本文介绍了一种采用注塑成型的方法来构建具有内皮生理特性的微血管。该基于微流控的技术可生成通畅的三维血管网络，并可调节流动、细胞组成、几何结构和生化梯度等参数。文中描述了该制备工艺及若干潜在应用示例。
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本文内容
摘要
摘要
体外研究内皮细胞和血管生物学的平台在很大程度上局限于二维内皮细胞培养、使用聚合物或玻璃基底的流动腔室，以及基于水凝胶的管状结构形成实验。尽管这些实验具有一定的信息价值，但无法重现管腔几何结构、合适的细胞外基质以及多细胞邻近关系，而这些因素在调控血管功能中起着关键作用。本文描述了一种注塑成型方法，用于构建直径约为 100 µm 的工程化血管。微血管通过在嵌入天然 I 型胶原水凝胶中的微流控通道内接种内皮细胞而制成。在通道形成前将实质细胞引入胶原基质中，可构建并研究特定组织的微环境。进一步调节流体动力学特性和培养基成分，可在目标微环境中精确控制复杂的血管功能。该平台可用于研究周血管细胞募集、血液-内皮相互作用、流动响应以及组织-微血管相互作用。工程化微血管能够分离血管微环境中各个组分的独立影响，并精确调控其化学、机械和生物学特性，从而在健康与疾病状态下研究血管生物学。
引言
各器官中的微血管系统有助于界定组织微环境，维持组织稳态，并调控炎症反应、通透性、血栓形成及纤维蛋白溶解 1,2微血管内皮是血流与周围组织之间的界面，因此在响应流体动力学力以及循环中的细胞因子和激素等刺激时，在调节血管和器官功能方面发挥着关键作用 3-5深入理解内皮细胞、血液与周围组织微环境之间的详细相互作用，对于血管生物学及疾病进展的研究至关重要。然而，对这些相互作用的研究进展一直受到局限 体外 不能重现的工具 体内 微血管结构与功能 6,7因此，该领域及治疗进展在很大程度上依赖于昂贵且耗时的动物模型，而这些模型往往无法成功转化为人类临床应用。 8-10。尽管 体内 在研究疾病机制和血管功能方面，模型具有不可估量的价值，但它们通常较为复杂，且往往难以精确控制单个细胞、生化和生物物理信号。
全身的血管系统具有成熟的分级结构，并伴有广泛的毛细血管床，可同时实现优化的灌注和营养物质运输 11最初，血管系统形成一个原始的血管丛，在早期发育过程中重组为具有层次性分支结构的网络 12,13尽管参与这些过程的许多信号通路已被充分阐明 14-16这种血管模式....
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方案
1. 具有网络设计的图案化聚二甲基硅氧烷（PDMS）微加工
- 晶圆制造以创建网络设计的负模板
- 使用任意计算机辅助设计（CAD）软件创建网状图案。确保入口与出口之间的对角线尺寸与后续步骤中壳体装置上进液口和出液口储液池之间的距离相匹配（见2.1.1）。
注意：图案的设计本身可根据用户的特定研究目标进行定制（参见 图1 例如模式）。 - 使用高分辨率打印技术生成网络图案的掩模，或从商业供应商处订购铬版光掩模。有关光刻工艺的更详细方案可参见其他文献。 35.
- 使用氧气等离子体处理对8英寸硅片进行5分钟的清洗，功率为100 W。
- 在晶圆上倒入足量的负性光刻胶（SU-8 2,100 效果良好），使光刻胶形成直径约为 2.5 cm 的液滴。使用匀胶机，以 500 rpm 的转速、100 rpm/sec 的斜坡加速度旋转晶圆，保持 10 秒；随后以 300 rpm/sec 的加速度 ramp 升至 1,600 rpm，并维持该转速 30 秒。注意：具体转速与加速度需根据各实验室条件优化，以获得所需的光刻胶厚度 150 µm.
- 软烤晶圆 65 °C 7 分钟内逐渐升至 95 °C 与 360 °C/小时，并维持45分钟。在加热板上缓慢冷却至室温。使用铬版光掩模，以365 nm紫外光照射，曝光量为制造商推荐值的三倍（35....
