方法文章

融合绝对定量与相对定量PCR数据以定量STAT3剪接变异体转录本

16.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/54473

⸱

2016年10月9日

 ,  ,  , 
1Department of Biomolecular Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison

本文内容

摘要

串联剪接事件发生在相距不到12个核苷酸的位点之间。利用绝对定量PCR方法可以实现对这类剪接变异体比例的定量分析。本文描述了如何对STAT3基因的剪接变异体进行定量，该基因存在两个剪接事件，导致丝氨酸-701的包含或缺失以及α/β型C末端的产生。

摘要

人类信号转导及转录激活因子3（STAT3）是含有串联剪接位点的众多基因之一。相距3个核苷酸的两个可变剪接供体位点，导致丝氨酸-701单个残基的包含（S）或缺失（ΔS）。在其下游更远处，两个可变剪接受体位点的剪接产生两种转录本：一种编码转录激活域的55个末端残基（α），另一种则编码截短的转录激活域并含有7个独特残基（β）。如本文所述，利用绝对定量qPCR（定量聚合酶链式反应）可测定STAT3四种剪接转录本（Sα、Sβ、ΔSα和ΔSβ）的相对比例。因此，该实验方案能够区分并定量高度相似的剪接变异体。绝对qPCR采用校准质粒，从而在不牺牲检测特异性的前提下保证检测效率。该方案需要进行引物验证以及扩增循环参数的优化。结合使用绝对qPCR与依赖扩增效率的总STAT3转录本相对qPCR，可描述经细胞因子处理后的嗜酸性粒细胞中STAT3剪接变异体水平的动态变化。该方案还提供了证据，表明STAT3两个剪接事件之间存在共剪接的相互依赖性。基于这两种qPCR技术联合使用的策略，可轻易推广应用于其他串联剪接位点的共剪接研究。

引言

短程（串联）选择性剪接在哺乳动物1、无脊椎动物2和植物3中较为常见，其特征是可变剪接受体或供体位点彼此相邻。据估计，20%的哺乳动物基因含有相距2-12个核苷酸的选择性剪接位点4。其中许多位点相距3个核苷酸，导致单个密码子的包含或缺失。关于这些位点剪接调控机制尚存争议5,6：一些观点认为剪接基序差异极为细微，剪接选择具有随机性7，而另一些研究则基于组织特异性推断存在调控机制8。

串联剪接位点的选择已通过改良的毛细管电泳7和高分辨率凝胶电泳8进行了半定量分析。RNA-Seq（RNA测序）读段可用于量化每个剪接位点的剪接比例。通过这种方式，RNA-Seq数据加深了对串联剪接位点调控机制的理解9。同时，也实现了基于核苷酸基序预测预期的剪接变异体比例10。目前关于包含或排除单个密码子的剪接研究，主要集中在更常见的串联受体剪接位点，即NAGNAG（其中N代表任意核苷酸）。

包含或排除单个密码子的串联供体选择性剪接位点（识别基序为 GYNGYN，其中 Y = 嘧啶）比串联受体剪接位点更少见。信号转导及转录激活因子3（STAT3）是发生串联供体选择性剪接的关键基因1,11。该基因的串联供体剪接位点连接外显子21和22，导致丝氨酸-701密码子的包含或缺失（分别记为S或ΔS）1,11。下游存在两个相距40个核苷酸的选择性受体剪接位点，连接外显子22与23a/b，导致转录激活域的C末端包含两种不同形式：一种包含转录激活域的55个末端残基（α），另一种则为截短的转录激活域，含有7个独特的C末端残基（β）11。因此，可产生四种剪接变异体。

STAT3 蛋白是一种转录因子，在多种细胞类型中发挥重要的信号整合作用12，其突变导致的持续性激活与多种癌症表型相关（详见参考文献13）。Job综合征是一种以IgE水平显著升高为特征的免疫缺陷病，也由STAT3基因突变引起（详见参考文献14）。此前已有研究描述了STAT3 α和β两种剪接变体蛋白的不同功能15。最初认为STAT3 β以显性负性方式发挥作用16，拮抗STAT3 α的转录活性，但后续研究表明其可独立调控特定靶基因17。尽管两种变体仅在相邻区域发生剪接差异，但有理由相信丝氨酸-701（Ser701）的存在与否会影响其功能。Ser701不仅在空间位置上邻近酪氨酸-705（STAT3激活过程中发生磷酸化的位点18），而且最近一项研究提示，STAT3 S和ΔS剪接变体对于STAT3依赖型弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBLCL）细胞的存活均是必需的19。其生物学意义仍有待进一步探索。鉴于剪接变体的组成可能影响蛋白功能，我们致力于探究嗜酸性粒细胞在细胞因子刺激下，其剪接变体比例是否发生改变。

我们最初尝试通过使用特异性针对STAT3 α和β剪接变体的PCR方法，探索这两个剪接事件之间的关联，随后用特异性识别S剪接变体的限制性内切酶AfeI对扩增产物进行酶切。产物的密度测定结果表明，在STAT3 α和β中，Ser701的包含事件的发生频率大约是其缺失（ΔS）的十倍（数据未显示）。然而，这种半定量方法的重复性不足，且无法有效同时检测全部四种剪接变体。为了分析四种剪接变体各自的比例，有必要建立一种能够获得高度一致的技术重复（对同一样本进行多次检测）的定量PCR（qPCR）方案。

相对定量qPCR依赖于将目的基因与一个已知表达水平稳定的参照基因或看家基因进行比较20，适用于目的基因与看家基因扩增效率相近的情况。一种可结合双链（ds）DNA的荧光（氰基）染料能够与PCR扩增产物结合21，经过一定循环次数后，扩增产物达到足够量，荧光信号即可被检测到。初始转录本水平越高，阈值循环（Ct）值越低。由于cDNA样品的浓度存在差异，因此需要将目的转录本的浓度与在所有样品中表达水平恒定的转录本浓度进行比较，例如嗜酸性粒细胞中的葡萄糖醛酸酶-β（GUSB）22。

