光介导的水凝胶形成与图案化及其在细胞培养中的应用

摘要

我们描述了一种用于三维细胞培养的合成水凝胶基质的光介导形成及其后续生物化学图案化的连续过程。文中展示了利用细胞相容性光点击化学构建和修饰水凝胶的方法。此外，还介绍了对这些水凝胶中的图案进行定量与观察、以及测定细胞活力的简便技术。

摘要

点击化学已被广泛研究用于多种生物材料领域，包括药物递送、组织工程和细胞培养。特别是光介导的点击反应，如光引发的巯基-烯（thiol−ene）和巯基-炔（thiol−yne）反应，能够实现对材料特性的时空控制，从而设计出具有高度用户可控性能的系统。利用光的精确性以及这些巯基-X光点击化学所提供的多功能性，来制备和修饰基于水凝胶的生物材料正受到越来越多的关注，尤其适用于在结构明确且仿生的微环境中进行细胞培养。本文描述了使用多功能且模块化的构建单元，通过巯基-烯光点击反应聚合，实现细胞的光包埋以及在水凝胶基质内对生化信号进行光图案化的技术方法。具体而言，介绍了一种构建水凝胶的方法：该水凝胶由烯丙氧羰基（allyloxycarbonyl, Alloc）功能化的肽交联剂和侧链肽基团，以及巯基功能化的聚乙二醇（PEG）组成，在酰基膦酸锂光引发剂和细胞相容剂量的长波长紫外光（UV）照射下可快速聚合。文中还描述了便于可视化光图案化过程以及定量所添加肽浓度的简便技术。此外，建立了包埋细胞（特别是人源间充质干细胞）并评估其存活率和活性的方法。尽管本文展示的是巯基-Alloc水凝胶的形成与初步图案化，但这些技术也可广泛应用于其他多种光引发或自由基引发的材料体系（e.g.，巯基-降冰片烯、巯基-丙烯酸酯），以制备具有特定图案的基底材料。

引言

点击化学在多种生物医学应用的材料设计中正得到日益广泛的应用，包括药物递送、组织工程和可控细胞培养，这得益于其具有选择性、高效性以及通常具备的细胞相容性反应特性。^1-3 光点击化学利用光来触发或启动反应（例如，叠氮-炔烃⁴、巯基-烯烃⁵和四唑-烯烃⁶），在生物材料的构建或修饰方面尤其受到关注。这些反应在温和条件下具有快速反应速率，并可通过光照精确控制其发生的时间和空间位置，因此非常适合在细胞存在的情况下实现对生物材料性能的用户导向性调控。^7,8 特别是，巯基-烯烃光点击化学已被用于制备具有优异机械性能的水凝胶基生物材料^5,9，并可用于包封多种类型的细胞，包括但不限于人源间充质干细胞（hMSCs）、成纤维细胞、软骨细胞和胰腺细胞，在细胞培养与递送方面展现出良好前景。^10,11 此外，这些化学方法还被用于生化信号分子的空间图案化，以模拟天然细胞微环境的关键特征，并促进适当的细胞-基质相互作用，包括细胞黏附、分化和侵袭等过程。^3,12

在光引发构建硫醇-烯烃水凝胶的过程中，通常使含半胱氨酸（硫醇）的多肽与丙烯酸酯或降冰片烯（“烯”）官能化的聚合物发生反应，在细胞相容性条件下实现快速的光引发聚合。¹³ 扩展这一工具箱，我们致力于建立基于新型多功能且易得构建单元的水凝胶形成方法，这些构建单元只需极少的合成加工或可直接商业获取，以促进其作为合成细胞外基质的广泛应用。¹⁴ 具体而言，肽被修饰为带有烯丙氧羰基（Alloc）保护的赖氨酸：一种用于悬挂整合素结合基团以促进细胞黏附 [K(alloc)GWGRGDS = Pep1Alloc]，另一种带有两个赖氨酸用于形成不可降解或细胞可降解的交联 [K(alloc)RGKGRKGK(alloc)G 或 KK(alloc)GGPQGIWGQGK(alloc)K = Pep2Alloc]。利用这些序列，建立了在长波长紫外光（10 mW/cm²）的细胞相容剂量下，与四臂巯基修饰的聚乙二醇（PEG4SH）在1–5分钟内快速反应的条件。² 在365 nm波长光照下）以及光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次磷酸锂（LAP）。所得水凝胶在细胞培养条件下可稳定维持数周。为实现细胞驱动的降解与重塑，将一种可被酶切割的肽段整合至凝胶的交联结构中（即，GPQGIWGQ），¹⁵ 以及一种模式原代细胞——人骨髓间充质干细胞（hMSCs）——在包封后及在这些基质中培养期间均保持高度活性。此外，已实现在这些材料内部对肽进行空间图案化，且hMSCs在光图案化条件下仍保持活性并具有代谢活性。其他侧接肽序列（此处未展示）例如IKVAV、YIGSR、GFOGER 等等。），也可被整合到基质中，以探究细胞与周围微环境之间的其他相互作用。这些结果表明，基于水凝胶的材料在三维（3D）细胞培养和递送方面具有广阔应用前景，可用于研究并调控多种细胞类型的细胞-基质相互作用。

本文介绍了在所提出的水凝胶体系中光封装细胞并随后对生化信号进行光图案化的技术（图1）。同时展示了观察和量化这些光图案的方法：特别是，i) 采用Ellman试剂法对图案化基底中游离巯基的修饰进行定性和定量分析，以及 ii) 利用荧光肽（AF488Pep1Alloc）进行互补的定性分析，以实现三维观察这些图案。此外，还提供了用于评估细胞活力（活/死细胞染色）和代谢活性（MTS法；3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四氮唑）的检测方法，以便使用者评估不同细胞系在水凝胶基质中进行光封装和光图案化处理时的细胞相容性。尽管本实验方案以一种简便的基于光的光点击水凝胶体系为例进行演示，但这些技术也可广泛应用于其他多种自由基引发的水凝胶体系，在细胞存在条件下实现光封装与光图案化。

