在小鼠实验为细菌性肺炎的诱导和表型非侵入性和技术上非密集型方法

Summary

几种方法已在文献中的小鼠模型细菌性肺炎进行了描述。在此，我们描述了用于通过移液到口咽细菌接种物的抽吸（ 即 ，吸入）诱导肺炎的非侵入性的，廉价的，快速的方法。对于肺先天免疫应答的评估下游方法也是详细说明。

Abstract

虽然社区获得性肺炎仍然是一个重大的公共卫生问题，细菌性肺炎小鼠模型中我们底层的细胞和分子发病机制的认识，最近促进显著临床进展。 在活体小鼠模型捕捉宿主防御反应的综合生理和弹性的方式不被替代的，简化的离体方法揭示。几种方法已在文献中小鼠细菌肺内接种，包括雾化，鼻内递送，"盲"和可视化的条件下经口气管插管，和经皮气管插管进行了描述。所有的方法都具有相对的优点和局限性。这里，我们详细描述用于细菌的气管内递送，通过鼠标涉及抽吸（ 即 ，吸入）的非侵入性的，在技术上不密集的，廉价且快速的方法的同时，在全身麻醉下吸移到口咽感染接种物。这种方法可用于各种各样的无腐蚀性生物和化学制剂的肺递送，并且相对容易学习，即使对于肺程序最小先前经验的实验室。除了描述的吸入性肺炎的方法，我们也用于测定随后在体内小鼠的肺先天免疫反应，特别是提供一步一步的程序，用于量化细菌清除和感染呼吸道的细胞免疫应答的方法。这种集成和简单的肺炎评估方法允许的遗传和环境操纵在肺先天免疫效果快速和强大的评估。

Introduction

社区获得性肺炎仍然感染在美国死亡的主要原因，死亡率在过去40年，尽管在接种疫苗的改进和抗生素的战略^1,2整体变化不大。尽管在公共卫生水平缺乏可察觉进展，近年来引人注目的进展已在我们的肺炎的分子和细胞发病机理的理解制成，具有许多的向前通过使用肺部感染的小鼠模型成为可能这些步骤。小鼠的遗传易处理性，鼠和人的免疫系统，和鼠靶向免疫试剂繁多，已成为商用的相似性都共同促进该领域的快速进步。

在文献中描述的细菌性肺炎的小鼠模型一般在四种情况之一的技术路线依赖于病原体接种:ⅰ）雾化; II）INTRanasal交付; III）口服交货;和iv）手术气管内注射（ 即气管切开术^）3。感染的所有路线各有优缺点^3。在上气道的特定，相对曝光，电位为口鼻菌群，对于全身麻醉要求的混合，递送至远端肺接种，的递送病原体大叶性肺炎分布，技术专长的要求，和程序的发病率的变异性在这些广泛地变化的方法。

常用的口服感染技术包括通过无论是"瞎子"（非可视）的方式，或直接在可视化喉气管^{3-5（translaryngeal）}插管。这两种方法，而健壮的，需要大量的训练，还可以携带创伤的风险的上气道。在本报告中，我们描述了经口感染的一个技术上的非密集，非侵入性的，廉价且快速的方法，W特此细菌（ 肺炎在所提供的示例克雷伯 ）吸移到麻醉小鼠的口咽通过抽吸（ 即 ，吸入）递送至肺部。我们和其他人已经成功地^6-9使用了吸入性肺炎的技术。这种多功能，也容易学习肺递送方法可以扩展至输送许多额外的非苛性剂到肺部，包括细胞因子和其它蛋白质，病原体相关分子（ 如脂多糖），细胞（ 即 ，继转移），和毒素（ 例如 ，博莱霉素）。除了讨论重要的技术方面的考虑，我们还描述了一个综合的，定量的方法来评估随后的宿主反应肺炎，包括细菌清除下游测量（ 即菌落形成单位[CFU]定量肺和外周器官）和白细胞堆积在领空。