对于高度相似的序列，相对定量qPCR并不可行，例如由串联剪接产生的剪接变体。为特异性扩增这些剪接变体所需的严格条件会导致扩增效率降低。因此，必须采用绝对定量方法23。该方法需要使用已知浓度的目标剪接转录本构建标准曲线，并确保PCR条件能够优化特异性24。如前所述，针对特定基因的绝对定量与相对定量qPCR数据可结合使用，以深入理解该基因在特定细胞类型中的表达情况，例如在不同刺激条件下嗜酸性粒细胞中STAT3的表达25。

本文描述了STAT3剪接变体的定量方法，该方法有望被调整用于其他串联剪接事件的靶向研究。优化过程耗时较长，在数月时间内测试了多个不同浓度的引物对以及多种循环参数的组合。本方案的关键步骤包括引物特异性验证，以及基于已知浓度剪接变体标准曲线的定量分析。相对qPCR结合使用对本研究应用有所帮助，但并非必需。

方案

注意：外周血嗜酸性粒细胞的获取遵循威斯康星大学麦迪逊分校健康科学中心机构审查委员会批准的方案（编号：2013-1570），且未包含任何可识别供者信息。每份样本用于科研前均已获得供者的书面知情同意。

1. 创建质粒作为模板标准品

  1. 设计引物以扩增包含两者的片段 STAT3 剪接位点，5'- KpnI 和 NheI 限制性酶切位点（及5'端延伸）如 表 1a.
    注意： KpnI 和 NheI 选择位点以便将插入片段连接到带有卡那霉素抗性的修饰型pET-28a载体中25,26. KpnI 位点已被添加至多克隆位点。
  2. 使用新鲜捐献的嗜酸性粒细胞，制备 2.5 x 10⁶ 个细胞的重复样品6 细胞/ml，置于细胞培养基（RPMI 1640 培养基）中，在37℃、5% CO₂条件下孵育1小时。 37 °C 5% CO₂条件下2 和10%湿度。
    1. 从样品中制备互补DNA（cDNA）（至少1 x 106 根据制造商说明，使用RNA提取和cDNA合成试剂盒，每份制备样品处理相应数量的细胞。
  3. 从步骤1.2.1制备的模板cDNA中扩增 STAT3 使用扩增PCR检测剪接变异体 表 2a.
  4. 在2%琼脂糖Tris-乙酸-乙二胺四乙酸（TAE）凝胶中分离扩增产物27从凝胶中切下条带，并按照凝胶切胶回收试剂盒说明书进行纯化。
  5. 用适当的限制性内切酶切割扩增子和质粒（限制性酶切概述见参考文献）27），使用酶供应商推荐的体积、孵育时间和温度进行反应，并按照步骤1.4进行纯化。在供应商推荐的条件下，将经限制性酶切的扩增片段连接至质粒中。
  6. 制备阴性对照（不含插入片段但含有连接酶的酶切质粒DNA）和阳性对照（不含酶切位点的卡那霉素抗性质粒）。对感受态细胞进行标准质粒转化 E. coli DH5α28 使用连接混合物27.
  7. 孵育转化后的 E. coli 在1 ml LB（Luria-Broth）培养基中（按说明书配制）27）在 1 小时内振荡 37 °C. 将转化子涂布于含有 LB 琼脂平板上 50 µg/ml 卡那霉素，并在 37 °C 过夜。
  8. 从平板上挑取数个菌落 STAT3 α 和 STAT3 使用无菌牙签挑取β平板27. 转移至2 ml LB培养基中。37°C过夜培养 37 °C 在摇床培养箱中。
  9. 按照DNA纯化试剂盒提供的说明，从细菌培养物中纯化质粒。将质粒储存于-20或-80 °C.
  10. 通过制备多个菌落的质粒进行测序 20 µl 测序反应。用移液器 3 µl 测序反应缓冲液， 2 µl 测序反应体系混合液， 12 µl 超纯水， 1 µl 以质粒为模板 2 µl 测序引物
    注意：若使用pET-28a载体，请使用测序引物5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG-3'。
    1. 评估编码各变异体的质粒电泳图谱：Sα、Sβ、ΔSα 和 ΔSβ25.
  11. 测量纯质粒 DNA 的浓度，单位为 ng/µl若使用分光光度计在260 nm处测定吸光度，请根据比尔-朗伯定律计算DNA浓度29:
    比尔-朗伯定律公式，c = A/εL，吸光度光谱计算。
    何处 c = 浓度， A = 吸光度， ε （消光系数）= 0.02（µg/ml)-1 cm-1 用于双链DNA和 L 光程长度（通常为 1 cm）。
  12. 使用分子量 STAT3 剪接变体cDNA扩增子与载体的拷贝数，并计算每单位拷贝数 µl.
    注：每碱基对（bp）的分子量估计为 650 Da。
    DNA定量方程；使用阿伏伽德罗常数计算拷贝数；科学公式

