, 2Department of Anesthesiology and Critical Care, Medical Center-University of Freiburg, 3Faculty of Medicine, University of Freiburg, 4Department of Internal Medicine I, Division of Nephrology, University of Würzburg, 5Department of Physiology and Pharmacology, West Virginia University School of Medicine, Robert C. Byrd Health Science Center, 6Department of Anesthesiology and Intensive Care Medicine, Robert-Bosch-Krankenhaus

本文内容

摘要

急性肾损伤（AKI）是危重患者中一种严重的并发症，与死亡率升高相关。本文介绍了一种可靠且可重复的方法 体内 用于模拟炎症条件下急性肾损伤的模型，可能有助于理解脓毒症相关急性肾损伤的发病机制。

摘要

脓毒症患者的急性肾损伤（AKI）与病死率升高及不良预后相关，尽管在深入理解其病理生理机制方面已做出大量努力。本文介绍一种 体内 介绍了一种结合标准化腹腔感染灶以诱导急性肾损伤（AKI）和重症监护（ICU）设置以提供高级血流动力学监测与治疗的模型，该模型可模拟人类脓毒症的临床情况。脓毒症通过标准化升结肠支架腹膜炎（sCASP）方法诱导。AKI的功能性评估通过血液和尿液样本检测进行，同时通过组织病理学评分进行组织学分析。此外，高级血流动力学监测及重复动脉血气采样的可行性，使得对所诱导脓毒症严重程度的差异化分析成为可能。

sCASP 方法是一种标准化、可靠且可重复的诱导脓毒症急性肾损伤（AKI）的方法。该方法具有重症监护设置、持续的血流动力学和气体交换监测、低死亡率，以及能够对肾功能和损伤进行详细分析等优势。因此，所述方法可作为脓毒症急性肾损伤实验研究的新标准。

引言

脓毒症仍然是非心脏重症监护病房（ICU）死亡的首要原因，其死亡率高达 ≈ 30 - 50%1,2,3严重脓毒症和脓毒性休克的一个特征是急性肾损伤，当其伴随心脏衰竭和呼吸衰竭等远端器官功能障碍时，会导致死亡率进一步升高4,5,6重症监护病房患者急性肾损伤的总体发生率在20%至50%之间7尽管急性肾损伤（AKI）在脓毒症的预后和死亡率中具有关键作用，但其潜在的发病机制仍远未完全阐明。

总体而言，急性肾损伤（AKI）的发生涉及三个主要因素：炎症、毒性损伤以及血流动力学改变7。血流动力学改变包括肾血流量（RBF）减少以及整体或局部肾脏缺血。需要注意的是，脓毒症也可能因全身性低血压和/或内皮屏障破坏而导致肾脏微循环障碍8。因此，对脓毒性AKI的研究应始终包含血流动力学监测。近期关于AKI的体内研究多采用动物模型，如肾脏缺血-再灌注损伤或双侧肾切除模型。这些研究通常缺乏血流动力学监测和重症监护措施。

研究脓毒症急性肾损伤（AKI）潜在的新型发病机制和治疗方法需要一种具有明确感染灶、配备重症监护条件、结果可预测且能产生器官损伤的体内模型9,10,11,12。本文描述了一种创新的啮齿类动物脓毒症AKI模型，满足上述要求。通过标准化升结肠支架腹膜炎（sCASP）诱导脓毒症AKI。该sCASP模型通过肠道粪便泄漏引发腹腔感染，导致细菌侵入和多器官功能衰竭13。已有研究表明，CASP术后发生的病理生理变化与人类脓毒症相似，因此CASP是脓毒症研究中具有临床相关性的模型11,14。

此外，本实验方案建立了一个包含高级血流动力学监测和重症监护治疗的重症监护室（ICU）设置。该ICU设置可实现液体复苏、静脉给予镇痛药物以及重复进行血气分析。通过检测肌酐等标准指标，以及菊粉和对氨基马尿酸（PAH）清除率来评估肾功能。实验结束时，通过对采集的组织和器官进行病理组织学评分，可获得额外信息。已对诱导脓毒症急性肾损伤（AKI）的sCASP模型进行了评估，并已在肾脏病理机制方面提供新的认识15。下文所述本方案的进一步应用，可能有助于深化对脓毒症所致AKI的理解。