Protocol

所有实验均按照动物福利法和人文关怀和实验动物的使用美国公共卫生服务政策审核后，由动物护理和NIEHS的使用委员会进行。

1. K.的制备肺炎文化

注意:执行在生物安全2级（BSL2）罩或其他BSL2指定区域的所有步骤，并丢弃每个学院BSL2指引浪费。

1. 对于K的悬浮生长肺炎 ，细菌解冻的甘油和转移1毫升K的接种工作文化肺炎库存到在500毫升或更大烧瓶50毫升胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）组成。
2. 通过加入900微升培养数期克雷伯使甘油原液肺炎至100μl无菌甘油中，并在-20℃或-80℃冷冻。对于长期储存，建议-80℃。
3. 从文化的细菌由隔夜摇瓶TEP 1.1 - 在37℃下在200-225 rpm.In为了促进对数期生长（14 18小时），稀1-5毫升此过夜培养的成含50ml TSB在早晨烧瓶中并放回在37℃下振摇〜2.5小时。
4. 转移1毫升K的从最后一步到1.5ml试管和自旋经7,500×g离心2分钟肺炎培养。白色颗粒应该是可见的。不干扰沉淀除去上清液，轻轻地用移液管在1毫升的无菌盐水的悬浮细菌和7,500 xg离心再次旋转2分钟。
   1. 执行此清洗步骤2倍，造就了决赛，洗颗粒在1毫升无菌盐水。
5. 执行此整洁的接种记录明智的连续稀释。例如，添加400微升接种到3.6毫升无菌盐水连续做出10 ^-1 -10 ^-9稀释系列。
6. 确定冲K的OD ₆₀₀ 肺炎通过将加入1ml的1:10和1:100的稀释液移入一次性试管并测量OD _600，用无菌盐水第一消隐。重复的测量，以确保准确性。的1.0的OD ₆₀₀大约相当于4-7×10 ⁸ CFU / ml的。注意，外径和CFU之间的关系/ ml的可能不是线性的。
   1. 从稀释使用OD ₆₀₀来计算K的浓度肺炎，运用外径:CFU /毫升以上的转换，以及保理在稀释。
7. 使用K.肺炎浓度以制备所需接种CFU剂量在<100μl的体积递送到小鼠（见下文）。
8. 还板10 ^-6 -10 ^-9稀释100微升和100微升无菌盐水到在RT个人胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）平板上。在37℃孵育过夜，并以计算出在实验中使用并控制污染确切浓度枚举的细菌菌落。
   注:最终的接种实际细菌浓度可能是±500 CFU /毫升的预测被吸收。实验者最好应确认OD _600: 体内小鼠使用前试点研究CFU / ml的关系，凭经验调整的OD _600:根据自己的亲身经历CFU / ml的转换。

K. 2.鼠气管内（IT）吸入从肺炎口咽

1. 确保鼠尾标，纹身，或其他经批准的标识符唯一标识。
2. 制定给药使用之前，为了加快程序去除异氟醚小鼠P200吸管细菌接种。对于它的愿望最佳效果，使用<100微升的体积，以防止溢出。在这里，使用2000 CFU / 50微升的K.肺炎 。
3. 麻醉小鼠用异氟烷气体（以1升/分钟的流速例如 2％异氟烷）的明确室或按institutional准则。小鼠的麻醉一起数被实验者的舒适程度，通常为1-2在一个时间确定。观察呼吸和确认麻醉级别后，深呼吸是可见的，2-3秒可呼吸间进行计数。
   注意:如果有关于挥发性（吸入）麻醉药可能的混杂影响表示关切，麻醉可以达到，而不是用氯胺酮/赛拉嗪腹腔注射。用上述方法，深度麻醉只持续几分钟。如果更长时间麻醉诱导，眼膏应该用来防止眼干燥。
4. 一旦老鼠被麻醉，其定位在一个半卧位仰卧位，由橡皮筋上颌切牙悬挂在倾斜的有机玻璃板钉（ 图1）之间拉伸。
5. 轻轻拉动鼠标舌边有一对钝非脊钳和存款量进入口腔与P200 pipett即十分小心，以避免诱发创伤要么舌或口咽部。
6. 在保持缩回舌头，轻轻地用戴手套的手指，直到鼠标吸入堵塞的鼻子。继续以覆盖鼻子直到鼠标已采取两个或两个以上吸入剂，并且没有液体在口腔中可见。覆盖鼻子有助于确保鼠标会吸入细菌进入肺部，因为老鼠是专鼻子呼吸。
7. 从接种板上取下鼠标，回到笼子里，把鼠标在它的后面，防止寝具或碎屑堵塞鼻孔，而鼠标从麻醉中复苏。
8. 一旦所有的老鼠被给予和从麻醉中苏醒了，小家鼠在一个房间/房间只含老鼠已经与剂量K.肺炎。每天监控小鼠，包括体重，如果超越48小时后感染。
9. 如果让老鼠超越48日常使用的混搭和/或补充热量小时。