2. 绝对定量qPCR引物特异性分析

  1. 制备10倍系列稀释液 STAT3 质粒，约108 至 103 每份拷贝 µl (20 µl) 使用超纯水。测量浓度最高（约108 每份拷贝 µl，参见步骤1.11。
  2. 使用稀释后的质粒制备四种“非靶向”混合物（即., STAT3ΔSβ 阴性对照，含有等浓度的 STAT3 Sα、ΔSα、Sβ，但无 ΔSβ）在 106 每份拷贝 µl 每种。制备一种“靶标”混合液，其中包含四种模板，每种模板的浓度相等，均为106 每份拷贝 µl.
  3. 为每种剪接变体配制引物对溶液（参见 表 1b 和 图1）通过制备约60 µl 引物各一个，浓度均为 7 µM 浓度（样品中的终浓度为 560 nM）。
  4. 将DNA聚合酶/dsDNA结合染料混合液按7:5比例用纯H稀释2O.
  5. 在96孔PCR板中按照模板设置实验1（表3).
    1. 添加 21 µl 稀释的DNA聚合酶/双链DNA结合染料混合物，然后 2 µl 引物混合物和 2 µl 模板量（根据具体情况） 表 2b）。不使用模板，添加 2 µl 过滤的 H2O 加入无模板对照（NTC）孔。设置重复反应以评估可重复性30.
  6. 用粘性封膜密封qPCR板，并在1,200 × g条件下离心5分钟 12 °C.
  7. 如果使用列于 材料，按照所述设置实验。
    1. 打开qPCR仪，插入密封的qPCR板。点击文件 > 新 > 下一步 > 选择“新建检测器”，选择报告基团、淬灭基团并提供名称。为每种剪接变体设置一个“新检测器”。
    2. 选择“下一步”，在“设置样本板”页面根据提示设置标准品，确保将数量输入表格中，并选择合适的检测器。单击“完成”。
    3. 按照以下设置进行循环 表 2b确保荧光读数（用于确定 Ct) 发生在 72 °C 每个循环步骤。选择“运行”。
    4. 运行完成后，单击“结果”选项卡 > 扩增曲线图选项卡。评估输出的扩增曲线图以判断数据质量（观察是否呈指数增长曲线，如 图2).
      注意：确保扩增曲线主要呈指数增长，且循环阈值（Ct）可设定在曲线的指数增长阶段。确保阴性对照（NTCs）未发生扩增，其他标准品应显示较低的Ct值和较高的ΔRn值。
    5. 要将结果导出至电子表格软件，请点击文件 > 导出 > 结果。

3. 评估绝对定量 qPCR 检测的特异性和重复性

  1. 可重复性
    1. 使用步骤 2.7.5 中的数据计算标准差 Ct 荧光阈值循环数（threshold cycle for fluorescence）值
      标准差方程，统计分析公式，数学概念，教学工具。
      何处 N = 样本数量（若做双份则为2）， 静力平衡图，ΣFx=0，力的平衡，矢量示意图，力学系统分析 = 样品的 Ct 和 热力学，PV=nRT图表，示意图，理想气体定律，体积-压强关系，物理教育 = 样本 Ct 平均值。检查标准差是否 Ct 重复样本的值应小于或等于0.2。检查是否满足该条件。 Ct 除NTC孔外，所有孔的数值均小于38。
    2. 如果重复性较差，可通过增加或减少退火时间来优化循环参数。
  2. 绘制对数拷贝数（根据步骤 1.12 确定并在步骤 2.1 中制备）与 Ct 值 以建立标准曲线，得到以下方程：
    线性方程 y=mx+b，公式，用于阐释斜率-截距形式概念。
    何处 y 是 Ct， m 是梯度， x 是拷贝数的对数值 b 是截距值。
    注意：R2 线性回归的值在数据良好时应≥0.95。
  3. 使用标准曲线及以下公式计算扩增效率：
    效率百分比计算公式；教育用途；化学/物理概念简明解析。
    注意：目标效率 ≥75%。
  4. 使用Too公式根据qPCR检测1计算特异性：
    特异性因子公式，用于确定化学过程中分子特异性的方程。
    其中 ΔCt太 = Ct目标 - Ct非靶标 ，描述特异性扩增与非特异性扩增的循环阈值（Ct值）差异
    注意：特异性应超过四个数量级（即，特异性因子 ≥4。
    1. 如果特异性较差，可通过降低引物浓度进行优化。按照步骤 2.5–2.7 所述设置实验，引物终浓度范围为 100 nM 至 500 nM。

4. 进行相对定量qPCR实验

  1. 用细胞因子处理细胞以促进转录
    1. 对于新鲜捐献的嗜酸性粒细胞，准备两份重复样本，每份含 2.5 x 106 细胞/ml 的细胞培养基（RPMI 1640 培养基）中，加入 50 ng/ml 白细胞介素-3（IL3）和/或 50 ng/ml 肿瘤坏死因子 α（TNFα），于 3、6、9 和 20 小时不同时间点进行处理 37 °C 5% CO₂条件下2 和10%湿度。
  2. 从嗜酸性粒细胞样本（至少1 x 10）制备cDNA6 根据制造商说明，使用RNA提取和cDNA合成试剂盒，每份制备样品处理相应数量的细胞。
  3. 将两份样本cDNA等分试样（对照或静息样本）进行系列稀释，稀释范围从“1”到“1:1024”。
    1. 对于1:4稀释，用移液器吸取 1 µl cDNA 和 3 µl 超纯水
    2. 对于1:16稀释，用移液器吸取 1 µl 1:4 稀释液的 3 µl 超纯水， 等等。
  4. 在96孔板中设置PCR反应 25 µl 按照步骤2.3-2.5所述进行反应，但针对泛引物（pan-）使用多种引物浓度STAT3 和 GUSB （参见模板于 表4).
  5. 添加“new detector”以 GUSB 并按照步骤 2.6-2.7 操作，使用文中所述的循环参数 表 2c.
  6. 生成标准曲线（参见步骤 3.2 和 3.3），以确定产生 95–100% 扩增效率的引物浓度。
  7. 设置96孔板，加入已准备好的cDNA样品（来自步骤4.2）和优化浓度的引物（参见 表 2c 用于循环参数、试剂和 表5 96孔板模板
  8. 执行步骤 2.6–2.7。至少重复一次实验，并检查数据质量。
  9. 计算平均值 Ct 重复样本的值 Cts 对于两者 STAT3 和内参基因 GUSB.
  10. 获取 ΔCt 每个样本的数值。
    qPCR分析公式：用于基因表达量化的ΔCt计算方程
  11. 将静息样本（通常为目标转录本浓度最低的样本）指定为样本0。计算ΔΔCt31 针对每个样本（此处标记为样本 X）：
    qPCR 相对定量公式 ΔΔCt = ΔCt_样本X − ΔCt_样本0，用于基因表达分析。
  12. 计算每个样本的倍数增加：
    qPCR 结果计算公式：倍数增加 = 2^(-ΔΔCt 样本 X)。
  13. 可重复性
    1. 计算泛基因组拷贝数的变异系数（CV）STAT3 和 GUSB.
      变异系数，CV，公式；统计分析；显示数据离散程度的方程。
      何处 N = 样本数量，= 样本计算拷贝数，= 样本均值。检查每个样本（多个检测）的变异系数（CV）是否≤10%。