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方案

所有动物实验程序均经德国下弗兰肯行政区实验动物护理与使用委员会批准，并依照《赫尔辛基宣言》进行。

1. 外科准备及侵入性监测和持续用药的安装

  1. 使用经当地机构动物研究监管机构和/或兽医团队批准的浓度和流速，通过精密挥发器以异氟烷麻醉Sprague-Dawley大鼠。通过观察呼吸频率（呼吸变慢且加深）确认麻醉深度，并在尾部或足趾夹捏后验证无反应性。用剃须刀剃除 throat 和腹部的毛发。
    注意： 呼吸频率显著降低可能是麻醉过量的征兆，并最终导致呼吸过缓、低血压甚至死亡。
  2. 将大鼠仰卧位放置于加热垫上。在眼睛上涂抹兽用眼膏，以防止眼睛干燥。 根据术中对大鼠的监测结果和/或当地机构动物研究监管机构和/或兽医团队的建议，通过调节异氟烷浓度和气流速率来维持适当的麻醉深度。将大鼠置于自动控温加热垫上，呈仰卧位。
    注意：低温与热损伤影响巨噬细胞 以及微血流动力学参数，应避免此类情况以获得可靠结果。建议使用带有控制机制的加热垫，并通过柔性直肠探头连接大鼠，以维持其体温在生理范围内。
  3. 在使用适当的消毒剂对颈部和咽喉进行消毒后 溶液，用手术刀在喉部正中切开皮肤，做一个约2 cm的切口。将大鼠翻转，用手术剪在枕骨下方约1 cm处的颈部做一约1 cm的切口。
  4. 将大鼠放回仰卧位。用剪刀和棉签轻轻分离右侧颈静脉和左侧颈总动脉，仔细解剖血管周围组织，避免过度牵拉，并通过轻柔的撑开动作进一步分离。
    注意： 始终通过添加预热的无菌生理盐水保持容器湿润。
  5. 轻轻分离皮下组织，从血管向颈部做扩撒动作，使两个切口相通。将止血钳插入所形成的每个隧道中。
  6. 用0.9% NaCl冲洗旋转连接器及来自旋转装置的导管。将导管插入不锈钢弹簧中。
    注意： 导管必须 在插入前应使用氯化钠冲洗，因为即使少量空气进入也可能导致空气栓塞，从而引起突然死亡。
  7. 将大鼠翻身并使用内置夹子夹住导管。将导管从颈部滑移至咽喉部。在枕骨远端约1 cm处，用一个塑料固定钮通过6个单个缝线（例如4/0）将弹簧固定于颈部。
  8. 将大鼠再次置于仰卧位。在每条已准备好的血管远端和近端约4 cm处放置棉线。使用通常用于夹闭蛛网膜下腔动脉瘤的微型夹夹闭近端动脉。或者，也可保留血管夹，并通过收紧其中一根棉线来阻断动脉血流。
  9. 用手术显微剪刀切开动脉，一手用钩子保持切口开放，另一手用镊子将动脉导管插入血管。松开夹子或抽出的线 thread，将导管向心脏方向推进约1 cm，并利用预先放置的棉线打外科结固定导管。
  10. 在颈静脉上重复步骤1.8，并保留止血夹，因为静脉不如动脉坚实。
  11. 将两根导管在血管内固定成直线后，用缝线闭合颈部的切口。

2. sCASP 实验步骤

  1. 将大鼠保持仰卧位，剃除腹部毛发，并使用适当的消毒液对腹部区域进行消毒。
    注意：始终采用无菌技术。
  2. 使用手术剪在皮肤上沿腹中线做长约 2 cm 的切口，随后沿白线继续切开，以打开腹膜腔。
  3. 辨认盲肠末端，用棉签轻轻将盲肠拉出。
  4. 在回盲瓣远端约 2 cm 处的升结肠对系膜侧，用缝线（6/0）[缝线 1]穿刺，并打两个外科结固定。避免损伤结肠任何血管。
  5. 剪去 10 FR 吸引导管的远端约 1.5 cm。再用剪刀将该段导管 剪成一个长约 0.5 cm 的矩形瓣膜。在瓣膜中央用缝线（6/0）[缝线 2]预先缝合准备。
  6. 将瓣膜套在 14G 针头上，用该针头在已固定缝线 1 的位置穿刺升结肠15。
  7. 通过针头将制备好的塑料导管插入结肠内，同时轻柔地撤出针头。调整导管位置，使瓣膜位于结肠外，导管其余部分位于结肠内。
    1. 在精确放置塑料导管后，利用已有的缝线 2 将瓣膜与结肠壁缝合固定，并打外科结。再次注意避免损伤结肠血管。将缝线 1 的游离端绕过通向结肠外的导管部分，并打两个外科结固定。
  8. 使用棉签将盲肠内的粪便向结肠支架方向推挤，直至粪便从支架出口处出现。
  9. 将小肠和结肠复位至腹膜腔内，使带有粪便的塑料导管与腹膜接触。用 2 mL 0.9% NaCl 冲洗支架，使粪便分布至腹膜腔内。
  10. 先用连续缝合（4/0）缝合腹膜，再用连续缝合（4/0）缝合皮肤，关闭腹膜腔。

