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方法文章

家畜受精卵的激光辅助胞质内显微注射

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DOI：

10.3791/54465

⸱

2016年10月5日

 ,  , 
1Department of Animal Science, University of California, Davis

本文内容

摘要

本方案展示了如何在农场动物的受精卵中进行细胞质显微注射。该技术可用于将任何溶液注入单细胞胚胎中，例如基因组编辑工具，以生成基因敲除动物。

摘要

细胞质显微注射到单细胞胚胎中是一种非常强大的技术。例如，该技术可用于递送基因组编辑工具，从而产生可在成体生物每个细胞中都存在的遗传修饰。它还可用于递送siRNA、mRNA或阻断性抗体，以研究植入前胚胎中的基因功能。在啮齿类动物中常用的胚胎显微注射传统技术，是使用一根极细的微吸管直接穿刺进入胚胎的质膜。然而，当该技术应用于家畜动物时，通常效率较低。这主要是因为与小鼠和大鼠不同，牛、羊和猪的受精卵具有非常深色的细胞质以及高度弹性的质膜，使得注射过程中难以观察和穿透质膜。在本方案中，我们描述了一种适用于将溶液递送至牛受精卵细胞质的显微注射方法，该方法已被证明对绵羊和猪的胚胎同样有效。首先，使用激光在透明带中打孔；然后将一根钝端玻璃微吸管通过该孔插入，并推进至吸管尖端进入胚胎约3/4深度的位置；接着通过将细胞质内容物吸入吸管内来破裂质膜；最后，将吸入的细胞质内容物连同目标溶液重新注射回胚胎的细胞质中。该方案已成功用于向牛和羊的受精卵递送多种溶液，效率达到100%，细胞裂解极少，并能维持正常的囊胚发育率。

引言

对单细胞胚胎进行胞质显微注射是一种非常强大的技术。该技术可用于向胚胎内递送任何溶液，例如，通过基因敲除来研究基因功能，或创制基因编辑动物。大多数与农业相关的家畜受精卵含有较高的脂肪酸成分，导致其胞质不透明且颜色较深1。此外，它们的质膜（PM）具有较强的弹性。这些特性使得在啮齿类动物中常用的原核/胞质显微注射方法在这些物种中的应用变得困难且常常不够准确。

与原核显微注射相比，胞质内显微注射具有优势，因其操作更为简便，且对注射胚胎造成的损伤更小，从而获得更高的存活率2。本实验方案的总体目标是展示一种成功将溶液递送至家畜受精卵胞质内的方法。为了在家畜胚胎上高效地进行胞质内显微注射，首先使用激光在透明带（ZP）上打孔，然后利用钝端玻璃针进行显微注射。该策略旨在减少注射过程中对胚胎造成的机械损伤。随后，通过注射针吸出少量胞质内容物，可有效且可靠地破坏质膜（PM），确保溶液被准确递送至胚胎的胞质内。

该技术已成功应用于牛胚胎，将siRNA递送至合子胞质3,4，并利用成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）系统产生突变5。该方法经过少量修改后，也可适用于牛冠丘细胞包被的卵母细胞注射6。本文中，我们描述了使用染料进行注射的操作方案，该方案可适用于将任何所需溶液注入合子，并证明该技术引起的细胞裂解极少，且不影响早期胚胎发育。