- 使用任意计算机辅助设计（CAD）软件创建网状图案。确保入口与出口之间的对角线尺寸与后续步骤中壳体装置上进液口和出液口储液池之间的距离相匹配（见2.1.1）。
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结果
工程化血管平台可在天然Ⅰ型胶原基质内构建功能性微血管网络，并实现对细胞、生物物理及生物化学环境的精确调控 体外为了构建工程化微血管，将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）灌注通过胶原包埋的微流控网络，使其附着并形成通畅的管腔及融合的内皮层。如图所示 图1A-C，血管几何结构可被特异性设计以回答关于流速、迂曲度和分支角度等问题。通过调节微血管中的流速，可深入了解内皮细胞对剪切应力的响应。此前，制备工作主要集中在血管的 100 µm 尺寸范围，然而微血管可达 500 µm 或者在某些情况下，小至 50 µm 直径的微血管已成功制备并进行培养。文中展示了长期通畅性的实例，以及在重力驱动流动条件下培养的微血管的存活情况。图 2A）和持续施加的流速（图 2B）。该 体内工程化微血管的类生理特性可通过多种方式加以验证。利用该平台可检测多种内皮细胞功能，包括屏障功能（图3A）、细胞间相互作用与信号转导（图.......
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讨论
工程化微血管是一种 体外 一种可调节管腔几何结构、流体动力学力和多细胞相互作用等生理特征的模型。此类平台具有强大优势，能够在多种情境下对内皮细胞行为进行建模与研究 体外 培养条件可与特定微环境的条件相匹配。例如，已知驱动内皮细胞过程（如血管生成）的机制在不同器官以及不同病理状态下（如健康与疾病）存在差异 44因此，平面内皮细胞培养始终存在不足 6 因此，该领域在很大程度上依赖于成本高昂且耗时的动物模型。
动物模型虽然对生物医学研究的进展具有重要价值，但其研究成果往往难以有效转化至临床应用。这主要归因于小鼠与人类生物学之间的差异，尤其是在对刺激物的反应方面。 9,45因此，必须能够构建 体外 可提供额外的人类特异性数据的模型，以补充来自动物模型的信息。 体外 具有调控环境能力的平台有望模拟特定的微环境。此类系统的关键特征应包括三维结构与几何形态、细胞外基质成分（ECM）、实质细胞的邻近性与相互作用、血流以及生化刺激。工程化微血管能够整合上述所有参数.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此致谢华盛顿大学干细胞与再生医学研究所的林恩和迈克·加维影像实验室，以及华盛顿大学的华盛顿纳米加工设施。同时感谢美国国立卫生研究院基金项目 DP2DK102258（资助 YZ）、培训基金项目 T32EB001650（资助 SSK 和 MAR）和 T32HL007312（资助 MAR）提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 晶圆制备 | |||
| AutoGlow 等离子体系统 | AutoGlow | ||
| Headway 旋涂机 | Headway Research, Inc | PWM32 旋涂机 | |
| ABM 接触式光刻对准仪 | AB-M | ||
| Alpha Step 膜厚轮廓仪 | Tencor | Alpha Step 200 | |
| SU-8 显影液 | Microchem | Y020100 | |
| SU-8 光刻胶 | Microchem | SU-8 2000 | |
| 8" 硅晶圆 | Wafer World Inc. | ||
| 台式微纳图形发生器 | Heidelberg Instruments | μPG 101 | 用于光掩模的制作 |
| 加热板 | VWR | 97042-646 | |
| 异丙醇 | Avantor Performance Materials | 9088 | |
| 培养皿（120 × 120 mm，方形） | Sigma-Aldrich | Z617679 | |
| 三氯(3,3,3-三氟丙基)硅烷 | Sigma-Aldrich | MKBG3805V | |
| 聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体基料与固化剂 | Dow Corning | Sylgard 184 | 按 10:1（质量比）混合 |
| 真空干燥器 | Sigma-Aldrich | Z119024-1EA | |
| 烘箱 | VWR | 9120976 | |
| 器件制备与细胞培养 | |||
| 聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA） | Plexiglas | ||
| 电晕处理仪 | Electro-Technic Products, Inc. | BD-20 | 用于 PMMA 器件和 PDMS 模具的等离子体处理的手持设备 |
| 电烙铁 | Weller | WTCPS | |
| 不锈钢带槽盘头机械螺钉 | McMaster-Carr | 91785A096 | |
| 不锈钢定位销 | McMaster-Carr | 93600A060 | |
| 镊子 | Miltex | 24-572 | 可使用任何类似的镊子 |
| 刮刀（微型勺） | Electron Microscopy Services | 62410-01 | |