方案

1. 水凝胶形成所需材料的准备

1. 通过标准固相肽合成（SPPS）技术合成侧链修饰肽（Pep1Alloc、AF488Pep1Alloc）和交联肽（Pep2Alloc），并通过三步法对聚合物进行端基修饰以制备巯基功能化聚合物（PEG4SH）^14,16。或者，可直接商业购买 PEG4SH（M_n ~ 20 kDa）、Pep1Alloc 和 Pep2Alloc。
2. 通过以下两步反应合成光引发剂（LAP）^14,17。在通风橱中进行合成步骤（1.2.1–1.2.11），操作化学品时需谨慎（佩戴防护手套、防护服和护目镜）。LAP 也可商业购买。
   1. 将所有玻璃器皿在烘箱中干燥（>2 小时，80 °C）。
   2. 向一个空的单颈圆底烧瓶（100 ml）中加入搅拌子，并用隔膜密封。
   3. 使用铁架台和夹具将烧瓶固定在磁力搅拌加热板上方。
   4. 将一根针头（18 G）插入隔膜，外端保持向大气开放；将第二根连接惰性气体管线的针头插入隔膜。打开惰性气体（例如，氩气或氮气）并吹扫烧瓶 10–15 分钟。
      注：在整个反应过程中，系统将持续通入惰性气体（氩气或氮气）进行吹扫。
   5. 使用带针头的注射器穿刺隔膜，将 1.5 g（~1.4 ml）二甲基苯基亚磷酸酯（注意：有危险性）转移至烧瓶中。开启搅拌器（中等速度），注意避免内容物溅到烧瓶壁上。
   6. 使用带针头的注射器穿刺隔膜，将 1.6 g（~1.46 ml）2,4,6-三甲基苯甲酰氯（注意：有危险性）逐滴加入含有二甲基苯基亚磷酸酯的烧瓶中。
   7. 用铝箔包裹反应容器以避光，并在氩气或氮气氛围下搅拌 18 小时。
   8. 次日，升高烧瓶位置，在搅拌器上放置油浴锅，小心将烧瓶浸入油浴中。在保持磁力搅拌的同时，将油浴和烧瓶加热至 50 °C。
   9. 将 3.05 g 溴化锂溶解于 50 ml 丁酮中。将烧瓶从油浴中取出，短暂移除隔膜，将溴化锂溶液倒入圆底烧瓶中。
      1. 再次用隔膜密封烧瓶（注意：隔膜上仍需保留连接氩气管线的针头和排气针头），将烧瓶重新浸入加热的油浴中，继续反应 10 分钟。反应过程中将形成固体沉淀。
   10. 10 分钟后，关闭氩气，将烧瓶从热源移开，并在避光条件下静置 4 小时（用铝箔覆盖，因已生成对光敏感的引发剂）。保持排气针头位置不变。
   11. 将产物倒入玻璃砂芯漏斗或铺有适当滤纸的漏斗中。用 50 ml 丁酮洗涤滤饼三次，以去除未反应的溴化锂。
   12. 干燥产物（先在室温下晾干，再置于真空干燥器中），并在 D₂O 中通过 ¹H NMR 分析产物。特征峰出现在 1.8–1.9（6H，单峰）、2.1–2.2（3H，单峰）、6.7–6.8（2H，单峰）、7.3–7.4（2H，多重峰）、7.4–7.5（1H，多重峰）和 7.5–7.7（2H，多重峰）^14,17。
3. 使用电子表格计算每种储备液（PEG4SH、Pep1Alloc、Pep2Alloc、LAP）所需配制的体积和浓度，以制备水凝胶（表 1）。若制备非图案化凝胶，应确保 [SH] = [Alloc]，以便在聚合过程中消耗所有反应性基团。若计划对凝胶进行光图案化，则在凝胶形成时应根据化学计量比加入过量的巯基功能团（例如，0.2–5 mM，[SH] >[Alloc]），以便后续与 Pep1Alloc 发生反应。
   注：水凝胶中 PEG4SH 的质量分数应大于 5 wt%，以确保快速聚合（5 分钟内完成）。然而，若应用需要模量较低的水凝胶（例如，<0.5 kPa），可探索更低的 wt% 范围；对于这些低 wt% 配方，应检查并相应调整聚合情况。同样，Pep1Alloc 的浓度可根据不同应用（例如，0.2–5 mM）进行调整，如文献中关于巯基功能化肽的报道所示^18–21。建议 LAP 浓度约为 0.067 wt%（2.2 mM）或更低，因为更高浓度可能降低细胞活力。
4. 根据 表 1 中的计算结果，在无菌条件下配制用于细胞培养的 Pep1Alloc、Pep2Alloc、PEG4SH 和 LAP 储备液。
   1. 分别称取肽合成所得的 Pep1Alloc 和 Pep2Alloc 总质量，各自溶于含 1% 青霉素/链霉素（PS）和 0.5 µg/ml 制霉菌素（FZ）的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。所配储备液的典型浓度范围为 20–100 mg/ml 肽。混合这些储备液以获得适用于软组织应用的最终模量凝胶（杨氏模量 ~ 0.5–5 kPa）^22,23。分装后于 -20 °C 保存，直至使用。
   2. 称取 PEG4SH 置于无菌微量离心管中，溶于 PBS+PS+FZ。该储备液的典型浓度范围为 250–430 mg/ml（按重量计 20–30% PEG4SH）。
   3. 称取 LAP 置于无菌微量离心管中，溶于 PBS+PS+FZ，终浓度为 7.5 mg/ml。
      注：建议每次包封或凝胶实验均新鲜配制 PEG4SH 和 LAP 溶液，以确保聚合时间的一致性。
5. 准备用于形成水凝胶的无菌注射器尖端模具。
   1. 使用剃刀小心切下 1 ml 注射器的尖端，随后将推杆从注射器筒中取出。
   2. 将注射器筒和推杆浸入 70% 乙醇中 15 分钟，然后置于无菌细胞培养罩内干燥（30 分钟）。若注射器筒内残留乙醇液滴，可用推杆将其推出。
6. 准备用于形成水凝胶的无菌载玻片模具。
   1. 将载玻片（成对使用）、橡胶垫圈（厚度 0.254 mm；使用两小片作为垫片，或采用打孔圆片的矩形垫圈，或方形框架状）浸入 70% 乙醇中 15 分钟，然后置于无菌细胞培养罩内干燥。
   2. 按照制造商说明，对一半数量的已灭菌载玻片涂覆防粘附涂层，以防止凝胶顶部粘附于载玻片表面（例如，若有 4 片载玻片，则其中 2 片涂覆防粘附涂层）。这些载玻片将作为载玻片模具的顶部。
7. 校准用于注射器模具或载玻片模具的光源。
   注：本实验中使用带有外部滤光适配器组件和 365 nm 外部滤光片的汞弧灯。其他可产生适当强度长波长紫外光的光源也可使用，如已有文献报道^24–27。
   1. 在液体填充光导末端安装准直透镜，以确保所有样品上的光照强度相对均匀。根据需要调整光导与样品之间的距离，以获得覆盖目标样品区域的光斑尺寸。
   2. 将切割后的注射器模具放入微量离心管架中（以保持模具垂直）。将辐射计探头置于注射器尖端高度（即样品所处位置），调节快门开度（% 开启），使 365 nm 处的光照强度达到 10 mW/cm²。记录调整后的设置以供后续使用。
   3. 将载玻片模具放置在无菌表面顶部（例如，生物安全柜内的移液枪头盒顶部）。将辐射计探头置于载玻片模具高度，调节快门开度（% 开启），使 365 nm 处的光照强度达到 10 mW/cm²。记录调整后的设置以供后续使用。