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方案

1. 微量移液器的制备

  1. 注射微移液管
    1. 将一根硼硅酸盐玻璃毛细管（外径（OD）：1.0 mm，内径（ID）：0.75 mm）放入微移液管拉制仪中（置于左右毛细管夹持器的中央位置），并锁紧。
    2. 使用合适的程序拉制玻璃毛细管，使其形成具有长锥形的细尖端。（示例参数：加热温度：825；拉力：30；速度：120；时间：200；压力：500）。
    3. 小心地将拉制好的移液管从仪器中取出，并水平放置于微加工仪（microforge）上。
    4. 调节显微镜焦距，使拉制好的移液管与微加工仪加热丝及其玻璃珠清晰成像。使用目镜测微尺测量所需厚度，并水平移动移液管，直至加热丝处的移液管内径达到目标值（5 µm）。
    5. 将加热温度调节至约45%，轻轻下移移液管使其接触加热丝，短暂启动加热器。这会使移液管轻微熔化并粘附于加热丝上，冷却后在接触点处断裂，从而形成平直切口。
      注意：此步骤中设定合适的温度至关重要，温度过高会导致移液管弯曲，无法获得平直切口；温度过低则不足以熔化玻璃（图1A）。
    6. 将移液管尖端附近位置移至距离加热丝约10 µm处，形成约30°的倾斜角。将温度设为60%，启动加热器。
      注意：这会使移液管在加热丝上方弯曲。该角度的设计目的是确保当移液管安装至显微注射装置时，其针尖与注射板表面平行（图1B）。
    7. 操作显微注射移液管时需格外小心，因其极为尖锐且易碎。
  2. 持卵微移液管
    1. 将一根硼硅酸盐玻璃毛细管（外径（OD）：1.0 mm，内径（ID）：0.75 mm）放入微移液管拉制仪中（置于左右毛细管夹持器的中央位置），并锁紧。
    2. 使用合适的程序拉制玻璃毛细管，使其形成具有长而均匀锥度且管壁平行的细尖端（示例参数：加热温度：815；拉力：20；速度：140；时间：175；压力：200）。
    3. 小心地将拉制好的移液管从拉制仪中取出，并水平放置于微加工仪的支架上。调节焦距，使加热丝与移液管清晰成像。
    4. 使用目镜测微尺测量移液管直径，并移动移液管，使其在加热丝上方的直径达到180 µm。
    5. 在达到指定尺寸的位置，用金刚石笔在玻璃毛细管上做标记，然后轻轻按压拉制出的尖端以折断玻璃，应获得一个平直切口（图1C）。
    6. 将移液管调整为垂直位置，使其尖端靠近加热丝。将微加工仪的加热温度设为60%。
    7. 采用标准技术对移液管尖端进行火焰抛光7，直至其内径达到40 µm。使用目镜测微尺检查内径（图1D）。
    8. 在移液管上制作一个弯角。
      1. 将移液管重新移回水平位置，使其距离加热丝约10 µm，距离其尖端约5 mm。将温度设为约60%，启动加热器，使移液管在加热丝上方弯曲。持续加热直至达到所需角度（约30o），通过视觉检查角度（图1E）。
        注意：移液管通常以相对于注射皿底部约60o的角度安装在显微注射装置上。通过弯曲其尖端使其与皿底平行，这对于在胚胎中段平面进行正确注射是必要的。

2. 显微操作仪设置

  1. 检查显微注射器是否已完全充满油，并确认系统中无气泡（注射器内的气泡会影响注射的精细控制）。
  2. 检查显微操作器是否处于中心位置，以便移液管具有较大的移动范围。
  3. 将持卵移液管插入左侧显微操作器的夹持装置中，将注射移液管插入右侧显微操作器的夹持装置中。
  4. 通过毛细作用使油进入移液管，并使用显微注射器的控制装置上下移动管内油滴，以检查系统是否正常工作。
    注意：若针管内油滴无移动，可能存在堵塞。此时应更换新的移液管。
  5. 使用显微操作器的控制装置将移液管移至显微镜视野中心。在4倍放大倍数下，检查微移液管尖端的角度是否正确（与培养皿底部平行）。
    注意：移液管的正确设置是成功注射和结果一致性的关键。
  6. 按照制造商提供的校准手册对激光系统进行校准。