5. 分析未知样本的绝对定量qPCR数据

  1. 比较在相对定量qPCR（如步骤4.9所述）中获得的内参基因Ct值 GUSB 确保样品的 cDNA 浓度在同一个数量级内。
    1. 根据需要稀释cDNA（例如， 如果样本1具有一个 Ct 约为 17.5，以及其他样品的 Ct 数值约为21，样本1约为2(21-17.5) 浓度高11倍。用超纯水在同一范围内进行1:1稀释，避免不必要的过度稀释。
      注意：起始浓度差异过大会影响线性回归分析结果（步骤 4.12）。
  2. 建立样品的绝对定量qPCR检测。根据Sα和Sβ制备2a号检测用模板板 表6；并按照相同方法为 ΔSα 和 ΔSβ 准备检测 2b 表7. 按照步骤 2.6–2.7.3 中所述进行检测（以及 表 2b）。至少重复实验一次。
  3. 检查数据质量，并按照步骤 2.7.4-2.7.5 中所述进行导出。
  4. 设置绝对定量qPCR 96孔板 25 µl 使用广谱的反应STAT3 引物（引物在 表 1c，模板在 表8在 400 µM 四种质粒的混合物或单个质粒，按所列总浓度。
    注意：绝对定量qPCR中扩增效率并不重要，但这些引物的效率优化对于相对定量qPCR至关重要（步骤4）。
  5. 用粘性封膜密封qPCR板，并在1,200 × g条件下离心5分钟 12 °C.
  6. 设置“新检测器”用于泛STAT3 如步骤 2.7.1-2.7.3 所述。
  7. 设置泛用循环程序STAT3 按照 表 2c （与相对定量qPCR相同条件）。确保荧光读取（以确定） Ct) 发生在 72 °C 每个循环步骤。至少重复一次实验以确保可重复性。
  8. 检查数据质量并导出（参见步骤 2.7.4-2.7.5）。
    1. 如果扩增曲线图未呈现指数增长（参见 图2)，将样品cDNA稀释（1:10），并按照前述方法重复检测（步骤5.7）。
  9. 使用标准曲线方程（参见3.2， 图3）以及 Ct 样本的值，计算每种剪接变体及全型STAT3 在每个样本中。
    径流曲线数方程，CN=10[(Ct-b)/m]，公式示意图，水文分析工具
  10. 绘制 log（获得的泛qPCR拷贝数绝对值）STAT3) 与 log（qPCR 累积绝对拷贝数数值 STAT3 剪接变体
    注：理想的线性回归和斜率值均应接近 1。
  11. 计算重复性（步骤 3.1）和再现性（步骤 4.13）。

6. 合并绝对定量与相对定量 qPCR 数据

  1. 将剪接变体的比例乘以总的 STAT3 表达倍数增加量，以计算每种剪接变体的倍数增加量。
  2. 计算绝对值和相对值的标准差（参见步骤 3.1.1），以考虑误差传递。标准误（SEM）的计算方法如下所示：
    平均值标准误公式，SEM 计算，统计数据分析，数学方程。

结果

高质量的 qPCR 数据将产生 S 形扩增曲线（图2a)，表明在扩增循环过程中转录本呈指数级增加。模板过多可能导致荧光背景过高，意味着在最初几个循环中建立了不合适的基线。如果数据未呈现指数曲线（图2b），需要进一步优化（详见步骤 3.1 和 3.4）。有关 qPCR 结果问题排查的更多信息，请参见参考文献32标准曲线由模板校准质粒生成，将指示扩增效率（曲线对应于 STAT3 Sα 如图所示 图3在所述条件下，观察到的扩增效率介于83%至95%之间。特异性计算公式（步骤3.4）假定扩增效率相等，但这种情况不太可能。25因此，特异性可能高于特异性因子所提示的水平。

为了评估STAT3水平的一致性，检测了四种剪接变体各自的绝对表达量，以及总的STAT3水平；后者采用可扩增所有四种剪接变体共有区域的引物进行检测（图4）。理想情况下，线性回归（表示相关性）和斜率（总STAT3与四种剪接变体之和的比值）均应接近于1。

绝对定量qPCR数据以饼图形式呈现，以显示细胞因子刺激后不同时间点四种剪接变体的比例变化图5a）。静息状态的嗜酸性粒细胞（0小时）所占比例最小 STAT3 Sα，尽管该变体始终是最丰富的。将该变体所占比例乘以 STAT3 β剪接变体（Sβ+ΔSβ）与总分数的比值 STAT3 ΔS剪接变体（ΔSα+ΔSβ）所得数值始终低于实验测得的ΔSβ值。若剪接事件相互独立，则ΔS变体比例与β变体比例的乘积应与实验测定值相符。而ΔSβ水平高于独立剪接事件所预期的结果，提示存在共剪接偏向性。

