家畜受精卵的激光辅助胞质内显微注射

摘要

本方案展示了如何在农场动物的受精卵中进行细胞质显微注射。该技术可用于将任何溶液注入单细胞胚胎中，例如基因组编辑工具，以生成基因敲除动物。

摘要

细胞质显微注射到单细胞胚胎中是一种非常强大的技术。例如，该技术可用于递送基因组编辑工具，从而产生可在成体生物每个细胞中都存在的遗传修饰。它还可用于递送siRNA、mRNA或阻断性抗体，以研究植入前胚胎中的基因功能。在啮齿类动物中常用的胚胎显微注射传统技术，是使用一根极细的微吸管直接穿刺进入胚胎的质膜。然而，当该技术应用于家畜动物时，通常效率较低。这主要是因为与小鼠和大鼠不同，牛、羊和猪的受精卵具有非常深色的细胞质以及高度弹性的质膜，使得注射过程中难以观察和穿透质膜。在本方案中，我们描述了一种适用于将溶液递送至牛受精卵细胞质的显微注射方法，该方法已被证明对绵羊和猪的胚胎同样有效。首先，使用激光在透明带中打孔；然后将一根钝端玻璃微吸管通过该孔插入，并推进至吸管尖端进入胚胎约3/4深度的位置；接着通过将细胞质内容物吸入吸管内来破裂质膜；最后，将吸入的细胞质内容物连同目标溶液重新注射回胚胎的细胞质中。该方案已成功用于向牛和羊的受精卵递送多种溶液，效率达到100%，细胞裂解极少，并能维持正常的囊胚发育率。

引言

对单细胞胚胎进行胞质显微注射是一种非常强大的技术。该技术可用于向胚胎内递送任何溶液，例如，通过基因敲除来研究基因功能，或创制基因编辑动物。大多数与农业相关的家畜受精卵含有较高的脂肪酸成分，导致其胞质不透明且颜色较深¹。此外，它们的质膜（PM）具有较强的弹性。这些特性使得在啮齿类动物中常用的原核/胞质显微注射方法在这些物种中的应用变得困难且常常不够准确。

与原核显微注射相比，胞质内显微注射具有优势，因其操作更为简便，且对注射胚胎造成的损伤更小，从而获得更高的存活率²。本实验方案的总体目标是展示一种成功将溶液递送至家畜受精卵胞质内的方法。为了在家畜胚胎上高效地进行胞质内显微注射，首先使用激光在透明带（ZP）上打孔，然后利用钝端玻璃针进行显微注射。该策略旨在减少注射过程中对胚胎造成的机械损伤。随后，通过注射针吸出少量胞质内容物，可有效且可靠地破坏质膜（PM），确保溶液被准确递送至胚胎的胞质内。

该技术已成功应用于牛胚胎，将siRNA递送至合子胞质^3,4，并利用成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）系统产生突变⁵。该方法经过少量修改后，也可适用于牛冠丘细胞包被的卵母细胞注射⁶。本文中，我们描述了使用染料进行注射的操作方案，该方案可适用于将任何所需溶液注入合子，并证明该技术引起的细胞....

方案

1. 微量移液器的制备

1. 注射微移液管
   1. 将一根硼硅酸盐玻璃毛细管（外径（OD）：1.0 mm，内径（ID）：0.75 mm）放入微移液管拉制仪中（置于左右毛细管夹持器的中央位置），并锁紧。
   2. 使用合适的程序拉制玻璃毛细管，使其形成具有长锥形的细尖端。（示例参数：加热温度：825；拉力：30；速度：120；时间：200；压力：500）。
   3. 小心地将拉制好的移液管从仪器中取出，并水平放置于微加工仪（microforge）上。
   4. 调节显微镜焦距，使拉制好的移液管与微加工仪加热丝及其玻璃珠清晰成像。使用目镜测微尺测量所需厚度，并水平移动移液管，直至加热丝处的移液管内径达到目标值（5 µm）。
   5. 将加热温度调节至约45%，轻轻下移移液管使其接触加热丝，短暂启动加热器。这会使移液管轻微熔化并粘附于加热丝上，冷却后在接触点处断裂，从而形成平直切口。
      注意：此步骤中设定合适的温度至关重要，温度过高会导致移液管弯曲，无法获得平直切口；温度过低则不足以熔化玻璃（图1A）。
   6. 将移液管尖端附近位置移至距离加热丝约10 µm处，形成约30°的倾斜角。将温度设为60%，启动加热器。
      注意：这会使移液管在加热丝上方弯曲。该角度的设计目的是确保当移液管安装至显微注射装置时，其针尖与注射板表面平行（图1B）。
   ....

结果

激光辅助胞质显微注射是一种将溶液递送至家畜受精卵胞质中的高效且可靠的技术。 图3 展示了受精卵在注射前后的总体形态以及该技术的整体操作流程。实验中使用右旋糖酐-红色溶液作为注射物，以便追踪注射位点，并评估注射的效率与准确性。 图4 展示了成功递送溶液的示例，图中为一枚近期完成注射的胚胎，染料在胞质中均匀分布。采用该技术可实现100%的胚胎胞质注射成功率。

本方案在牛和羊的受精卵中表现出极低的裂解率。显微注射后，牛和羊的注射胚胎裂解率分别为15.6 ± 5%和5.8 ± 3.9%(图5)。此外，如图6所示，无论是牛胚胎（对照组32.8 ± 6.6%，注射组31.4 ± 5.9%）还是羊胚胎（对照组40.3 ± 7.8%，注射组30.3 ± 6.0%），对照组与注射组之间的囊胚发育率均无统计学显著差异。