3. 注射皿的制备（图2）

  1. 在100 mm培养皿盖中央放置一滴50 µl预热（37 °C）的SOF-HEPES（成分详见材料部分），并添加20%胎牛血清（FBS）。在注射液滴附近放置一滴1–2 µl待注射溶液。确保胚胎温度不低于室温。
    注意：本实验方案中，将在注射溶液中加入Dextran-Red染料，以便可视化注射位点并进行后续追踪。
  2. 用约10 ml矿物油覆盖注射板中的液滴。
  3. 将注射用培养皿置于倒置显微镜载物台上，将移液针插入注射液滴中。检查针尖是否在液滴内处于焦点位置，并使用显微操作仪调节其高度至合适位置。
  4. 使用微量移液器将约20–30个受精卵（受精后17–20小时，hpf）加载至注射液滴的上部区域。在室温下进行注射，因此注射液滴中胚胎的数量取决于操作者注射速度。加载的胚胎数量不应超过30分钟内可完成注射的数量。
    1. 将胚胎装入微量移液器时，先将推杆完全压下，然后将吸头浸入含有胚胎的溶液中。用玻璃毛细管尖端依次接触需拾取的胚胎，缓慢释放推杆，使每个胚胎进入毛细管内。重复此操作，直至所有目标胚胎均被拾取或微量移液器达到容量上限。
    2. 释放已加载胚胎时，轻压推杆，直至含胚胎的全部液体从毛细管中排出。

4. 显微注射

  1. 使用 4X 物镜，通过施加负压（吸取）将待注射溶液吸入注射毛细管中。吸入足够注射 2 - 3 个受精卵的溶液量，然后移至注射液滴中。
  2. 在注射液滴内，移动固定毛细管，使其尖端靠近一个受精卵。使用固定微注射仪施加负压（吸取），使受精卵固定在固定毛细管上，随后切换至 20X 物镜。
  3. 一旦受精卵附着在固定毛细管上，使用注射毛细管轻轻拨动胚胎以检查其质量，注意不要使其脱落。高质量的受精卵应具有两个极体（尽管有时仅可见一个）且胞质均匀。不要对异常受精卵进行注射（图 3A）。
  4. 如有必要，重新调整胚胎位置以获得合适的注射位点。理想的位置应使透明带（ZP）与质膜（PM）之间留有一定空间，以避免激光损伤质膜。
  5. 通过轻轻触碰注射部位来确认注射毛细管是否位于胚胎的中平面上。若未对准中平面，针头容易导致胚胎旋转而非刺入。根据需要调整注射毛细管的高度。
  6. 使用激光在透明带（ZP）上打孔（图 3B）。
    1. 利用激光软件将激光十字线定位在透明带上拟打孔的位置（位于受精卵与固定毛细管连接处的对侧）。在激光控制窗口中点击“发射”按钮。确保孔的尺寸足够大，以便针头顺利穿过透明带而不损伤质膜（示例：0.662 毫秒脉冲宽度 / 6.9 µm 孔径）。
  7. 将注射针穿过透明带上的孔并接触质膜（PM）。继续向前推进毛细管，直至针头进入胚胎约 ¾ 深度（图 3C）。
  8. 观察溶液与油相界面处弯月面的位置，该位置将用于一致地控制注射体积。
  9. 对注射毛细管施加负压（吸取），使质膜和胞质被吸入注射针内。持续操作直至胞质进入针内的速度加快，或观察到胞质内容物与注射溶液混合，这表明质膜已破裂（图 3D）。
  10. 通过施加正压（注射），将胞质内容物连同注射溶液推回受精卵的胞质中，直至溶液-油相界面的弯月面较起始位置前进约一个受精卵直径的距离。
    注意：在我们的实验条件下，这相当于大约注入 7 pl 溶液（图 3E）。
  11. 切换回 4X 物镜，将已注射的胚胎移至注射液滴的下方区域。通过向固定微注射仪施加正压释放胚胎。将未注射的胚胎保留在液滴上部，已注射的胚胎置于下部，以便区分并高效操作。