整合绝对定量与相对定量qPCR数据表明，所有STAT3剪接变体在经细胞因子IL3和TNFα刺激后表达水平均上升，且在刺激后6小时达到峰值（图5b-e）。在四种剪接变体中的三种中，经IL3+TNFα处理的嗜酸性粒细胞（6小时）其转录本水平约为同期培养基中嗜酸性粒细胞的3倍。STAT3 Sα在IL3+TNFα处理的嗜酸性粒细胞中的水平较同期培养基中的嗜酸性粒细胞高出3.5倍。ΔSβ的测量不确定性最大（标准误差最大）（图5e），其在所有样本中占总STAT3的比例最小。这一结果并不意外，因为较低的表达水平通常对应较高的Ct值。达到阈值循环所需的扩增循环数越多，会因每轮扩增效率的循环间变异而进一步增加测量的不确定性。

基因剪接示意图；用于蛋白质编码序列分析的外显子-内含子结构比较。
图1： 用于检测STAT3剪接异构体及总STAT3的qPCR引物对示意图。 图中展示了用于特异性扩增各STAT3剪接异构体（分别为Sα、Sβ、ΔSα和ΔSβ）的引物。上游引物（STAT3 “S”和“ΔS”）跨越第21与第22外显子之间的连接区域。请点击此处查看该图的放大版本。

PCR扩增曲线；Delta Rn与循环数图表；定量分析；图形数据。
图2： qPCR数据的扩增曲线图。（a）S型扩增曲线表明扩增结果可靠。这些数据来自含有STAT3 Sα的质粒的两个系列稀释样本的qPCR检测，每对彩色线条代表在40个循环（x轴）过程中，重复稀释样本的荧光水平变化。浓度最高的样本（绿色-灰色）在第17个循环时已实现充分扩增（双链DNA结合染料的荧光信号与y轴所示荧光强度成正比），其荧光信号超过设定的阈值（基线以绿色箭头表示），因此其Ct值为17。（b）非指数型扩增曲线提示在前几个循环中背景荧光阈值设定不准确，可能由抑制物存在，或模板或引物浓度过高所致。请点击此处查看该图的放大版本。

Ct 与质粒拷贝数对数值的标准曲线图；线性回归显示强相关性（R²=0.994）。
图 3： log（STAT3 Sα 拷贝数）与Ct 的标准曲线。 每个 STAT3 剪接变体拷贝数的对数值与循环阈值（Ct）之间存在线性关系。使用质粒 DNA 构建标准曲线可模拟样本的 cDNA，因此比使用稀释后的 PCR 扩增子构建的曲线提供更准确的测量结果。所示数据为对含有 STAT3 Sα 的质粒进行两倍系列稀释后，通过 qPCR 获得的 Ct 值。根据该曲线可插值得出每个样本中的拷贝数，并计算扩增效率（83.9%）。尽管 y 轴截距的重复性低于斜率，但该截距提示需达到 42.2 个循环才能确保无靶标 DNA 存在。误差线表示标准误（SEM），n = 3。对于 STAT3 Sβ、ΔSα 和 ΔSβ 也构建了类似的曲线（未显示）。请点击此处查看该图的放大版本。

对数相关性，STAT3 剪接变体，线性回归图，数据分析结果。
图 4：总STAT3与累积的STAT3剪接变体的定量比较。累加的STAT3剪接变体与总STAT3的回归分析，其斜率（总STAT3与累积STAT3的比值）和R2值（相关性）应接近1。数据包含来自17个样本（嗜酸性粒细胞和DLBCL）的结果。误差线表示x到y测定值的标准误（SEM），每个样本重复数n ≥ 2。本图改编自参考文献20。请点击此处查看该图的放大版本。

随时间变化的细胞反应；饼图、折线图；蛋白质表达、刺激分析。
图 5：STAT3剪接变体水平在细胞因子处理过程中发生波动。（a）饼图显示嗜酸性粒细胞在 IL3 和 TNFα 处理期间各 STAT3 剪接变体所占百分比。（b–e）通过整合相对定量与绝对定量 qPCR 数据，检测经不同细胞因子组合处理后嗜酸性粒细胞中 STAT3 剪接变体的变化。STAT3 Sα（b）、Sβ（c）、ΔSα（d）和 ΔSβ（e）水平在刺激后随时间发生波动，初始阶段上升，并在刺激后 6 小时达到峰值。IL3+TNFα 联合处理诱导的四种 STAT3 剪接变体表达水平均高于单独使用 IL3 处理。每个数据点的误差线表示标准误（SEM），并考虑了误差传递。请点击此处查看该图的放大版本。

STAT3转录本的PCR引物表，显示正向/反向序列及以bp为单位的扩增子大小。
表 1: 用于扩增（a）、绝对（b）和相对（c）定量PCR的引物。克隆引物包含限制性酶切序列和5'-延伸序列，以实现高效切割。KpnI 和 NheI 限制性酶切位点以粗体标出。请点击此处查看此表格的放大版本。

PCR热循环程序和试剂设置；示意图包含DNA扩增的温度、时间和体积。
表 2. 扩增（a）、相对（b）和绝对（c）定量PCR的PCR循环参数（左）和试剂体积（右）。 请点击此处查看此表格的放大版本。

以热图形式显示的实时 PCR 结果；展示了扩增和无模板对照数据。
表 3：绝对定量 qPCR 质粒校准实验模板。该实验用于评估重复性与扩增效率，并生成标准曲线以进行数据插值。“非靶标”反应体系可用于评估特异性。为获得一致结果，可能需要进行优化。请点击此处查看此表格的放大版本。

cDNA 梯度稀释、无模板对照、引物对的 PCR 板布局；分子分析。
表 4：相对定量 qPCR（泛-STAT3 和看家基因 GUSB）校准实验模板。 与绝对定量 qPCR 不同，本实验的目的是确定扩增效率接近 100% 的实验条件。请点击此处查看本表的放大版本。