| 螺丝刀 | 可使用任何平头螺丝刀，需经高压灭菌 | ||
| 玻璃盖玻片（22 × 22 mm） | Fisher Scientific | 12-542B | |
| 漂白剂 | Clorox | 4460030966 | |
| 培养皿（150 × 25 mm） | Corning | 430599 | |
| 培养皿（100 × 20 mm） | Corning | 2909 | |
| 棉条，切成 1 cm × 3 cm 的小片 | 需经高压灭菌 | ||
| 聚乙烯亚胺（PEI） | Sigma-Aldrich | P3143 | 用细胞培养级水稀释至 1% |
| 戊二醛 | Sigma-Aldrich | G6257 | 用细胞培养级水稀释至 0.1% |
| 无菌 H2O | 经高压灭菌的去离子 H2O | ||
| 溶于 0.1% 乙酸中的 I 型胶原蛋白 | 从大鼠尾部提取，方法见 Rajan et. al. 2006（参考文献 #37） | ||
| 1 ml 注射器 | BD | 309659 | |
| 10 ml 注射器 | BD | 309604 | |
| 15 ml 锥形管 | Corning | 352097 | |
| 30 ml 锥形管 | Corning | 352098 | |
| M199 10 倍培养基 | Life Technologies | 11825-015 | |
| 1 N NaOH（无菌） | Sigma-Aldrich | 415413 | 用细胞培养级水稀释至 1 N |
| HUVECs | Lonza | ||
| 内皮细胞生长培养基 | Lonza | CC-3124 | |
| 胰蛋白酶 | Corning | 25-052-CI | |
| 胎牛血清（FBS） | Thermofisher Scientific | 10082147 | |
| 来自 Leuconostoc spp. 的葡聚糖（70 kDa） | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Corning | 21-031-CV | |
| 血细胞计数板 | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| 凝胶加样枪头 | VWR | 37001-152 | |
| 18 G 钝头填充针 | BD | 305180 | |
| 20 G 不锈钢分配针 | McMaster-Carr | 75165A123 | |
| Tygon 1/32” 内径，3/32" 外径硅胶管 | Cole-Parmer | EW-95702-00 | |
| 1/16" 管对管连接头 | McMaster-Carr | 5116K165 | |
| 90° 管对管弯头接头 | McMaster-Carr | 5121K901 | |
| 鲁尔锁紧接头（雌性，1/16" 内径） | McMaster-Carr | 51525K211 | |
| 带齿状夹持面的塑料镊子 | Electron Microscopy Services | 72971 | |
| 双通道注射泵 | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| 5 ml 聚苯乙烯圆底管 | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| 器件分析 | |||
| 甲醛 | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A8806-5G | |
| 曲拉通 X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| 兔抗人 CD31 抗体 | Abcam | ab32457 | 工作稀释比为 1:25 |
| FITC 标记的抗血管性血友病因子抗体 | Abcam | ab8822 | 工作稀释比为 1:100 |
| 山羊抗兔 568 二抗 | Thermofisher Scientific | A-11011 | 工作稀释比为 1:100 |
| Hoescht | Thermofisher Scientific | H1399 | 溶于 DMSO |
| 二甲胂酸钠 | Sigma-Aldrich | C0250 | 用于配制 0.2 M 二甲胂酸缓冲液 |
| 乙醇 | VWR International | BDH1164-4LP | |
| 40 kDa FITC 标记葡聚糖 | Sigma-Aldrich | FD40S | |
| 其他培养试剂 | |||
| CHIR-99021 | Selleck Chem | S2924 | GSK-3 小分子抑制剂 |
| 人重组 VEGF | Peprotech | 100-20 | |
| 人重组 bFGF | Peprotech | AF-100-18B |
参考文献
- Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, Suppl 4 37-44 (1993).
- van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol.
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