5. 胚胎回收与注射结果

  1. 在新的培养皿中用预热的SOF-HEPES制备3滴，每滴约200 µl。使用微量移液器（如上所述）收集已注射的胚胎。通过将注射后的胚胎依次移入这3滴SOF-HEPES中进行洗涤。
  2. 计数显微注射过程中裂解的胚胎，并将其弃去。
    注意：裂解的受精卵与完整受精卵容易区分，前者呈半透明状，充满整个透明带（ZP），且通常有胞质内容物泄漏到胚胎外部。
  3. 可选步骤：使用荧光显微镜检测显微注射效率。注意，紫外光照射可能对胚胎造成损伤，从而影响其后续发育。
  4. 将25枚注射后的胚胎作为一组，置于含4 mg/ml牛血清白蛋白（BSA）的50 µl钾Simplex优化培养基（KSOM）液滴中，在矿物油下，于38.5 °C、5% CO2的空气环境及饱和湿度条件下进行培养。
  5. 注射后两天，在培养基中补充5%胎牛血清（FBS）。
  6. 注射后第7天检查囊胚（BL）形成率。囊胚率按以下公式计算：囊胚总数 / 该液滴中培养的胚胎总数。

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结果

激光辅助胞质显微注射是一种将溶液递送至家畜受精卵胞质中的高效且可靠的技术。 图3 展示了受精卵在注射前后的总体形态以及该技术的整体操作流程。实验中使用右旋糖酐-红色溶液作为注射物，以便追踪注射位点，并评估注射的效率与准确性。 图4 展示了成功递送溶液的示例，图中为一枚近期完成注射的胚胎，染料在胞质中均匀分布。采用该技术可实现100%的胚胎胞质注射成功率。

本方案在牛和羊的受精卵中表现出极低的裂解率。显微注射后，牛和羊的注射胚胎裂解率分别为15.6 ± 5%和5.8 ± 3.9%(图5)。此外，如图6所示，无论是牛胚胎（对照组32.8 ± 6.6%，注射组31.4 ± 5.9%）还是羊胚胎（对照组40.3 ± 7.8%，注射组30.3 ± 6.0%），对照组与注射组之间的囊胚发育率均无统计学显著差异。

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讨论

原核期卵母细胞显微注射是一种将溶液导入哺乳动物胚胎的成熟技术。根据物种和实验目的的不同，该技术在具体操作上略有差异，但总体上具有广泛适用性。本文展示了如何利用激光辅助钝端微吸管进入细胞质进行胞质内显微注射。一些家畜物种（如牛、羊和猪）的受精卵具有较深色的细胞质，导致显微注射针进入胚胎后难以观察。此外，其细胞膜弹性较强，使用斜面尖针（通常用于啮齿类动物受精卵注射）穿透膜结构较为困难。为克服这些限制，我们采用激光在透明带打孔，使钝端针顺利通过，并通过回吸细胞质内容物，确保细胞膜破裂，从而使溶液释放至胚胎细胞质内。此外，通过在针头进入位置的对侧（约深入胚胎内部3/4处）进行注射，旨在避开原核（PN），避免其被吸入或直接受到注射影响。同时，这种方法可增加膜破裂处的闭合接触点，从而降低细胞裂解率。