2. 水凝胶形成与光图案化

1. 非图案化水凝胶的制备。
   注意：在此实验步骤中，若水凝胶将用于细胞培养应用，则后续所有操作均应在无菌柜或无菌罩内以无菌条件进行。
   1. 根据电子表格计算结果（参见 表1 示例），混合 PEG4SH、Pep2Alloc、Pep1Alloc、LAP 和 PBS+PS+FZ 的储备液。剧烈吹打移液，确保凝胶前体溶液充分混匀。
   2. 通过将 10–20 µl 凝胶前体溶液（PEG/Pep/LAP/PBS）移入无菌剪切的注射器尖端，制备在注射器尖端成型的厚水凝胶。每个注射器中制备一个凝胶，厚度约为 0.5–1.5 mm，具体取决于体积和注射器直径。
      注意：可根据所需凝胶尺寸探索更大体积，但上限可能受限于光图案化过程中 Pep1Alloc 的扩散限制，和/或细胞培养期间营养物质/代谢废物在包埋细胞与外界之间的扩散能力。
   3. 通过在未涂层载玻片边缘放置橡胶垫圈（厚度为 0.254 mm），在载玻片模具中制备薄水凝胶。将 5–10 µl 凝胶前体溶液（可在单个载玻片上通过一次或多次点样制备一个或多个 5–10 µl 的小凝胶）滴加至未涂层载玻片表面，然后将涂有抗粘附涂层的载玻片覆盖在凝胶溶液上方（可根据最终应用需求制备最大至载玻片尺寸的大面积凝胶）。使用小型文件夹夹固定载玻片，以保持稳定。
   4. 将模具置于光源下，并调节光源强度（例如，快门开启百分比），根据步骤 1.7.2 和 1.7.3 的测量结果，使注射器尖端模具或载玻片模具表面的光照强度达到 10 mW/cm²。
   5. 光照 1 至 5 分钟，以实现凝胶的完全聚合。对于 PEG4SH 含量较高的凝胶（8 wt% 或更高，1 分钟），使用较短的聚合时间；对于 PEG4SH 含量较低的凝胶（5–8 wt%，3–5 分钟），使用较长的聚合时间，从而获得模量处于软组织范围（0.5–5 kPa）内的完全聚合水凝胶。
   6. 将注射器尖端模具中的凝胶转移至无菌未处理的 48 孔板中，将载玻片模具中的凝胶连同载玻片一起放入无菌培养皿中。
   7. 根据计划进行的实验，用细胞培养基或适当的缓冲液（例如，PBS+PS+FZ、Ellman 反应缓冲液）清洗 3 次，每次 15 分钟。
2. 图案化水凝胶的制备。
   1. 根据电子表格计算结果混合 PEG4SH、Pep2Alloc、LAP 和 PBS+PS+FZ 的储备液，保留一定量的游离巯基（0.2–5 mM），以便后续与 Pep1Alloc 反应。剧烈吹打移液，确保前体溶液充分混匀。
   2. 按照步骤 2.1.2 至 2.1.6 所述方法制备厚水凝胶和薄水凝胶。
      注意：在进行光图案化前，切勿将凝胶置于生长培养基中。生长培养基中的成分可能消耗游离巯基（例如，与含巯基蛋白形成二硫键），导致无法在不额外处理（例如，还原二硫键）的情况下完成凝胶图案化。
   3. 配制 Pep1Alloc 溶液（终浓度约 3–20 mg/ml）和 2.2 mM LAP 溶液。
   4. 用 Pep1Alloc/LAP 溶液覆盖已形成的预凝胶，并在 37 °C 下孵育 1 小时。
   5. 去除多余的 Pep1Alloc/LAP 溶液。若凝胶在注射器尖端中成型，使用刮铲小心地将正在孵育的凝胶从 48 孔板转移至无菌载玻片上，用于后续图案化。
   6. 将带有目标图案的光掩膜直接放置在注射器尖端和载玻片模具成型的凝胶上方。确保掩膜印刷面与凝胶接触，以获得最佳图案保真度（即，掩膜应正向放置，乳剂面朝下）。将样品置于光源下，使用与载玻片实验相同的光源设置（步骤 1.7.3）照射 1 分钟。
   7. 图案化完成后，将注射器模具成型的凝胶转移至无菌、未经组织培养处理的 48 孔板中；将仍附着于载玻片上的载玻片模具成型凝胶放入无菌培养皿中。
   8. 根据计划进行的实验，用细胞培养基或适当的缓冲液（例如，PBS+PS+FZ、Ellman 反应缓冲液）清洗 3 次，每次 15 分钟。