讨论

原核期卵母细胞显微注射是一种将溶液导入哺乳动物胚胎的成熟技术。根据物种和实验目的的不同，该技术在具体操作上略有差异，但总体上具有广泛适用性。本文展示了如何利用激光辅助钝端微吸管进入细胞质进行胞质内显微注射。一些家畜物种（如牛、羊和猪）的受精卵具有较深色的细胞质，导致显微注射针进入胚胎后难以观察。此外，其细胞膜弹性较强，使用斜面尖针（通常用于啮齿类动物受精卵注射）穿透膜结构较为困难。为克服这些限制，我们采用激光在透明带打孔，使钝端针顺利通过，并通过回吸细胞质内容物，确保细胞膜破裂，从而使溶液释放至胚胎细胞质内。此外，通过在针头进入位置的对侧（约深入胚胎内部3/4处）进行注射，旨在避开原核（PN），避免其被吸入或直接受到注射影响。同时，这种方法可增加膜破裂处的闭合接触点，从而降低细胞裂解率。

制备良好的微移液管（特别是注射用移液管）并将其正确安装到显微操作仪上，是获得该技术良好结果的关键。只要注射液在针内流动顺畅，注射针便可继续使用。有时细胞质内容物甚至原核内容物会堵塞针尖，导致液体流动不均，增加注射难度（这也会提高裂解率并延长.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
微移液管拉制仪	Sutter Instrument	P-97
玻璃毛细管	Sutter 仪器	B100-75-10	这些毛细管用于制作持卵和注射移液管。可使用任何不含纤维丝的厚壁/标准壁硼硅酸盐玻璃管。
显微操作仪	Narishige	MF-9	配备10倍放大镜头。
显微操作仪	尼康/成茂	NT88-V3
倒置显微镜	尼康	TE2000-U	配备 4X、20X 物镜和激光系统。
激光	研究仪器	7-47-500	土星5号主动激光器
微分配器	德拉蒙德	3-000-105	使用微量移液器转移胚胎。也可使用10 μL移液枪，但应尽量减少上样体积。
100 x 15 mm 培养皿	Falcon	351029	使用培养皿的皿盖制作注射板，因为其壁较低，便于显微操作仪的定位和移动。也可使用60 mm培养皿的皿盖。
35 mm 培养皿	康宁	430165	这些培养皿用于在50中培养胚胎 μl 滴加矿物油覆盖的液滴。也可使用4孔培养皿。无论选择何种培养皿培养胚胎，均需在放入胚胎前于培养箱中至少平衡4小时。
培养箱	Sanyo	MCO-19AIC	任何可调节至38.5的培养箱 °C，5% CO2 可以使用这些条件。
体视显微镜	尼康	SMZ800	用于在培养液滴中及洗涤过程中观察胚胎。任何具有10倍放大功能的体视显微镜均可使用。
控制单元 HT	Minitube	12055/0400	体视显微镜连接的加热系统。
加热显微镜载物台	Minitube	12055/0003	体视显微镜连接的加热系统。
葡聚糖-红色	赛默飞世尔科技	D1828	使用无菌的10 mg/ml溶液进行注射。
矿物油	sigma	M8410	将矿物油置于室温下保存  使用铝箔纸避光保护。
KSOMaa 进化型牛胚胎培养液	泽尼特	ZEBV-100	添加4 mg/ml BSA。用于胚胎培养的KSOM培养板在使用前应于培养箱中平衡至少4小时。
FBS	Gemini-Bio	100-525	使用经干细胞验证的胎牛血清（FBS）。
受精卵			受精卵在受精后17-20小时进行显微注射，可进行后续操作 体外- 或 体内-衍生的
NaCl	Sigma	S5886	终浓度：107.7 mM。SOF-HEPES 培养基的组分。
KCl	Sigma	P5405	终浓度：7.16 mM。SOF-HEPES 培养基的组分。
KH2PO4	Sigma	P5655	终浓度：1.19 mM。SOF-HEPES 培养基的组分。
MgCl₂2 6H2O	Sigma	M2393	终浓度：0.49 mM。SOF-HEPES 培养基的组分。
Sodium DL-lactate	Sigma	L4263	终浓度：5.3 mM。SOF-HEPES 培养基的组分。
CaCl2-2H2O	Sigma	C7902	终浓度：1.71 mM。SOF-HEPES 培养基的组分。
D-(−)-果糖	Sigma	F3510	终浓度：0.5 mM。SOF-HEPES 培养基的组分。
HEPES	Sigma	H4034	终浓度：21 mM。SOF-HEPES 培养基的组分。
MEM-NEAA	Sigma	M7145	终浓度：1×。SOF-HEPES 培养基的组分。
BME-EAA	Sigma	B6766	终浓度：1×。SOF-HEPES 培养基的组分。
NaHCO₃3	Sigma	S5761	终浓度：4 mM。SOF-HEPES 培养基的组分。
丙酮酸钠	Sigma	P4562	终浓度：0.33 mM。SOF-HEPES 培养基的组分。
Glutamax	Gibco	35050	终浓度：1 mM。SOF-HEPES 培养基的组分。
BSA	Sigma	A-3311	终浓度：1 mg/ml。SOF-HEPES 培养基的组分。
庆大霉素	Sigma	G-1397	终浓度：5 μg/ml。SOF-HEPES 培养基的组分。
胚胎移植用水	Sigma	W1503	SOF-HEPES 培养基组分
SOF-HEPES 培养基	在实验室中制备		pH 7.3 - 7.4，280 ± 10 mOs。经22 μm 滤膜可于 4 ℃ 冰箱中保存 °C 下保存 1 个月。在 37 °使用前将水浴锅预热至 C。