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Summary

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Abstract

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

Introduction

1 – 细胞胚胎显微注射细胞质是一个非常强大的技术。它可用于递送任何溶液进入胚胎，例如，产生基因敲除研究基因功能或产生基因编辑动物。农业最相关的农场动物受精卵具有非常高的脂肪酸组合物，使得它们的细胞质不透明和暗^1。他们也有相当的弹性质膜（PM）。这些特点使显微注射用常规的原核/胞浆注射在啮齿类动物具有挑战性，往往不准确使用。

细胞质微注射有超过原核显微注射法的优点，因为它是更容易执行并且也导致了注射的胚胎损伤小，导致更高的²生存能力。此协议的总体目标是演示提供解决方案到农场动物受精卵的细胞质一种成功的方法。到能够执行对家畜胚胎效率高细胞质微注射，激光被用来产生在透明带（ZP），然后一个钝端部玻璃针用于显微注射的孔。这一战略旨在减少注射时印在胚胎的机械损伤。然后，注射针内胞质内容抽吸允许PM的效率和自信破损确保溶液被输送到胚胎的细胞质中。

这种技术已在牛胚胎被成功地用于siRNA递送到合子的细胞质^3,4和生成使用群集定期相互间隔短回文重复序列（CRISPR）/ CRISPR相关联的系统9（Cas9）系统⁵的突变。它也适合（稍加修改）注入牛卵丘封闭的卵母细胞^6。这里，我们描述我们的注射方案提供的染料，这可以是适用于注射任何宫IRED溶液注入受精卵，并表明，使用这种技术使得最小裂解并且不影响早期胚胎发育。