3. 光图案化的可视化与定量分析

1. 使用Ellman法检测和定量光图案化水凝胶中的游离巯基。
   1. 按以下说明配制Ellman反应缓冲液、半胱氨酸工作液、标准品及Ellman试剂。
      1. 配制Ellman反应缓冲液：将2.4 g磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）和74.4 mg乙二胺四乙酸（EDTA）溶于200 ml去离子水（dIH₂O）中（终浓度为0.1 M Na₂HPO₄，1 mM EDTA）。用氢氧化钠（NaOH）或磷酸（H₃PO₄）溶液调节pH至7.5–8。
      2. 配制半胱氨酸工作液：将5.27 mg半胱氨酸溶于15 ml反应缓冲液中（终浓度为2 mM半胱氨酸）。
      3. 配制半胱氨酸标准品：用反应缓冲液将半胱氨酸工作液稀释至终浓度分别为2、1.5、1.25、1、0.75、0.5、0.25和0 mM的系列标准溶液。
      4. 配制Ellman试剂：将4 mg Ellman试剂溶于1 ml反应缓冲液中。超声处理以完全溶解Ellman试剂。
   2. 使用Ellman法测定凝胶中游离巯基的浓度（图2）。
      注：下述步骤中描述并推荐使用在载玻片之间成型的“薄”5 µl水凝胶，以便Ellman试剂能够快速扩散通过凝胶（即，试剂在厚凝胶中扩散所需时间更长）。
      1. 根据体积溶胀比Q，确定“薄”5 µl凝胶的溶胀体积（V_S）。
         1. 使用注射器模具制备三个20 µl的“厚”凝胶。将凝胶置于Ellman反应缓冲液中24小时后称重（平衡溶胀质量，M_S）。随后冻干凝胶并再次称重（干重，M_D）。
         2. 利用厚凝胶测得的质量数据，通过公式Q = 1 + ρ_polymer/ρ_solvent(M_S/M_D-1) 计算体积溶胀比²⁸，其中PEG的ρ_polymer = 1.07 g/cm^3 29，PBS/H₂O的ρ_solvent = 1.0 g/cm³。
         3. 通过加和各组分PEG4SH、Pep1Alloc和Pep2Alloc的质量，计算用于Ellman法测定的凝胶理论干重（此处通常使用5 µl“薄”凝胶）（M_D = M_PEG4SH + M_Pep1Alloc + M_Pep2Alloc）。例如，一个含10 wt% PEG4SH的5 µl凝胶，其PEG质量约为0.000535 g，计算方式为M_PEG4SH = 0.005 cm³ × 1.07 g/cm³ × 0.10。Pep1Alloc和Pep2Alloc的质量可根据溶液中的质量百分比类似计算（参见电子表格中的数值），假设这些水溶液的密度ρ ≈ 1.0 g/cm³。
            注：也可选择将凝胶干燥后称重，而非计算理论干重。然而，由于5 µl的薄凝胶难以稳定称量，该方法可能存在操作困难。
         4. 基于预测的干重及从“厚”凝胶测得的Q值，计算“薄”凝胶的预测溶胀质量M_S（见步骤3.1.2.1.1中的公式）。假设ρ ≈ 1.0 g/cm³，则M_S ≈ V_S。使用该计算得到的V_S进行定量Ellman测定。
            注：推荐采用上述方法确定溶胀凝胶的V_s，因为“薄”5 µl凝胶在转移称重时操作困难。
      2. 按照第2.2节所述方法制备用于图案化的薄水凝胶（体积为5 µl）。具体而言，制备含有过量游离巯基的凝胶，并使用透明盖玻片对其中一半样品进行“图案化”处理，即用光全面照射整个凝胶（例如，共6个含过量巯基的凝胶：3个未修饰的非“图案化”凝胶和3个“图案化”凝胶）。
         注：在本实验中，“图案化”凝胶在无光掩模的情况下接受全区域光照。该方法用于测定整个凝胶样品中消耗的游离巯基总数，并评估肽对游离巯基的修饰效率。由此信息，可根据凝胶厚度和图案区域（受光照区域）预测使用光掩模进行图案化时所消耗的游离巯基数。
      3. 将“图案化”和非“图案化”凝胶置于48孔板的孔中，用Ellman反应缓冲液清洗3次，每次15分钟，以使未反应物质从凝胶中扩散出来，并达到平衡溶胀状态。
      4. 向清洗后的凝胶中加入额外的Ellman反应缓冲液，使含反应缓冲液的V_s为20 µl的整数倍。例如，若预测V_S为15 µl，则加入5 µl反应缓冲液（共20 µl）；若预测V_S为30 µl，则加入10 µl反应缓冲液（共40 µl）。
      5. 根据上一步所用体积的整数倍，将半胱氨酸标准品用移液器加入96孔板的各个孔中（不含凝胶）。（即，若上一步中V_S + 额外反应缓冲液 = 40 µl，则向各空孔中分别加入40 µl标准品）。
      6. 将Ellman试剂用反应缓冲液稀释（每180 µl反应缓冲液中加入3.6 µl Ellman试剂；例如，步骤3.1.2.5中对应20 µl样品为183.6 µl，对应40 µl样品为367.2 µl）。
      7. 将稀释后的Ellman试剂加入含标准品和样品的孔中。对于20 µl样品，每孔加入183.6 µl溶液；对于40 µl样品，加入的稀释Ellman试剂量加倍（或根据样品体积相应调整）。
      8. 在室温下孵育或置于摇床上震荡1小时30分钟，或直至溶液颜色与凝胶颜色通过肉眼观察一致，以确保黄色的2-硝基-5-巯基苯甲酸二价阴离子（TNB^2-）——由Ellman试剂与游离巯基反应生成——充分从凝胶中扩散出来。
      9. 从样品和标准品中各取100 µl溶液，转移至96孔板的孔中。
      10. 使用酶标仪在405 nm波长处读取吸光度。
      11. 数据处理时，绘制标准曲线（来自步骤3.1.1.3的样品）（吸光度对浓度），并拟合线性函数。利用该线性函数，可根据吸光度读数计算“稀释凝胶”溶液（凝胶 + 反应缓冲液）中游离巯基的浓度。最后，考虑与反应缓冲液的“稀释”效应，计算不含反应缓冲液的凝胶中游离巯基的实际浓度。（例如，若15 µl凝胶用5 µl反应缓冲液稀释，则乘以20/15）。
   3. 使用Ellman试剂可视化光图案（图3A）。
      1. 将经Pep1Alloc图案化的薄水凝胶浸泡于Ellman反应缓冲液中1小时。
      2. 用纸巾轻轻擦拭凝胶边缘，去除多余的反应缓冲液。
      3. 直接将Ellman试剂滴加至凝胶表面。立即在10倍光学显微镜或带彩色相机的体视显微镜下成像。
         注：必须立即成像，因为由Ellman试剂与非图案区域中巯基反应产生的黄色TNB^2-离子会在5分钟内扩散至整个凝胶，导致图案逐渐消失。非图案区域肉眼可见轻微黄色；对于更高分辨率或更小图案，需借助放大设备（例如，显微镜）进行观察。
2. 使用荧光肽可视化光图案（图3B）。
   1. 若需更高分辨率或三维成像，可在步骤2.2中将AF488标记的Pep1Alloc（或类似荧光肽）光图案化至凝胶中。
   2. 在荧光显微镜下成像。可使用共聚焦显微镜获取凝胶的z轴层扫图像，以便在x、y和z平面上观察图案。
      注：使用荧光时，必须避免光照以保持AF488荧光团的稳定性并获得最大荧光信号。由于荧光肽在避光条件下较为稳定，因此无需立即成像（可将样品置于铝箔包裹的容器中，4 °C保存）。