制备良好的微移液管（特别是注射用移液管）并将其正确安装到显微操作仪上，是获得该技术良好结果的关键。只要注射液在针内流动顺畅，注射针便可继续使用。有时细胞质内容物甚至原核内容物会堵塞针尖，导致液体流动不均，增加注射难度（这也会提高裂解率并延长...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本技术相关工作由美国国立卫生研究院/儿童健康与人类发展研究所（NIH/NICHD）RO1 HD070044项目以及美国农业部/国家食品与农业研究所（USDA/NIFA）哈奇计划W-3171和W-2112项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
微移液管拉制仪Sutter InstrumentP-97
玻璃毛细管Sutter 仪器B100-75-10这些毛细管用于制作持卵和注射移液管。可使用任何不含纤维丝的厚壁/标准壁硼硅酸盐玻璃管。
显微操作仪NarishigeMF-9配备10倍放大镜头。
显微操作仪尼康/成茂NT88-V3
倒置显微镜尼康TE2000-U配备 4X、20X 物镜和激光系统。
激光研究仪器7-47-500土星5号主动激光器
微分配器德拉蒙德3-000-105使用微量移液器转移胚胎。也可使用10 μL移液枪，但应尽量减少上样体积。
100 x 15 mm 培养皿Falcon351029使用培养皿的皿盖制作注射板，因为其壁较低，便于显微操作仪的定位和移动。也可使用60 mm培养皿的皿盖。
35 mm 培养皿康宁430165这些培养皿用于在50中培养胚胎 μl 滴加矿物油覆盖的液滴。也可使用4孔培养皿。无论选择何种培养皿培养胚胎，均需在放入胚胎前于培养箱中至少平衡4小时。
培养箱SanyoMCO-19AIC任何可调节至38.5的培养箱 °C，5% CO2 可以使用这些条件。
体视显微镜尼康SMZ800用于在培养液滴中及洗涤过程中观察胚胎。任何具有10倍放大功能的体视显微镜均可使用。
控制单元 HTMinitube12055/0400体视显微镜连接的加热系统。
加热显微镜载物台Minitube12055/0003体视显微镜连接的加热系统。
葡聚糖-红色赛默飞世尔科技D1828使用无菌的10 mg/ml溶液进行注射。
矿物油sigmaM8410将矿物油置于室温下保存  使用铝箔纸避光保护。
KSOMaa 进化型牛胚胎培养液泽尼特ZEBV-100添加4 mg/ml BSA。用于胚胎培养的KSOM培养板在使用前应于培养箱中平衡至少4小时。
FBSGemini-Bio100-525使用经干细胞验证的胎牛血清（FBS）。
受精卵受精卵在受精后17-20小时进行显微注射，可进行后续操作 体外- 或 体内-衍生的
NaClSigmaS5886终浓度：107.7 mM。SOF-HEPES 培养基的组分。
KClSigmaP5405终浓度：7.16 mM。SOF-HEPES 培养基的组分。
KH2PO4SigmaP5655终浓度：1.19 mM。SOF-HEPES 培养基的组分。
MgCl₂2 6H2OSigmaM2393终浓度：0.49 mM。SOF-HEPES 培养基的组分。
Sodium DL-lactateSigmaL4263终浓度：5.3 mM。SOF-HEPES 培养基的组分。
CaCl2-2H2O SigmaC7902终浓度：1.71 mM。SOF-HEPES 培养基的组分。
D-(−)-果糖 SigmaF3510终浓度：0.5 mM。SOF-HEPES 培养基的组分。
HEPES SigmaH4034终浓度：21 mM。SOF-HEPES 培养基的组分。
MEM-NEAASigmaM7145终浓度：1×。SOF-HEPES 培养基的组分。
BME-EAASigmaB6766终浓度：1×。SOF-HEPES 培养基的组分。
NaHCO₃3SigmaS5761终浓度：4 mM。SOF-HEPES 培养基的组分。
丙酮酸钠SigmaP4562终浓度：0.33 mM。SOF-HEPES 培养基的组分。
GlutamaxGibco35050终浓度：1 mM。SOF-HEPES 培养基的组分。
BSASigmaA-3311终浓度：1 mg/ml。SOF-HEPES 培养基的组分。
庆大霉素SigmaG-1397终浓度：5 μg/ml。SOF-HEPES 培养基的组分。
胚胎移植用水SigmaW1503SOF-HEPES 培养基组分
SOF-HEPES 培养基在实验室中制备pH 7.3 - 7.4，280 ± 10 mOs。经22 μm 滤膜可于 4 ℃ 冰箱中保存 °C 下保存 1 个月。在 37 °使用前将水浴锅预热至 C。

参考文献

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