3. 术后操作

  1. 停止吸入异氟烷，将大鼠放回笼中。
  2. 通过静脉通路开始静脉镇痛，使用芬太尼（2.0 µg/100 g 体重/小时）。

4. 第二天测量的准备工作

  1. 在sCASP手术后24 h ，静脉注射0.5–1.0 mg咪达唑仑。根据大鼠术中监测情况和/或当地机构动物研究监管机构和/或兽医团队的建议，通过调节异氟烷浓度和气流速率维持适当的麻醉深度。
  2. 用酒精和 溶液再次消毒后，使用14 G静脉留置针的塑料导管进行气管切开术，以保证充分的氧合与通气。
    1. 因此，用手术剪刀切开颈部缝合处，并沿中线轻柔分离至气管。在两段气管软骨之间纵向切开约2 mm长度（仅足以插入手术剪刀），用手术剪钝性扩大切口至气管直径的一半左右。插入1 cm长的14 G塑料导管，并用两根缝线固定。16
      注意：若气管切口超过其周长的一半，可能损伤沿气管走行的血管，导致严重出血、血液误吸或致死性心动过缓。
    2. 使用啮齿类动物呼吸机开始机械通气，吸入氧浓度（FiO2 ）设为0.28，异氟烷浓度为0.7 Vol. %，同时开始静脉麻醉，给予咪达唑仑（0.7 mg/100 g体重/h）和芬太尼（7 µg/100 g体重/h）。进行血气分析以确保充分的通气和氧合。为此，经动脉导管抽取约0.7 mL血液，使用血气分析仪进行检测。
      注意：仅在建立机械通气后方可开始静脉麻醉。
  3. 参照步骤2.1的方法对右后肢进行剃毛和消毒，在膝关节 proximal 0.5 cm处做一条长约1 cm的纵向皮肤切口。使用手术剪刀和棉签钝性分离股动脉与其周围组织。
    注意：若股动脉发生撕裂，仍可在近端位置插入导管。因此，建议尽可能从远端开始植入操作。
  4. 用钩针切开股动脉，再用镊子将热稀释导管插入股动脉。
  5. 开始采用热稀释法测量心输出量。具体操作为：启动心指数测量软件后，经静脉导管快速手动推注1 mL冷藏氯化钠溶液。重复该测量过程两次。

5. 肾功能评估

  1. 使用剪刀切开皮肤和腹膜缝线，进行剖腹手术。用手术剪在膀胱上做一小切口，以便插入小型塑料导管。将一段约7 cm的棉线绕膀胱一周，扎紧棉线，并用结固定导管，最后通过导管尽可能收集尿液。
  2. 将异硫氰酸荧光素标记的菊粉（FITC-Inulin）溶于0.9% NaCl溶液中，对氨基马尿酸钠盐（PAH）也溶于0.9% NaCl溶液中，配制成浓度分别为2 mg/mL的菊粉和5 mg/mL的PAH溶液。
  3. 静脉注射75 µL上述两种物质的混合液作为负荷剂量，随后以3.7 µL/h/300 g体重的速率持续静脉输注这两种物质。
  4. 在FITC-Inulin和PAH输注达到稳态17后，收集20分钟尿液。通过动脉导管采集血样，具体操作参见4.2.1节中关于血气分析的描述。
  5. 采用荧光分光光度法测定尿液和血浆中的菊粉浓度，使用蒽酮法通过光谱光度法测定PAH浓度17。

6. 实验的结束

  1. 根据当地法律法规实施动物安乐死。
  2. 通过动脉导管使用注射器尽可能抽取全部血液。
  3. 切断十二指肠和结肠的腹膜固定处，取出小肠和大肠，使用手术剪剪取部分组织。分离腹膜后组织，暴露肾脏并去除其脂肪囊，切断输尿管及相连血管，制备并采集肾脏。进行胸廓切开术，取出肺和心脏。将所有器官固定于甲醛中，并按照已发表的方法进行组织学染色15,18