4. 细胞在水凝胶中的包封与光图案化

1. 收集与制备用于包封的细胞
   1. 按照标准的无菌哺乳动物细胞培养操作，用胰蛋白酶消化并从培养板上收集目的细胞。细胞脱落后，用完全培养基终止胰蛋白酶反应。例如对于T-75培养瓶，加入5 ml胰蛋白酶消化，用5 ml培养基终止反应，再用5 ml培养基冲洗培养瓶，共收集15 ml。
      注意：不同细胞类型的胰蛋白酶消化时间可能有所不同，但通常在5至15分钟之间。可选用其他细胞解离试剂（例如，若需要，可使用Versene收集细胞。
   2. 使用血细胞计数板或其他细胞计数装置，对胰蛋白酶消化后的细胞悬液等分试样进行细胞计数（至少100个细胞，或按照试剂制造商的方案要求），同时将剩余的细胞悬液以90–110 × g离心5分钟。若初始的胰蛋白酶消化细胞悬液浓度过低，离心后用少量磷酸盐缓冲液（PBS）或培养基重悬细胞沉淀，并重新计数。
   3. 在最小体积的PBS中重悬细胞，并将细胞分装至微量离心管中，每管对应一种凝胶条件，使细胞与凝胶溶液混合后（聚合前）浓度为5,000个细胞/µl。
      注意：典型的细胞分装量为 300,000–500,000 个细胞，足以制备 60–100 µl 凝胶/细胞悬液，可用于制备 3–5 份每份 20 µl、含 5,000 个细胞/µl 的凝胶。根据实验需求，可调整细胞包封密度，以分别获得更高或更低的细胞间接触与细胞-基质接触程度，具体密度应根据每种应用条件进行优化确定。
   4. 离心细胞/PBS等分试样（90–110 × g，5分钟）。
   5. 在微离心管中，于包封前小心吸除细胞沉淀中的PBS。
      注意：如果细胞对剪切力敏感，可通过计数（省略第二次离心步骤）例如，血细胞计数板），随后将胰蛋白酶消化的细胞悬液（胰蛋白酶 + 培养基 + 细胞）分装为每种凝胶条件所需的等分量。这些分装样品经一次离心（90–110 × g，5 分钟），吸除胰蛋白酶和培养基，留下用于包封的细胞沉淀。
2. 在无图案水凝胶中包封细胞
   1. 吸尽 PBS 后立即按照电子表格中的计算结果，将细胞沉淀重悬于 PEG4SH、Pep2Alloc、Pep1Alloc、LAP 以及 PBS+PS+FZ 中，终浓度为 5,000 个细胞/µl。
   2. 按照步骤 2.1.2 至 2.1.6 所述进行水凝胶的成型与聚合。
      注意：在载玻片模具中包埋细胞时，聚合后移除顶部载玻片需格外小心，以避免剪切水凝胶，否则可能导致细胞死亡。为便于将凝胶从模具中取出，可在聚合后将载玻片模具置于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）或生长培养基中，使垫圈和水凝胶充分润湿，从而更易移除顶部载玻片。为彻底避免剪切损伤，可采用注射器模具法。
   3. 用生长培养基将凝胶冲洗3次，每次10分钟，以去除未反应的物质和过量的LAP。
   4. 在37 °C、5% CO₂条件下，将凝胶置于生长培养基中孵育₂ 直至达到进一步分析所需的时间点。每48小时或根据具体应用确定的时间更换培养基。例如特定细胞类型和培养基的典型换液间隔时间。
3. 在细胞存在下进行细胞封装与光图案化
   1. 吸尽 PBS 后，立即按照电子表格中的计算结果，将细胞沉淀重悬于 PEG4SH、Pep2Alloc、LAP 及 PBS+PS+FZ 中，终浓度为 5,000 个细胞/µl。保留适量浓度的游离巯基（例如，2 mM）用于后续与Pep1Alloc反应。
   2. 按照步骤 2.2.2 至 2.2.8 所述，对水凝胶进行成型、聚合和图案化。
   3. 图案化后，用生长培养基将凝胶冲洗3次，每次10分钟，以去除未反应的物质和过量的LAP。
   4. 在37 °C、5% CO₂条件下，将凝胶置于生长培养基中孵育₂ 直至达到进一步分析所需的时间点。每 48 小时或根据具体应用确定的时间更换培养基。

5. 测定包封细胞的活力和代谢活性

1. 进行活/死细胞毒性检测以确定包封细胞的存活率（图 4A）。
   1. 从凝胶中移除生长培养基，并用 PBS 洗涤 3 次，每次 15 分钟，以使培养基从凝胶中充分扩散出来。
   2. 解冻活/死细胞毒性检测试剂（ethidium homodimer-1 和 calcein AM）。
   3. 将 2 µl 的 2 mM ethidium homodimer-1 溶液和 0.5 µl 的 4 mM calcein AM 溶液加入 1 ml 无菌 PBS 中。涡旋混匀以确保完全混合。
   4. 向 48 孔板中的每个注射器模具凝胶中加入 300 µl 染色液，或加入足够覆盖置于无菌培养皿中载玻片上凝胶表面的染色液，于 37 °C 孵育 45 分钟。
   5. 移除多余的染色液，并用 PBS 洗涤 3 次，每次 15 分钟，以去除凝胶中残留的染料。
   6. 使用共聚焦显微镜（z-stack 图像）或具备 z-stack 功能的落射荧光显微镜在 10X 物镜下、激发/发射波长为 488/525 nm 的条件下进行成像。通过投影 z-stack 图像，并使用图像分析软件计数活细胞（整个细胞呈绿色）和死细胞（细胞核呈红色）的数量，以定量活细胞数目。
2. 进行代谢活性检测以评估细胞包封后的活性（图 4B）。
   1. 在检测前 24 小时，用新鲜生长培养基更换包封细胞的培养基。
      注意：额外向几个不含凝胶或不含细胞的孔中加入培养基作为对照（用于背景读数）。
   2. 在目标时间点，解冻 MTS 试剂溶液。
      注意：为评估随时间变化的代谢活性，建议设置一个初始时间点（包封后 12–24 小时）作为与后续时间点比较的参考。
   3. 向每个孔中加入 MTS 试剂（每 100 µl 培养基加入 20 µl）。
   4. 根据制造商说明，在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 1–4 小时。
      注意：孵育时间应足以让细胞还原 MTS 并使甲臜产物从凝胶中扩散出来。因此，较厚的凝胶（如注射器尖端凝胶）可能需要更长的孵育时间（约 4 小时），以实现充分的 MTS 还原和产物扩散。
   5. 用移液器将 100 µl 还原后的 MTS/培养基转移至 96 孔板的干净孔中，在酶标仪上于 490 nm 波长处测定吸光度。
   6. 从样品吸光度值中减去无细胞孔的背景吸光度，得到基线校正后的吸光度值。