用于qPCR分析的微孔板布局，显示样品分布和无模板对照。
表 5：用于检测泛-STAT3 和看家基因 GUSB 的相对qPCR样品检测模板。标准曲线与样品同时重复进行，以确保检测的扩增效率具有可比性。请点击此处查看此表格的放大版本。

通过连续稀释法进行DNA定量的微孔板布局示意图；包含标准曲线数据。
表 6：用于检测S变异株的绝对定量qPCR样本检测模板。 标准曲线与样本同时重复进行，以确保各检测之间的扩增效率具有可比性。 请点击此处查看该表格的放大版本。

用于PCR检测的连续稀释平板模板，显示浓度梯度和样品布局。
表 7：用于检测 ΔS 变异体的绝对定量 qPCR 样品检测模板。标准曲线与样品同时重复进行，以确保检测的扩增效率具有可比性。请点击此处查看本表的放大版本。

用于定量PCR分析的微孔板布局，包括标准曲线、样品和对照。
表 8：用于检测泛-STAT3的绝对定量qPCR样品检测模板。 请点击此处查看此表格的放大版本。

讨论

我们开发了该实验方案，旨在评估嗜酸性粒细胞和淋巴瘤细胞中STAT3剪接变体转录本的水平和比例，并探究细胞因子刺激是否影响这些水平和比例。STAT3尤其受到关注，因其具有多效性且功能尚不明确，关于其在癌症中是作为癌蛋白还是肿瘤抑制因子发挥作用，目前存在相互矛盾的报道（参见文献33综述）。此前已有研究对STAT3 α和β剪接变体的功能差异进行了表征34,35，而我们的实验方案支持了敲低/再表达分析，提示S与ΔS转录本之间需要维持一个最佳比例19。

准确量化不同的剪接变异体将有助于进一步研究STAT3功能的异质性与剪接变异体组成之间的关系。该实验方案整合了绝对定量和相对定量qPCR数据，结合了绝对定量qPCR计算剪接变异体比例的能力以及相对定量qPCR检测整体STAT3表达水平变化的优势。该方法能够区分序列中的细微差异，并同时测量两个相距超过50个核苷酸的可变剪接位点的剪接比率。若单独分析各个剪接事件的比例，则无法发现一个显著现象：即存在协同剪接偏好性，使得ΔSβ水平高于两个剪接位点随机剪接时的预期值25。

关键在于，利用质粒标准曲线进行绝对定量 qPCR 能够对产生高度相似序列的剪接变异体进行定量（即使扩增效率非最优）。我们预计开发一种新的精细剪接 qPCR 检测方法大约需要两个月时间进行优化。检测方法开发的关键步骤包括：构建用于生成绝对 qPCR 标准曲线的 STAT3 质粒；通过实验确定最佳引物序列和扩增循环参数，以确保特异性和可重复性；以及整合相对 qPCR 数据，该数据通过将总 STAT3 表达量相对于 GAPDH 表达量进行定量获得。总 STAT3 定量所得拷贝数与累积定量结果（Sα+ΔSα+Sβ+ΔSβ）之间的相关性表明，该方案可产生可靠的结果。

该技术的一个局限性在于其广泛的验证过程。必须评估方法内的变异性（重复性）、方法间的变异性（可重复性）以及特异性。本方案概述了获得这些参数数值输出的方法。我们认为，效率≥75%、特异性因子≥4、变异系数（可重复性）≤10%以及Ct标准差（重复性）≤0.2可作为合适的阈值30。尽管STAT3序列中氨基酸1-690位点的突变或缺失可能影响剪接比例，但本方案无法检测到这些变异。转录本的比例可能与蛋白异构体的比例不成正比36。

由于各样本起始的总cDNA含量不同，绝对定量qPCR适用于比较同一样本内剪接变体的拷贝数，但不适用于样本间的比较，除非结合使用已确立的看家基因进行相对定量qPCR。本研究所采用的方法符合MIQE qPCR指南中关于可重复性的要求30。若使用其他仪器设备，可能需要调整PCR扩增循环参数和引物浓度以获得可重复的数据。在不严重损害扩增效率的前提下，完全的特异性难以实现，但目标片段的扩增效率高出四个数量级以上。

线性DNA比环状DNA更容易扩增。如果替代质粒无法提供满意的标准曲线（R2 < 0.95），可考虑在定量前通过单一位点限制性酶切将质粒线性化。优化qPCR对于获得高质量数据至关重要（图1）。大多数qPCR方案依赖于两步循环程序，仪器也相应地进行了优化。在三步循环程序中，加热块的加热不均匀问题可能加剧，从而导致重复性差。实验必须在无菌条件下进行，使用带滤芯的移液器吸头和超纯水，最好在专用的层流罩内操作。由于污染物可能导致结果不一致，因此实验应在无菌条件下使用带滤芯的移液器吸头和超纯水进行，理想情况下在专用的层流罩内完成。有关qPCR优化的更多信息，请参阅Bustin et al.32

定量分析STAT3可能在多种研究背景下提供更深入的见解。STAT3可自我调控其自身表达37，而上述方案有助于阐明STAT3剪接变体的比例是否参与调控这一正反馈环路。该方案可用于研究细胞在不同密度38或发育过程中观察到的剪接变体比例变化：已知在造血过程中，STAT3 α/β 比例在蛋白水平上会发生改变16。Sundin et al. 发现，一名Job综合征患者STAT3基因内含子中的单核苷酸多态性导致第12外显子的剪接受到偏向性影响39。可以设想，位于第21与第22外显子之间或第22与第23外显子之间的内含子中众多SNP之一，可能分别影响ΔS/S和α/β剪接变体的比例。该检测方法可用于量化癌细胞中的STAT3转录本，因为在这些细胞中，剪接调控的突变或改变可能使剪接过程产生偏向性40。在骨髓增生异常综合征中观察到的剪接因子（如SF3B1）突变41，也可能导致可由此方案检测到的变化。