Protocol

1，微管生产注射微量放置一个硼硅玻璃毛细管（外径（OD）：1.0毫米，内径（ID）0.75毫米）的一个微量拉马（在右侧和左侧毛细管持有者的中心）并锁定。 使用适当的程序来拉玻璃毛细管，因此导致了薄带尖长攻丝机。 （例如：热量：825;拉：30;速度：120;时间：200;压力：500）。 小心地从设备中取出拉移液器，将它放在一个microforge在水平位置。 带上拉吸管和其玻璃珠成焦点microforge加热器丝。使用目镜标线片以测量所需的厚度和水平移动吸移管，直到加热器灯丝达到目标内径（5微米）。 调整热至约45％，轻轻地使吸管向下使其接触灯丝。简要地激活加热器。该W病略微熔融吸移管，因此粘附于灯丝并在冷却，移液器将在接触点产生的直切断裂。 注意：设置适当的温度是在该步骤中的关键，因为温度太高会使吸管弯曲，因此直切是不可能的，温度太低会不足以熔化移液器（ 图1A）。 通过从加热器灯丝定位它约10μm距离使吸管尖端附近的近似30°角。设定温度至60％，并激活加热器。 注意：这将弯曲吸管过灯丝。这个角度是所希望的，以便当安装到喷射器（ 图1B）的针的尖端平行于注入板的表面上。 手柄显微注射移液器要小心，因为他们都非常尖锐和脆弱。 保持微量放置borosilic吃玻璃毛细管（外径：1.0mm时，ID：0.75mm）组合在一个微量拉马（在右侧和左侧毛细管持有者的中心）并锁定。 使用适当的程序来拉玻璃毛细管，因此导致了薄尖的长锥，甚至和并行墙（例如：热量：815;拉：20;速度：140;时间：175;压力：200）。 小心地从牵引装置取出拉出吸管，并将其放置在microforge夹持在水平位置。调整焦距加热器灯丝和吸管。 使用目镜标线片来测量移液管的直径和，直到它的直径比灯丝达到180微米移动吸移管。 在指定大小，标示用金刚石尖笔的玻璃毛细管，然后轻轻按上拉尖打碎玻璃。这将导致直切（ 图1C）。 移动吸管，其尖端靠近灯丝垂直位置。设置温度的microforge至60％。 火抛光使用标准技术7直到达到40微米的ID的吸管尖。使用目镜标线检查ID（ 图1D）。 使对吸移管的角度。 使吸管回到水平位置约10微米，从灯丝5毫米从其前端远程。设定温度至约60％，并激活加热器弯腰灯丝吸管。直到达到（约30°）所需的角度继续加热。检查视觉角度（ 图1E）。 注意：移液器通常被安装到微量在60°相对于该注射盘底部的近似角度。吸移管的前端弯曲，以便其平行于盘，这是必要的在其中间平面上的正确的注射的胚胎的底部。 乐“> 2。安装微操作手检查microinjectors满载油和有在系统中没有气泡（在微量气泡防止喷射的精细控制）。 检查显微处于中心位置。这将允许广泛的吸移管的移动。 插入保持吸管进入左显微保持器和注射针进入右显微操作支架。 允许通过油毛细现象进入移液器和检查系统通过使用微量控制吸管内上下移动油正常工作。 注意：如果在针内没有油的运动，有可能是一个障碍。在这种情况下，使用一个新的针。 使用显微控制以使移液管进入视显微镜的场的中心。使用放大4倍，检查微量提示是在正确的角度（Parallel到培养皿的底部）。 注：针的正确的设置是一个成功的注入和结果一致性的关键。 校准按照制造商的校准手册的激光系统。 3.注射液盘的制备（图2） 放置温热（37℃）SOF-HEPES补充有20％胎牛血清（FBS）的上100毫米培养皿的盖的中心（在材料部分详述组合物）的50微升的下降。放置1 – 将溶液的2微升滴被注入靠近喷射滴。确保胚胎不冷静下来RT以下。 注意：在这个协议中，我们将在葡聚糖红色染料加入到注入溶液，以便能够直观注射部位和以后跟踪。 覆盖使用大约10mL，矿物油中的喷射板的液滴。 广场上的倒置显微镜阶段注射的菜，并把点子ettes到注射降。检查针是处于焦点的下降中。如使用显微控制需要调整高度。 在喷射液滴的上侧 – （20小时后的受精（HPF）17） – 用一个微型分配器，装入约20 30受精卵。因此在注射滴胚的数目由在该人可以注入其中的速度决定于室温下进行注射。别比能够在30分钟内被注入的那些加载更多的胚胎。 要加载的胚胎成微型分配器，完全踩下柱塞和沉浸的尖端插入含有胚胎的解决方案。触摸胚胎被拾起与玻璃毛细管的尖端（一个在时间）和缓慢释放所述柱塞，以便每个胚进入毛细管。重复该步骤直至所有的胚胎都拿起或微型分配器容量已满。 以释放加载的胚胎，轻轻压下柱塞，直到整个体积共ntaining胚胎从毛细管释放。 4.显微注射使用4X物镜，加载溶液通过施加负压（吸气）被注入到注射针。装载足够的解决方案注入2 – 3受精卵。然后移动到注射降。 在注射下降，移动控股吸管使尖端获得接近合子。与保持微量施加负压（抽吸），以使受精卵被固定到保持吸管和变化到20X物镜。 一旦合子附着到保持吸管，用注射吸管轻轻来回移动胚胎不拆卸它检查其质量。良好的品质受精卵应该有两个极体（尽管有时只有一个是看到），并均匀细胞质中。不要注入受精卵异常（ 图3A）。 如果有必要，重新定位胚胎一个适当的注射位置。一个良好的定位将是在其中存在的ZP和PM之间的一些空间，所以在PM没有得到由激光损坏。 检查注射针是通过轻触注射部位的受精卵定位于胚胎的中面。如果不是在它的中平面，针将趋向于使胚胎旋转代替穿刺。根据需要进行调整的注射针的高度。 使用激光（ 图3B）中的ZP的孔。 使用激光的软件发生在那里的孔将作出（在相反侧，其中胚胎附着到保持吸管）的ZP激光掩模版。使用火按钮激光控制窗口中点击。确保该孔的尺寸足够大，以创建在ZP为所述针的开口以不损坏对PM穿过（实施例：0.662毫秒脉冲宽度/ 6.9微米孔大小）。 通过注射针通过在ZP的孔，使与PM的接触。继续推动吸管向前直到针是¾的方式进入胚胎（ 图3C）。 观察在溶液油相间的弯液面的位置，因为这将被用于一致地控制注射体积。 适用于注射针，这将导致在PM和细胞质被吸入注射针负压（抽吸）。继续直到细胞质的移动进针加速或当细胞质内容与注射溶液混合起来可看出。这些将指示在PM（ 图3D）的破损。 注入回胞质内容随后将溶液放入合子通过施加正压力（注入）细胞质中，直到在溶液油相间的弯液面已经前进一个受精卵的直径相当于过去的起点。 注意：在我们的条件下，这种repre货物内大约7注射液（ 图3E）的复数。 变化到4X物镜并移动所注入的胚胎/ s到喷射滴的下侧。通过对控股微量施加正压力释放胚胎。保持在上侧的未注射的胚胎和下降的下侧注入的那些，以帮助跟踪注入/未注射的胚胎和有效地工作。 5.胚胎恢复和注射结果建立一个新的菜预热SOF-HEPES约200微升3滴。收集用微型分配器（如上所述）的注射的胚胎。通过3 SOF-HEPES移动它们洗净滴注入胚胎。 伯爵在注射溶解胚胎并丢弃它们。 注：因为第一个出现半透明，填写整个ZP裂解的受精卵可以从一个完整一是容易区分，它通常具有细胞质内容泄漏到胚胎的外部。 或者，用荧光显微镜检查显微注射效率。要知道，紫外线照射可诱发胚胎损害，可能会影响后续发展。 在补充有4毫克/ ml牛血清白蛋白（BSA）根据矿物油钾单纯优化介质的50微升液滴（KSOM）25注射的胚胎的培养基在38.5℃，5％CO 2的空气中，并且湿度饱和。 补充有5％FBS培养基中注射后两天。 检查囊胚（BL）率注射后7天。计算BL速率胚泡胚胎/在于滴培养的胚胎的总数的总数量。

