矿化组织的高通量多图像冷冻组织学

摘要

在本论文中，我们介绍了一种高通量、半自动化的冷冻组织学平台，该平台能够对矿化组织冷冻切片进行多轮荧光成像，并生成多种反应指标的配准复合图像。

摘要

目前，对多种组织进行高效表型分析和组织病理学研究的需求日益增长。这一需求在旨在敲除小鼠基因组中每一个基因的宏伟项目中尤为明显。科研界迫切需要一种快速且低成本的方法，通过组织学手段对组织进行表型分析。骨骼组织的组织学分析通常耗时较长，且最多只能达到半定量水平，往往需要经过培训的专业人员对切片进行主观判读。本文介绍一种用于矿化组织高效且低成本表型分析的冷冻组织学新范式。首先，我们提出一种基于胶带稳定的冷冻切片新技术，可有效保持矿化组织的形态结构。这些切片被牢固地贴附于玻璃载玻片上，可在多轮染色过程中反复成像。所得图像可通过人工或计算机软件进行对齐，生成包含多个层次信息的复合图像堆栈。该方案可实现多种分子信号在特定细胞内的共定位分析。此外，这些荧光信号还可通过计算机软件进行客观定量。本方案克服了传统矿化组织组织学分析中的诸多局限性，有望成为未来肌肉骨骼组织高通量、高内涵表型分析的通用平台。

引言

生物学研究通常需要高效的表型分析，而这往往涉及某种形式的组织学分析^1-3。随着雄心勃勃的小鼠基因组全基因敲除项目的发展，这一需求变得更加明显⁴。这些组织学分析的范围可从评估细胞形态和/或解剖特征，到将特定基因或蛋白质的表达定位至单个细胞。事实上，组织学对基因组学领域的一项基本贡献在于，能够将特定的分子信号与特定的组织区域或细胞类型相关联。

传统的组织学方法，尤其是针对肌肉骨骼组织的方法，通常耗时且繁琐，有时需要数周时间来完成样本的固定、脱钙、切片、染色和成像，随后还需通过人工判读对图像进行分析。若要分析多种分子信号，无论是通过免疫组织化学、原位杂交还是特殊染色，通常都需要制备多个切片，甚至多个样本才能恰当完成。此外，这些不同的信号反应无法在同一细胞中共定位，有时甚至无法在同一样本的特定区域内实现共定位。随着基因组学和表观基因组学领域迈入数字化时代，组织学领域也必须随之发展，以实现在单个组织切片中对多种分子信号进行高效、高通量且自动化的分析。

事实上，人们迫切需要改进组织学技术，以将多种分子信号与特定样本中的具体细胞关联起来。最近，我们发表了一种新的高通量冷冻组织学方法，可用于评估矿化组织切片内多个响应指标^5-14。该方法包括用冷冻胶带固定冷冻切片，将带胶带的切片牢固地粘附在显微镜载玻片上，并对每个切片进行多轮染色和成像。随后在图像分析之前....

方案

康涅狄格大学健康中心机构动物护理和使用委员会批准了所有动物实验操作。

1. 固定与包埋

1. 通过 CO₂ 窒息或其他经批准的方法处死动物。
2. 取下目标组织（例如，肢体、椎骨等），并置于 4 °C 的 10% 中性缓冲甲醛溶液中，直至充分固定。在固定前需特别注意保持一致的解剖位置。例如，固定肢体时应使关节保持一致的屈曲、内旋和外旋角度¹¹。通常，完整的小鼠肢体固定时间为 1 - 3 天。
   警告：甲醛具有毒性，操作时应在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。
   注意：固定时间取决于样本大小。若实验条件允许，切开骨组织有助于骨髓腔的充分固定。某些样本可能需要灌注固定¹⁵，以减少荧光背景（例如，骨髓内的微弱荧光信号）。
3. 将样本从甲醛溶液转移至用 1× PBS 配制的 30% 蔗糖溶液中，于 4 °C 孵育 12 - 24 小时。
   注意：孵育 12 - 24 小时后，可将样本置于 -80 °C 长期保存。此保存方法适用于研究人员计划将多个样本包埋于同一蜡块中，但无法同时获取所有样本的实验（例如，包含多个时间点的实验）。
4. 从蔗糖溶液中取出样本，并剔除多余组织。
5. 取一个冷冻模具（模具尺寸根据样本大小选择），部分填充冷冻包埋介质。将样本....

结果

高通量、多图像冷冻组织学的一般工作流程

图1 代表了该技术所采用的通用工作流程。该流程包括从固定到多轮成像，最终进行图像配准与分析的多个步骤。从样本固定到完成4轮成像，整个过程最短可耗时约一周，相比此类样本的脱钙所需时间更短。成像顺序通常首先采集标本中已有的内源性信号（例如，绿色荧光蛋白，矿化标记 等等。），然后进行多重荧光免疫染色，接着进行荧光酶活性检测（例如., TRAP, AP, 等等。）以及细胞周期分析实验（例如，EdU），最后以显色染色结束（例如甲苯胺蓝O，苏木精，番红O 等等。).