更广泛而言，该方法能够特异性地检测剪接过程中的共关联现象，而这是传统的RNA-Seq或标准qPCR所无法实现的。尽管相互排斥的外显子剪接现象表明剪接决策之间存在协调性，但其他剪接事件之间的共关联性尚未得到充分研究。最近报道了一种替代方法，通过对RNA-Seq进行改进以检测全长cDNA，结果提示远距离剪接事件之间的相互依赖性比此前认为的更为显著42。

STAT3 包含一个供体串联剪接位点。受体串联剪接位点更为常见43，而本方案所述原则可作为开发共发生检测NAGNAG剪接及其他在200个核苷酸范围内的剪接事件的实验方法的起点。其他潜在应用包括对其他细微序列差异（如插入缺失或双/三核苷酸多态性）的共发生情况进行定量分析44。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢美国国立卫生研究院心肺血液研究所（National Institutes of Health-NHLBI）对“嗜酸性粒细胞在气道炎症与重塑中的作用”项目资助（项目编号：P01HL088584，项目负责人：N. Jarjour），以及威斯康星大学卡本癌症中心和医学系提供的院内资金支持。我们感谢Douglas Annis在克隆四种STAT3变异体方面所做的工作。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
MJ Research PTC-200 热循环仪GMIN/A用于标准 PCR
7500 实时荧光定量 PCR 系统Applied BiosystemsN/AqPCR 仪器
GS-6RBeckman CoulterN/A适用于 96 孔板的离心机
Nanodrop 2000 分光光度计ThermoFisher ScientificN/A
RPMI-1640 培养基Sigma AldrichR8758细胞培养基
PfuTurbo DNA 聚合酶Agilent Technologies600410用于标准 PCR 的 DNA 聚合酶
KpnINew England BiosciencesR0142S
NheINew England BiosciencesR0131S
SYBR Green PCR 主混合液Qiagen330523qPCR，DNA 聚合酶/双链 DNA 结合染料混合液
RNeasy 小量试剂盒Qiagen74204RNA 提取试剂盒
SuperScript III 第一链合成系统Invitrogen (ThermoFisher Scientific)18080-044cDNA 合成试剂盒
引物Integrated DNA TechnologyN/A
NEBuffer 1.1New England BiosciencesB7201S
GenePure LE 琼脂糖ISC BioExpressE-3120-500TAE 凝胶组分
移液器主要实验室供应商 (MLS)N/A
滤芯移液器吸头Neptune ScientificBT10XL, BT20, BT200
EU 一体式薄壁板MidSciABI7501
ThermalSeal A 密封膜MidSciTSA-10096 孔板密封膜
pET-Elmer（pET-28a 的变体）Novagen；在 Mosher 实验室中改造N/A详见 PMID: 20947497
Wizard Plus SV 小量质粒 DNA 纯化系统PromegaA1460质粒纯化
BigDye Terminator v3.1 循环测序试剂盒ThermoFisher Scientific4337455测序试剂盒
QIAEX II 凝胶回收试剂盒Qiagen20021扩增片段纯化
DH5α 感受态细胞ThermoFisher Scientific18265-017可从多家供应商获得，参见 PMID: 2162051
卡那霉素Research Products International Corp.K22000-5.0
Tris 碱ThermoFisher ScientificBP152-5TAE 缓冲液组分
冰醋酸ThermoFisher ScientificA38C-212TAE 缓冲液组分
EDTA（乙二胺四乙酸）Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich)E-5134TAE 缓冲液组分
Bacto 胰蛋白胨BD Biosciences211705LB 培养基组分
Bacto 酵母提取物，技术级BD Biosciences288620LB 培养基组分
氯化钠ThermoFisher ScientificS271-10LB 培养基组分
氢氧化钠ThermoFisher ScientificSS255-1LB 培养基组分
Bacto 琼脂BD Biosciences214010LB 琼脂平板组分
Lasergene SeqBuilderDNASTAR图 1 使用 Lasergene SeqBuilder 软件版本 12.2.0 (DNASTAR) 生成