结果

光封装细胞以及随后对含有封装细胞的凝胶进行光图案化的装置与步骤如图所示 图1， 并提供了配制10 wt%凝胶的储备溶液的示例 表1使用 表1，计算出聚合水凝胶所需的单体（PEG4SH、Pep2Alloc、±Pep1Alloc）和光引发剂（LAP）的用量。根据这些计算结果，配制PEG4SH、Pep1Alloc、Pep2Alloc和LAP的储备溶液，并分别加入或不加入Pep1Alloc以形成和光图案化凝胶（图1A随后，从培养板中收集细胞，计数后按适当数量离心，用于包封。图1B). 将细胞沉淀重悬于凝胶形成溶液（PBS中的肽/聚合物/LAP）中，然后将细胞/单体混合物转移至玻璃或注射器模具中。在光照条件下（1-5分钟，10 mW/cm²）使细胞包埋于水凝胶中。² 在 365 nm 处）图1C）。对于光刻图案化（图1D），凝胶分别用Pep1Alloc和LAP浸泡30分钟至1小时30分钟，使多肽和引发剂扩散进入已聚合的基质中。将含有多肽的凝胶覆盖具有预定图案的光掩膜，并接受第二轮光照（1分钟），以将多肽共价连接至基质中的游离巯基。仅在光照区域，侧链 tether 才会共价结合到凝胶上，从而促进适当的细胞-基质相互作用，并模拟天然细胞微环境的关键力学和生化特性，用于探究细胞功能与命运 体外.

Ellman 法提供了一种简便且经济的方法，用于定量测定光图案化基质中的凝胶修饰及多肽的掺入情况。聚合完成后，将图案化与非图案化的凝胶（即，经或未经多肽修饰的凝胶）浸入 Ellman 反应缓冲液中。随后，将半胱氨酸标准品及浸泡在缓冲液中的凝胶置于 48 孔板中，并与 Ellman 试剂共同孵育（图 2A，左图）。1 小时 30 分钟后，取各样品等分试样加入 96 孔板的各个孔中，在 405 nm 处测定吸光度。根据半胱氨酸标准品绘制校准曲线（吸光度对浓度，线性拟合）（图 2A，右图），并结合稀释倍数确定凝胶中游离巯基的含量。不同聚合与光图案化条件下 10 wt% 凝胶的游离巯基浓度如 图 2B 所示。未添加 Pep1Alloc 聚合 1 分钟或 5 分钟的凝胶（蓝色柱状图，I = 1 分钟，II = 5 分钟）其游离巯基浓度在统计学上无显著差异，表明反应迅速发生，凝胶在 1 分钟内已完全形成（双尾 t 检验，p >0.05）。因此，额外延长光照时间（2–5 分钟）不会导致功能基团进一步转化。将聚合 1 分钟且未添加 Pep1Alloc 的凝胶分别在含 Pep1Alloc（3 mg/ml）和 LAP（2.2 mM）的溶液中浸泡 30 分钟和 90 分钟（绿色柱状图，II = 30 分钟，IV = 90 分钟），随后再接受 1 分钟的光照。游离巯基的减少（相对于 1 分钟条件减少 60–80%）表明在此条件下，凝胶通过悬挂信号分子实现了高效修饰。若需更高的修饰程度，可提高 Pep1Alloc 溶液的浓度，因为在较稀的多肽溶液中，Pep1Alloc 对凝胶中游离巯基的可及性可能限制转化效率；例如，我们发现使用高达 20 mg/ml 的 Pep1Alloc 浓度可实现 >90% 的游离巯基转化率。

独特的是，添加到水凝胶中的肽段图案可使用Ellman试剂快速成像（图3A，5分钟内完成）。然而，由于黄色的TNB^2-双阴离子在凝胶中扩散，图案的可视化会随时间推移而消失（超过5分钟后）。为了提高成像分辨率，并在细胞存在的情况下实现三维（x、y和z平面）图案观察，可采用荧光标记肽段（AF488Pep1Alloc）。在图3B中展示了使用共聚焦显微镜获取的图像堆栈的x、y和z投影，显示了微米尺度的图案分辨率。

在封装后第1天和第6天，分别有约 (94 ± 2)% 和 (94 ± 1)% 的人骨髓间充质干细胞（hMSCs）在可降解凝胶（Pep2Alloc = GPQG↓WGQ）中保持活性（绿色细胞体），仅观察到少量死细胞（红色细胞核）（图4A）。此外，在封装后第6天可观察到hMSC的伸展现象（图4A，插图），表明细胞能够重塑并与经RGDS修饰的MMP可降解基质相互作用。对封装于非降解性凝胶（Pep2Alloc = RGKGRK）中的细胞在封装后第1天和第3天进行代谢活性检测（图4B），作为细胞活力的另一项评估指标，结果表明，在不同光照封装和光图案化条件下（Ellman法检测，图2B），细胞仍保持活性。特别是，Pep1Alloc+LAP孵育30分钟与90分钟（条件III和IV）与初始封装条件（条件I和II）相比，代谢活性无显著差异，说明该方法适用于在含有封装细胞的情况下进行光图案化操作（双尾t检验，p > 0.05）。