3.支气管肺泡灌洗液（BALF）收集和分析

1. 每安乐死机构准则老鼠。在这里，使用150毫克/公斤戊巴比妥钠或商业安乐死溶液，然后放血等效剂量注射死刑，因为这避免了可能出现的并发症与CO ₂吸入和颈椎脱位合并肺部。
2. 在后卫位置上的鼠标和尤其是在胸部和颈部用70％乙醇喷洒消毒皮毛鼠标。
3. 使刚刚胸骨下方的纵行剪开，然后拿着用钳子胸骨，尼克隔膜，使肺回落入胸腔。对血管的任一侧切向上穿过胸腔，然后向上通过颈部，露出气管。
4. 由于气管被纵肌两边包围，精心裁剪通过中间，推动组织向两侧，随着这避免了切割周边脉管，这可能引入血液进入气管。如果脉管缺口，清洁用纱布周边地区访问气管管腔前。
5. 使用外科剪刀或针缺口气管关于从头部向下的方式¼并插入连接于1ml注射器用1ml 1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）尾部进气管的预装的插管。如果使用鼠标<8周龄或女性，在灌洗量减少至600-800微升。
6. 推体积入肺缓慢，允许所有裂片膨胀，然后用注射器拉动卷退了出来，重复3次。如果PBS正在走出鼻孔插管未按远远不够进入气管或通货膨胀过快发生。备选地，如果肺不充气良好，插管已被推在太多，所以略微撤回。
7. 收集在冰上15毫升管汇集洗涤。
8. 纺于1200×g离心5分钟空域灌洗液，收集上清到1.5毫升管，并在-80℃下冻结。接着，使用上清液（ 即 ，BALF）用于蛋白质，细胞因子，以及用于各种其它生化分析的测量结果。粒料表示从支气管肺泡空间的细胞。
9. 如果基于颜色的红血细胞（红细胞）是在细胞沉淀明显，溶胞用1ml ACK裂解缓冲液中进行1分钟，然后加入5毫升1×PBS中的停止裂解反应和稀释缓冲液中。处理所有标本相同，无论是处理或不ACK裂解液。
10. 自旋的细胞以1200 xg离心5分钟，倒出上清液，并且使细胞上于1ml 1×PBS中。
11. 涡街流量计和计数细胞的总空域细胞计数血球。
12. 基于细胞的密度增加约80-150微升（约80微升的被感染的老鼠和150个为一个天真鼠标）在一个细胞离心离心机滑动室。旋转细胞小号到显微镜玻片后续染色以确定细胞分化的人群。
13. 让细胞干通宵幻灯片上。染色细胞用三污渍（ 如 ，HEMA 3 [见表]）通过浸渍将载玻片在固定剂的7倍，在染色1 9倍，7倍污点2（污渍之间没有漂洗），并使其干燥。染色干燥后，盖玻片幻灯片和手动计数显微镜差异。一般地，中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞容易受到它们的尺寸和核形态区分开来。