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结果

正如 Schick 等人先前发表的研究8所示，我们展示了以下结果。

无死亡率的脓毒症诱导
在CASPP模型中，脓毒症由升结肠腔内细菌持续泄漏至腹腔引起，导致粪性腹膜炎和菌血症。植入导管的尺寸可调节粪便排出量，从而控制腹膜炎和脓毒症的严重程度。在上述实验方案中，采用14G针头结合特制10 FR吸引导管的尖端，以产生足够的腹膜炎反应。较小的导管仅导致局部炎症和脓肿形成，因为精囊通常会堵塞较小的支架，阻止持续的粪便排出。

对照组和sCASP组动物均存活至实验结束，但sCASP组需要进行液体复苏以维持平均动脉压（MAP）≥ 70 mmHg。sCASP处理的动物出现弥漫性粪性腹膜炎，无脓肿形成，并表现出严重脓毒症的临床体征，包括活动减少、警觉性下降、毛发...

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讨论

脓毒症急性肾损伤（AKI）的病理生理机制仍极为复杂，尚未完全阐明。针对患者的临床研究和试验无法在组织病理学改变、微循环障碍或药物在细胞水平的相互作用方面获得新的认识15。此前已有研究提出，亟需建立更优且新型的动物模型，以研究与脓毒症相关的急性肾损伤19。因此，我们建立了一种由升结肠支架植入性腹膜炎（colon ascendens stent peritonitis）诱导的脓毒症AKI新型动物模型。

CASP 模型是一种具有临床相关性的模型，可模拟外科患者中由粪性腹膜炎引发的人类脓毒症。CASP 的主要优势在于，它不像广泛使用的 CLP 模型那样以缺血性损伤为起始点，后者需对盲肠进行结扎14。此外，Maier 等人的研究显示，CLP 模型更倾向于表现为腹腔内脓肿的情况，而非伴有全身性菌血症的弥漫性腹膜炎14。通过在升结肠中植入不同尺寸的支架，可调控脓毒症的严重程度和动物存活率，这一点已在先前的多...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

M.A. Schick 和 N. Schlegel 获得了德国研究基金会（DFG）项目编号 SCHL 1962/2-1 和 SCHL 1962/4-1 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Sprague-Dawley 大鼠法国 Janvier Labs
 异氟烷 CPcp-pharma，德国布尔戈多夫
聚乙烯导管 PE 10；30米A. Hartenstein，德国维尔茨堡0.58×0.96 mm
Swivel (375/D/20)美国宾夕法尼亚州普利茅斯会合市Instech公司(375/D/20)
塑料纽扣固定装置美国宾夕法尼亚州普利茅斯会合市Instech公司LW105S
PerfusorB. Braun；德国美尔松根Perfusor fm
吸痰管 ch. 10德国 B.Braun Melsungen AG吸痰管类型 „理想“第10章
缝合线Syneture；美国Surgipro；单丝聚丙烯 4-0
缝合线Ethicon；苏格兰Prolene；聚丙烯 5-0
14G-静脉导管BD Insynte；BD Vialon；马德里；西班牙14GA 静脉导管
棉签NOBA Verbandmittel Danz GmbH u Co KG；韦特尔；德国
啮齿类动物呼吸机德国 Hugo Sachs Elektronik KG啮齿类动物呼吸机，型号：7025
咪达唑仑德国Ratiopharm咪达唑仑
热稀释导管ADInstruments，德国斯佩希巴赫
对氨基马尿酸Sigma-Aldrich；圣路易斯；美国对氨基马尿酸钠盐；A3759-25G
菊粉Sigma-Aldrich；St. Louis；美国菊粉-FITC；F3272-1G
甲醛Otto Fischar GmbH & CoKG；萨尔布吕肯ü肯恩，德国甲醛 3.5%
环戊烷默克公司；达姆施塔特；德国Uvasol：2-甲基丁烷
酒精类消毒剂Schülke & Mayr GmbH，诺德施泰特；德国kodan Tinktur forte；每100克含45克2-丙醇、10克1-丙醇
聚维酮碘溶液德国 B.Braun Melsungen AGBraunol，每100克含7.5克聚维酮碘

参考文献

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