图1： 水凝胶内细胞包封及随后利用生化信号进行光图案化的实验装置 (A) 分别配制大分子单体和光引发剂的储备液，并进行混合（PEG4SH = 主链，Pep2Alloc = 交联剂，Pep1Alloc = 侧链黏附基团（RGDS），LAP = 光引发剂）。B) 收集细胞用于包封。C细胞与不含或含有整合素结合肽的高分子溶液（分别为 PEG4SH/Pep2Alloc/LAP 或 PEG4SH/Pep2Alloc/Pep1Alloc/LAP）混合，并在光照下封装。 (D在凝胶形成过程中含有过量巯基的凝胶（此处为 PEG4SH/Pep2Alloc/LAP，以 2 mM 过量巯基形成），可通过后续添加带有单个 alloc 基团的功能化肽段（Pep1Alloc）来实现生化信号的图案化 例如RGDS，IKVAV， 等等。以促进凝胶特定区域的细胞黏附。此处展示了用荧光标记的RGDS对凝胶进行图案化。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 2： 定量Ellman法测定图案化水凝胶修饰的实验设置与结果。（A）将凝胶和半胱氨酸标准品与Ellman试剂在48孔板中孵育。绘制线性标准曲线以测定凝胶样品中的半胱氨酸浓度。（B）在凝胶形成过程中，水凝胶内引入过量的游离巯基，并在使用悬挂的alloc肽进行图案化时被消耗（I = 聚合1分钟；II = 聚合5分钟；III = 与Pep1Alloc孵育30分钟；IV = 与Pep1Alloc孵育90分钟；III和IV均经光照聚合和图案化1分钟）。所示数据为平均值（n = 3），误差条表示标准误差。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3： 使用Ellman试剂检测和荧光图像观察光图案化水凝胶。（A）Ellman试剂可用于快速检测x轴和y轴平面上的图案（线条）（黄色 = 未图案化区域，比例尺 = 1 mm）。（B）可使用荧光标记的多肽观察x、y和z轴平面上的图案（绿色 = 图案化区域；200 µm比例尺；10X水浸物镜；激发/发射波长488/525 nm）。请点击此处查看该图的放大版本。

图4： 非降解性光图案化水凝胶中细胞的存活率与代谢活性。（A）人骨髓间充质干细胞（hMSCs）在封装后24小时被包埋于水凝胶中，其活细胞（绿色；激发/发射波长488/525 nm）与死细胞（红色；激发/发射波长543/580 nm）的共聚焦z轴层扫图像（z轴投影；10倍水浸物镜）示例（比例尺 = 200 µm）。封装6天后，细胞在水凝胶内发生铺展（插图，比例尺 = 50 µm）。（B）在不同聚合（I = 聚合1分钟；II = 聚合5分钟）和图案化条件（III = 与Pep1Alloc孵育30分钟；IV = 与Pep1Alloc孵育90分钟；所有样品均经1分钟光照进行聚合与图案化）下，细胞在封装后第1天和第3天（分别为深色和浅色柱状图）均表现出代谢活性。所示数据为均值（n = 3），误差线表示标准误。请点击此处查看该图的放大版本。

表 1： 计算制备水凝胶所需母液体积的示例设置。电子表格中以蓝色高亮的单元格表示用户自定义参数；其他数值则根据这些设置自动计算得出。用于制备凝胶的各母液最终体积以橙色高亮显示。白色单元格中包含基于用户自定义参数计算最终体积所使用的公式。请注意，2.2 mM LAP 的浓度相当于 0.067 wt%。

讨论

本文所展示的方法演示了利用巯基-烯烃点击化学反应形成的水凝胶将细胞进行光封装，并随后通过生化信号对凝胶进行光图案化。使用光来初始形成水凝胶，可在聚合前实现细胞在聚合物溶液中的均匀混合与悬浮。快速聚合过程可使凝胶“锁定”在特定模具的形状中，并将悬浮的细胞包埋于水凝胶网络内。此外，凝胶也可被塑造成多种不同形状（例如，载玻片或注射器尖端），具体取决于最终应用需求。例如，将细胞封装在附着于载玻片的水凝胶中用于三维培养，特别适用于成像应用，因为薄样品中的光衰减较小。而使用注射器模具则可实现细胞的快速封装，能够在较短时间内制备更多样品（相较于载玻片），适用于需要大量细胞的实验，如流式细胞术或定量PCR。随后，这些凝胶还可被赋予生化信号图案，以诱导细胞产生特定响应，如分化或侵袭行为。^30,31

活力和代谢活性检测结果表明，在所述材料体系和图案化条件下，细胞能够存活。需注意，在不可降解凝胶（RGKGRK 肽交联）中，代谢活性监测持续至第 3 天，以评估聚合和图案化条件对细胞功能的初始影响。此外，在含有可降解肽交联（GPQGIWGQ）的凝胶中包封人骨髓间充质干细胞（hMSCs）后第 1 天和第 6 天进行的膜完整性检测（活/死细胞活力/细胞毒性染色）结果表明，细胞在培养 1 周后仍保持活性并发生铺展。已有文献报道，在与本研究所用条件相似的光图案化条件下其他细胞系的存活情况³²，可通过活/死染色和代谢活性检测对本文所述水凝胶体系进行类似评估。尽管在使用本材料体系及相关操作步骤（4.2 和 4.3）时未观察到细胞活力方面的问题，但某些细胞类型可能对自由基和/或光照暴露敏感。在此情况下，使用者可考虑采用非光引发的材料体系，例如叠氮-炔烃¹²、FXIII³¹ 或基于 Diels-Alder 反应的水凝胶形成化学方法³³。

还介绍了检测和量化凝胶内生化信号模式的简便技术（3.1 和 3.2）。Ellman 法特别值得关注，因为其试剂可商业获取，且无需额外的合成处理步骤或更昂贵的试剂例如，需使用荧光标记的多肽）。Ellman 法可用于精确定量在不同光图案化条件下生化信号对游离巯基的修饰程度，并快速可视化图案。为定量多肽的掺入情况，可通过 Ellman 法直接测定图案化前后巯基官能团的浓度，该浓度作为多肽掺入量的定量指标。尽管此类定量也可通过荧光标记的多肽实现，³⁴ 基于成像的定量需要更耗时的处理和分析步骤（例如合成荧光标记肽并利用图像分析生成校准曲线，以关联荧光信号与肽浓度。在成像肽掺入情况时，可直接将Ellman试剂应用于样品并立即进行可视化观察。尽管该方法仅限于在x-y平面上进行图案可视化，但仍可作为一种简单、常规的方法，用于判断含有游离巯基的基质是否已被成功图案化。需注意的是，Ellman法不具备细胞相容性，因此虽然可用于观察和量化光图案，但不能在细胞存在的情况下使用。若需在三维空间中以及细胞共存条件下进行图案成像，荧光标记肽在水凝胶基质中的共价结合仍是一种强大且广泛应用的方法。利用共聚焦显微镜可在x、y和z平面上评估图案的分辨率，且该方法具有细胞相容性，可识别位于图案化区域或非图案化区域内的细胞。综上所述，Ellman法与基于成像的技术互为补充，为研究人员提供了对材料体系内生化信号光图案化效果进行定性与定量评估的有效工具。