4.确定肺癌和周围组织的细菌负荷

1. 开始之前:与900微升1×PBS对肺和脾和90微升1×PBS的血液稀释准备试管。标签板用于培养细菌，并在室温集;因此，一旦组织已收集时间将均质化并镀细菌生长之间被最小化。
   注:由于异构deposi在可与抽吸发生肺部细菌和灰，建议个体小鼠被用于任一总呼吸道细胞结构或总（双边）肺细菌负荷的分析。
2. 安乐死鼠标按步骤3.1和随后收集血液从左心室，放置成肝素管，以避免凝固。除去在含有5ml 1×PBS中，接着除去脾脏和安置的15毫升管所有肺叶和地点于2ml 1×PBS中。试管置于冰上。小心清洁仪器，每个组织/鼠标之间的乙醇。
3. 均化在冰上组织，优选与可以每个样本之间改变支配均化。一次性均质提示可高压灭菌实验之间重用。
4. 一旦组织被匀浆，进行连续稀释和板。按图纸上的塑料分界线在一个单一的TSA板重复给定组织/稀释板样品。电镀和迪lution建议是如下（在所有情况下，10微升样品被涂布在板），并以24小时后的感染尸检。如果分析48-72小时的样品，稀释液的较大的数目可能需要在稍后的时间点，由于增加的细菌负担电镀。
   1. 血液 - 加入10微升的血液进入90微升无菌1X PBS的稀释1:10。板整齐重复1:10稀释样品。一旦血液已被镀，9300 xg离心旋转残留血液10分钟，以对细胞因子和趋化因子的测量中提取血浆。
   2. 加入100微升肺匀浆入900微升无菌1X PBS的连续100:肺 - 1 - 稀释1:10。板整齐匀浆重复所有稀释。
   3. 加入100微升匀浆脾为900微升无菌1X PBS的连续100: - 对于脾虚稀释1:10-1。板整齐匀浆一式两份都稀释。
5. 允许传播样品简单干。
6. 倒置TSA平板及地点在静态37℃培养箱中过夜。
7. 通过平均从板的两侧，并从各稀释的细菌菌落确定定植细菌的数量。在5毫升的肺和2毫升脾的初始稀释度因子，以确定总组织的CFU。

Results

C57BL / 6小鼠被感染K的2000 CFU 肺炎 43816（2型），通过口咽部吸入肺。在这个剂量，一般老鼠开始出现临床症状12-24小时后感染，包括嗜睡，皱皮，体重减轻5％-10％（ 图2A）的。内48-72小时感染后，许多小鼠表明，通常是由平均20％的重量损失和结果的在具有降低活性驼背姿势之前和响应减少到刺激疾病和发病的症状。更长的持续时间的研究中，可能需要K的低剂量肺炎 。感染K. 500 CFU 肺炎导致较温和的疾病峰值3-5ð感染后，其特点是有恢复和体重增加开始由5-6天（ 图2B）的重量损失10-15％。体重是经常预测的生存，以20％的稀有的重量损失LY与恢复相关。

宿主反应的最终成功可能存活研究，其中小鼠10-14天为濒死的迹象，如最小的响应，以触觉刺激和/...

Discussion

细菌性肺炎小鼠模型，用基因靶向和体内生物和药物干预合作，提供了重要的见解肺宿主防御反应。伟大的进步特别是取得我们的支配中性粒细胞招募到受感染空域^10,11趋化因子和粘附分子的理解。 体内肺炎模型，不同于基于细胞或替代办法，还提供了关键洞察内分泌被感染的肺和其他器官，如肝脏（急性期反应）之间发生的通信¹²和肾上腺（应力糖皮质激素^）13。最后，由体内肺炎模型揭示了一个重要和临床高度相关的一点是，成功的病原体清除不等于主机的成功。在许多情况下，一个overexuberant免疫反应可导致宿主死亡由于过度的旁观者肺损伤，甚至在成功的病原体清除^8,14的脸。鉴于此，病原体清除和免疫反应的平行测量通常最翔实，并可能最终需要存活研究以显示主机的综合韧性。

这里，我们已经通过抽吸描述了一个简单和非侵入性的方法用于递送细菌对鼠肺。相比雾化，这种方法执行学习人员的呼吸曝光下潜在风险，提供了高浓缩的接种物递送至肺深部，并通过眼和上呼吸道的免疫应答避免潜在的混杂。鼻...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
肺炎克雷伯菌，血清型 2	ATCC	43816
胰蛋白酶大豆汤	Becton Dickenson	211825
Excel Safelet IV 导管，18 G x 1 1/4"	Claflin 医疗设备	MEDC-031122
Hema 3 解决方案 1	Fisher	23-122-937
Hema 3 解决方案 2	Fisher	23-122-952
Hema 3 固定剂	Fisher	23-122-929
27½ 量规结核菌素注射器	Fisher	14-826-87
肝素锂血浆收集器	Fisher	2675187
L 形一次性铺展器	实验室科学	DSC
1x PBS，pH 7.4	内部制备	n/a	蒸馏水 （5 L）、NaCl （40 g）、KCl （1 g）、Na2HPO4 （5.75 g）、KH2PO4 （1 g）
ACK 裂解缓冲液		n/a	NH4Cl （4.145 g）、KHCO3 （0.5 g）、EDTA （18.6 mg），用蒸馏水和 pH 值至 7.4 加热至 500 ml