参考文献

  1. Hiller, M., et al. Phylogenetically widespread alternative splicing at unusual GYNGYN donors. Genome Biol. 7 (7), R65(2006).
  2. Treacy, M. N., et al. Twin of I-POU: a two amino acid difference in the I-POU homeodomain distinguishes an activator from an inhibitor of transcription. Cell. 68 (3), 491-505 (1992).
  3. Schindler, S., et al. Alternative splicing at NAGNAG acceptors in Arabidopsis thaliana SR and SR-related protein-coding genes. BMC Genomics. 9, 159(2008).
  4. Szafranski, K., Kramer, M. It's a bit over, is that ok? The subtle surplus from tandem alternative splicing. RNA Biol. 12 (2), 115-122 (2015).
  5. Wang, M., et al. Alternative splicing at GYNNGY 5' splice sites: more noise, less regulation. Nucleic Acids Res. 42 (22), 13969-13980 (2014).
  6. Hiller, M., Platzer, M. Widespread and subtle: alternative splicing at short-distance tandem sites. Trends Genet. 24 (5), 246-255 (2008).
  7. Tsai, K. W., Lin, W. C. Quantitative analysis of wobble splicing indicates that it is not tissue specific. Genomics. 88 (6), 855-864 (2006).
  8. Tadokoro, K., et al. Frequent occurrence of protein isoforms with or without a single amino acid residue by subtle alternative splicing: the case of Gln in DRPLA affects subcellular localization of the products. J Hum Genet. 50 (8), 382-394 (2005).
  9. Bradley, R. K., Merkin, J., Lambert, N. J., Burge, C. B. Alternative splicing of RNA triplets is often regulated and accelerates proteome evolution. PLoS Biol. 10 (1), e1001229(2012).
  10. Zheng, C. L., Fu, X. D., Gribskov, M. Characteristics and regulatory elements defining constitutive splicing and different modes of alternative splicing in human and mouse. RNA. 11 (12), 1777-1787 (2005).
  11. Schaefer, T. S., Sanders, L. K., Nathans, D. Cooperative transcriptional activity of Jun and Stat3 beta, a short form of Stat3. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9097-9101 (1995).
  12. Waitkus, M. S., et al. Signal integration and gene induction by a functionally distinct STAT3 phosphoform. Mol Cell Biol. 34 (10), 1800-1811 (2014).
  13. Srivastava, J., DiGiovanni, J. Non-canonical Stat3 signaling in cancer. Mol Carcinog. , (2015).
  14. Holland, S. M., et al. STAT3 mutations in the hyper-IgE syndrome. N Engl J Med. 357 (16), 1608-1619 (2007).
  15. Maritano, D., et al. The STAT3 isoforms alpha and beta have unique and specific functions. Nat Immunol. 5 (4), 401-409 (2004).
  16. Hevehan, D. L., Miller, W. M., Papoutsakis, E. T. Differential expression and phosphorylation of distinct STAT3 proteins during granulocytic differentiation. Blood. 99 (5), 1627-1637 (2002).
  17. Yoo, J. Y., Huso, D. L., Nathans, D., Desiderio, S. Specific ablation of Stat3beta distorts the pattern of Stat3-responsive gene expression and impairs recovery from endotoxic shock. Cell. 108 (3), 331-344 (2002).
  18. Stahl, N., et al. Choice of STATs and other substrates specified by modular tyrosine-based motifs in cytokine receptors. Science. 267 (5202), 1349-1353 (1995).
  19. Zheng, M., et al. A mix of S and DeltaS variants of STAT3 enable survival of activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells in culture. Oncogenesis. 4, 184(2016).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103(2004).
  22. Kelly, E. A., Liu, L. Y., Esnault, S., Quinchia Johnson, B. H., Jarjour, N. N. Potent synergistic effect of IL-3 and TNF on matrix metalloproteinase 9 generation by human eosinophils. Cytokine. 58 (2), 199-206 (2012).
  23. Whelan, J. A., Russell, N. B., Whelan, M. A. A method for the absolute quantification of cDNA using real-time PCR. J Immunol Methods. 278 (1-2), 261-269 (2003).
  24. Too, H. P. Real time PCR quantification of GFRalpha-2 alternatively spliced isoforms in murine brain and peripheral tissues. Brain Res Mol Brain Res. 114 (2), 146-153 (2003).
  25. Turton, K. B., Annis, D. S., Rui, L., Esnault, S., Mosher, D. F. Ratios of Four STAT3 Splice Variants in Human Eosinophils and Diffuse Large B Cell Lymphoma Cells. PloS One. 10 (5), e0127243(2015).
  26. Maurer, L. M., et al. Extended binding site on fibronectin for the functional upstream domain of protein F1 of Streptococcus pyogenes. J Biol Chem. 285 (52), 41087-41099 (2010).
  27. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Greene Pub. Associates; J. Wiley. (1987).
  28. Grant, S. G., Jessee, J., Bloom, F. R., Hanahan, D. Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-restriction mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (12), 4645-4649 (1990).
  29. Kocsis, L., Herman, P., Eke, A. The modified Beer-Lambert law revisited. Phys Med Biol. 51 (5), N91-N98 (2006).
  30. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  31. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29 (9), e45(2001).
  32. A-Z of quantitative PCR. Bustin, S. A. , International University Line. (2004).
  33. Zhang, H. F., Lai, R. STAT3 in cancer-friend or foe. Cancers (Basel). 6 (3), 1408-1440 (2014).
  34. Caldenhoven, E., et al. STAT3beta, a splice variant of transcription factor STAT3, is a dominant negative regulator of transcription. J Biol Chem. 271 (22), 13221-13227 (1996).
  35. Zammarchi, F., et al. Antitumorigenic potential of STAT3 alternative splicing modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (43), 17779-17784 (2011).
  36. Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell. 165 (3), 535-550 (2016).
  37. Narimatsu, M., et al. Tissue-specific autoregulation of the stat3 gene and its role in interleukin-6-induced survival signals in T cells. Mol Cell Biol. 21 (19), 6615-6625 (2001).
  38. Szafranski, K., et al. Physiological state co-regulates thousands of mammalian mRNA splicing events at tandem splice sites and alternative exons. Nucleic Acids Res. 42 (14), 8895-8904 (2014).
  39. Sundin, M., et al. Novel STAT3 mutation causing hyper-IgE syndrome: studies of the clinical course and immunopathology. J Clin Immunol. 34 (4), 469-477 (2014).
  40. Oltean, S., Bates, D. O. Hallmarks of alternative splicing in cancer. Oncogene. 33 (46), 5311-5318 (2014).
  41. Boultwood, J., Dolatshad, H., Varanasi, S. S., Yip, B. H., Pellagatti, A. The role of splicing factor mutations in the pathogenesis of the myelodysplastic syndromes. Adv Biol Regul. 54, 153-161 (2014).
  42. Tilgner, H., et al. Comprehensive transcriptome analysis using synthetic long-read sequencing reveals molecular co-association of distant splicing events. Nat Biotechnol. 33 (7), 736-742 (2015).
  43. Hiller, M., et al. Widespread occurrence of alternative splicing at NAGNAG acceptors contributes to proteome plasticity. Nat Genet. 36 (12), 1255-1257 (2004).
  44. Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing. Nucleic Acids Res. 38 (18), 6102-6111 (2010).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

STAT3 qPCR qPCR STAT3

相关文章