用于在细胞存在下形成和修饰水凝胶的光引发化学反应（或更广义的光点击化学）种类繁多。本文介绍的成型、包封和图案化技术不仅限于所描述的材料体系，也可应用于其他基于光的化学反应，例如巯基-炔烃反应³⁵、叠氮-炔烃反应⁴以及其他巯基-烯烃化学反应（例如，巯基-降冰片烯）^10,13，并可结合不同的光引发剂使用，如Irgacure 2959、伊红Y和樟脑醌。需要注意的是，使用者可能需要调整实验参数（例如，孵育时间、聚合时间、细胞密度），以确保这些其他体系仍保持细胞相容性。由于图案化过程依赖于alloc修饰的肽段向水凝胶内的扩散（2.2.3–2.2.5），该方法在向水凝胶中添加需要与网络共价连接才能介导细胞产生牵引力并完全激活整合素的整合素结合基团（例如，肽段或细胞外基质蛋白片段）时可能最为有效³⁶。需要注意的是，对于在溶液中或固定后均具有类似生物活性的生物分子（例如，生长因子或细胞因子），该基团向水凝胶内扩散的孵育步骤（约1小时）可能导致信号激活事件，从而干扰图案化结果。已有其他方法被建立用于生长因子的固定化或局部隔离以实现其图案化^37–39。此外，图案分辨率取决于对光照的控制精度。本方法中使用光掩模可在凝胶深度方向以及x-y平面上形成图案；然而，若采用其他辐照方式（例如双光子共聚焦显微镜），可在x、y和z三个维度上实现对凝胶内生化信号更精确的空间控制^34,40。最后需要强调的是，尽管本实验所用材料体系仅在初始阶段被修饰以引入生化信号，但通过正交光点击化学反应，未来可实现随时间动态调控基质性质¹²。本文所呈现的方法与技术进一步丰富了当前构建具有明确定义且时空可控特性的合成基质的策略。特别是，本实验中所用试剂与材料的商业化可获得性，将为广泛致力于水凝胶类生物材料在可控细胞培养中应用的研究人员提供便利。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
定制多肽	多家供应商	----	多肽也可使用标准固相多肽合成（SPPS）技术制备，所需材料可从ChemImpex和ChemPep等供应商处获取。
4臂PEG硫醇，分子量20k	JenKem USA	4ARM-SH	列于多臂同功能PEG产品下。PEG4SH也可按前述方法自行合成。
苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次磷酸锂	Colorado Photopolymer Solutions	Li-TPO
二甲基苯基亚膦酸酯	Sigma Aldrich	149470	注意：可引起严重皮肤灼伤和眼损伤。操作时需佩戴防护手套、防护服和护目用具。
2,4,6-三甲基苯甲酰氯	Sigma Aldrich	682519	注意：可引起严重皮肤灼伤和眼损伤。操作时需佩戴防护手套、防护服和护目用具。
溴化锂	Sigma Aldrich	213225
2-丁酮	Sigma Aldrich	360473
圆底烧瓶，100 ml	Chemglass	CG-1506-05
80 ml 布氏漏斗，中号烧结	Chemglass	CG-1402-L-02	如需要，也可使用普通玻璃漏斗内衬滤纸。
磁力搅拌子	多家供应商	----
磁力搅拌加热板	多家供应商	----
真空干燥器	多家供应商	----
重水	Acros Organics	16630
杜尔贝科磷酸盐缓冲液	ThermoFisher Scientific	14190-250
青霉素-链霉素	ThermoFisher Scientific	15070-063
两性霉素B（Fungizone）	ThermoFisher Scientific	15290-018
胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红	ThermoFisher Scientific	15400-054	根据细胞类型选择合适的培养基和胰蛋白酶。
微量离心管	多家供应商	----	1.5 或 2 ml 规格，无菌。
BD 带滑动（鲁尔）接头注射器（无针头）	Fisher Scientific	14-823-16H	此处列出的产品编号对应1 ml注射器（16H），其他规格也可提供（14-823-XX）。
Fisherfinest Premium 普通载玻片	Fisher Scientific	12-544-1
高纯度硅橡胶，厚度0.010"，尺寸6" × 8"，硬度55A（垫片用）	McMaster Carr	87315K62
乙醇，200度（无水）	Decon Labs	2701
RainX 原装	Amazon	800002243	也可从其他供应商处购买。
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2
光刻掩模	Advance Reproductions Corporation	----	光刻掩模部门，可根据需要打印不同设计。
DTNB；Ellman试剂；5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)	ThermoFisher Scientific	PI-22582
磷酸氢二钠	Sigma Aldrich	S5136
乙二胺四乙酸	Sigma Aldrich	E6758
氢氧化钠，颗粒，ACS认证	Fisher Scientific	S318
正磷酸	Alfa Aesar	33266
盐酸半胱氨酸一水合物	Sigma Aldrich	C7880
LIVE/DEAD 细胞活力/细胞毒性检测试剂盒（适用于哺乳动物细胞）	ThermoFisher Scientific	L-3224
CellTiter 96 水溶液单试剂检测	Promega	G3582
离心机	多家供应商	----	转速需可达90–110 × g。
多孔板读板仪	多家供应商	----	可读取96孔板在405 nm处的吸光度。
落射荧光或共聚焦显微镜	多家供应商	----	用于观察水凝胶中的多肽图案和细胞。
Omnicure Exfo Series 2000	Excelitas Technologies	----	可使用其他光源系统进行水凝胶的光聚合。
Zeiss Zen Lite 软件	Zeiss	----	可在zeiss.com获取；适用于蔡司显微镜拍摄的图像
ImageJ	NIH	----	可在imagej.nih.gov获取；适用于常规图像分析