Representative Results

激光辅助显微注射细胞质是一个强大而可靠的协议，以提供解决方案为牲畜受精卵的细胞质中。 图3显示了受精卵的大致轮廓之前和注射，以及该技术的整体轮廓之后。葡聚糖红被用作注射溶液，以允许注入和注入效率和准确度的跟踪点。溶液的成功递送在图4中示出表示最近注入胚胎，其中染料被均匀地分布在细胞质中。使用这种技术的胚胎的100…

Discussion

受精卵显微注射是引入解决方案集成到哺乳动物胚胎一套行之有效的方法。与一些依赖于物种和实验的目的变化，这种技术可以广泛地使用。我们展示了如何使用激光来帮助一个钝头微量的入口处进行显微注射胞浆内。某些牲畜物种（如牛，羊，和猪）的合子有黑暗的细胞质中，阻碍注射针的可视化一次胚胎内。此外，他们的血浆膜是非常有弹性的，使得与一个斜面尖刺针（通常用于注入啮齿动?…

Materials

Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Glass capillary	Sutter instruments	B100-75-10	These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.
Microforge	Narishige	MF-9	Equipped with 10X magnification lense.
Micromanipulator	Nikon/ Narishige	NT88-V3
Inverted microscope	Nikon	TE2000-U	Equipped with 4x, 20x lenses and with a laser system.
Laser	Research Instruments	7-47-500	Saturn 5 Active laser.
Microdispenser	Drummond	3-000-105	The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.
60mm culture dish	Corning	430166	Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micropipettes with the micromanipulator easier.
35mm culture dish	Corning	430165	These dishes are used for culturing the embryos in 50μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hours prior to transfering the embryos to them.
Incubator	Sanyo	MCO-19AIC	Any incubator that can be set to 38.5°C 5% CO2 conditions can be used.
Stereomicroscope	Nikon	SMZ800	Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10x magnification can be used.
Control Unit HT	Minitube	12055/0400	Heating system attached to the stereomicroscope.
Heated Microscope Stage	Minitube	12055/0003	Heating system attached to the stereomicroscope.
Dextran-Red	Thermo Scientific	D1828	A sterile 10mg/ml solution is used to inject.
Mineral Oil	sigma	M8410	Keep the mineral oil at room temperature and  protected from light using foil paper.
KSOMaa Evolve Bovine	Zenit	ZEBV-100	Supplemented with 4mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hours before use.
FBS	Gemini-Bio	100-525	Use a stem-cell qualified FBS.
Zygotes			Zygotes are injected 17-20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived.
NaCl	Sigma	S5886	Final concentration: 107.7mM. Component of SOF-HEPES medium.
KCl	Sigma	P5405	Final concentration: 7.16mM. Component of SOF-HEPES medium.
KH2PO4	Sigma	P5655	Final concentration: 1.19mM. Component of SOF-HEPES medium.
MgCL2 6H2O	Sigma	M2393	Final concentration: 0.49mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium DL-lactate	Sigma	L4263	Final concentration: 5.3mM. Component of SOF-HEPES medium.
CaCl2-2H2O	Sigma	C7902	Final concentration: 1.71mM. Component of SOF-HEPES medium.
D-(−)-Fructose	Sigma	F3510	Final concentration: 0.5mM. Component of SOF-HEPES medium.
HEPES	Sigma	H4034	Final concentration: 21mM. Component of SOF-HEPES medium.
MEM-NEAA	Sigma	M7145	Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium.
BME-EAA	Sigma	B6766	Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium.
NaHCO3	Sigma	S5761	Final concentration: 4mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium pyruvate	Sigma	P4562	Final concentration: 0.33mM. Component of SOF-HEPES medium.
Glutamax	Gibco	35050	Final concentration: 1mM. Component of SOF-HEPES medium.
BSA	Sigma	A-3311	Final concentration: 1mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Gentamicin	Sigma	G-1397	Final concentration: 5μg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Water for embryo transfer	Sigma	W1503	Component of SOF-HEPES medium.
SOF-HEPES medium	Made in the lab		pH 7.3-7.4, 280±10 mOs. Filter sterilized through a 22μm filter can be stored in the fridge at 4° C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use.