来自青少年踝关节的代表性示例

讨论

在此，我们介绍了一种详细的冷冻组织学实验方案，通过将单个组织切片上多轮染色/成像所获得的图像进行对齐，实现多种生物学指标的共定位与定量分析。本方案中采用的冷冻胶带技术尤为实用，因其可有效维持难以切片的组织的形态结构例如，矿化的骨和软骨）。此外，切片组织牢固地附着在玻璃载片上，可对同一组织切片进行多轮染色和成像；而传统方法则需使用连续切片，每张切片采用不同的染色方案。当需要在不同切片间进行信号共定位时，连续切片法可能会带来问题，而对同一张切片进行多轮染色和成像则可避免此类问题。

市场上首个采用胶带稳定的组织切片产品是一种胶带转移系统^{16, 17}。该系统使用涂有低温黏合剂的塑料胶带，将其贴附于组织冷冻块表面。当冷冻切片机刀片在胶带下方进行切割时，切片会完整地保留在胶带上并随之被转移。随后将胶带带有样本的一面朝下放置于涂有紫外光固化胶水的载玻片上，使组织牢固地附着于载玻片。待胶带从切片上剥离后，载玻片即可用于荧光或显色组织学检测。该黏合剂的背景荧光较低，大多数软组织均可耐受多轮染色与成像。然而，在处理矿化组织切片时，将组织从黏合胶带转移至玻璃载玻片.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 中性缓冲福尔马林	Sigma Aldrich	HT501128-4L	多个供应商可提供。有毒。可用 4% 多聚甲醛替代。
蔗糖	Sigma Aldrich	S9378	多个供应商可提供。
PBS	Sigma Aldrich	P5368	多个供应商可提供。
冷冻模具	Fisher Scientific	Fisherbrand #22-363-554	可根据组织选择不同尺寸
冷冻基质	Thermo Scientific	6769006	可用其他冷冻基质替代。然而，PVA/PEG 基树脂在我们实验中效果最佳。
2-甲基丁烷	Sigma Aldrich	M32631	多个供应商可提供。
冷冻切片机	Leica Biosystems	3050s	可用其他品牌/型号替代。
样本盘	Leica Biosystems	14037008587	可用其他品牌/型号替代。
冷冻切片机刀片	Thermo Scientific	3051835	可用其他品牌/型号替代。
冷冻胶带	Section Lab	Cryofilm 2C
滚轮	Electron Microscopy Sciences	62800-46	可用其他品牌/型号替代。
塑料显微镜载玻片	Electron Microscopy Sciences	71890-01	可用其他品牌/型号替代。
玻璃显微镜载玻片	Thermo Scientific	3051	可用其他品牌/型号替代。
Norland 光学胶 61	Norland Optical	Norland Optical Adhesive, 61
紫外黑光灯	General Electric	F15T8-BLB
冰醋酸	Sigma Aldrich	ARK2183	多个供应商可提供。
壳聚糖	Sigma Aldrich	C3646	多个供应商可提供。
InSpeck 红色微球	ThermoFisher Scientific	I-14787
InSpeck 绿色微球	ThermoFisher Scientific	I-14785
钙黄绿素蓝	Sigma Aldrich	M1255	多个供应商可提供。
钙黄绿素	Sigma Aldrich	C0875	多个供应商可提供。
茜素络合酮	Sigma Aldrich	A3882	多个供应商可提供。
去甲金霉素	Sigma Aldrich	D6140	多个供应商可提供。
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761	多个供应商可提供。
甘油	Sigma Aldrich	G5516	多个供应商可提供。
ELF 97 黄色荧光酸性磷酸酶底物	ThermoFisher Scientific	E-6588
DAPI	ThermoFisher Scientific	62247	多个供应商可提供。可用 Hoechst 33342 或其他细胞核染料替代。
TO-PRO-3（Cy5 细胞核复染剂）	ThermoFisher Scientific	T3605
碘化丙啶	ThermoFisher Scientific	R37108	多个供应商可提供。
无水乙酸钠	Sigma Aldrich	S2889	多个供应商可提供。
酒石酸钠二碱二水合物	Sigma Aldrich	T6521	多个供应商可提供。
亚硝酸钠	Sigma Aldrich	S2252	多个供应商可提供。
Tris	Sigma Aldrich	15504	多个供应商可提供。
MgCl2 六水合物	Sigma Aldrich	M9272	多个供应商可提供。
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	多个供应商可提供。
快红 TR 盐	Sigma Aldrich	F8764	多个供应商可提供。也可用其他底物试剂盒替代，例如 Vector Blue（Vector Laboratories，货号 SK-5300）
萘酚 AS-MX	Sigma Aldrich	N4875	多个供应商可提供。
N,N-二甲基甲酰胺	Sigma Aldrich	D158550	多个供应商可提供。
甲苯胺蓝 O	Sigma Aldrich	T3260	多个供应商可提供。
Axio Scan.Z1	Carl Zeiss AG	Axio Scan.Z1	也可使用其他线性或拼接扫描仪。
DAPI 滤光片组	Chroma Technology Corp.	49000
CFP 滤光片组	Chroma Technology Corp.	49001
GFP 滤光片组	Chroma Technology Corp.	49020
YFP 滤光片组	Chroma Technology Corp.	49003
定制黄色（ELF 97）滤光片组	Chroma Technology Corp.	定制；HQ409sp，HQ555/30m，425dxcr
TRITC 滤光片组	Chroma Technology Corp.	49004
Cy5 滤光片组	Chroma Technology Corp.	49009
CryoJane 胶带转移系统	Electron Microscopy Sciences	62800-10	多个供应商可提供。
CryoJane 胶带窗口	Electron Microscopy Sciences	62800-72	多个供应商可提供。
CryoJane 黏附载玻片	Electron Microscopy Sciences	62800-4X	多个供应商可提供。