文献中已描述了多种在小鼠中建立细菌性肺炎模型的方法。本文介绍一种非侵入性、低成本且快速的方法，通过将细菌接种物滴加至口咽部，使其吸入（即，经气道吸入）以诱导肺炎。同时详细阐述了用于评估肺部固有免疫反应的后续检测方法。
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本文内容
摘要
摘要
尽管社区获得性肺炎仍然是一个重大的公共卫生问题，但近年来，小鼠细菌性肺炎模型极大地推动了我们对潜在细胞和分子发病机制的临床前研究进展。体内小鼠模型能够整合反映宿主防御反应的生理过程和抗病能力，这是其他简化的体外方法所无法揭示的。文献中已报道了多种将细菌接种至小鼠肺内的方法，包括气溶胶化、鼻内给药、“盲法”或可视化条件下的经口气管插管，以及经皮气管插管。这些方法各有优缺点。本文中，我们详细描述一种非侵入性、技术要求低、成本低廉且快速的气管内给菌方法，即在小鼠全身麻醉状态下，将感染性接种物滴入其口咽部，使其通过自主吸气（i.e.，吸入）进入肺内。该方法可用于递送多种非腐蚀性的生物和化学物质，且相对容易掌握，即使对先前缺乏肺部操作经验的实验室而言也是如此。除了介绍这种吸入性肺炎建模方法外，我们还提供了后续评估小鼠体内肺部固有免疫反应的分步操作流程，特别是定量细菌清除能力以及感染气道中细胞免疫反应的方法。这种整合性且简便的肺炎评估方法，可快速、可靠地评价遗传和环境干预对肺部固有免疫的影响。
引言
社区获得性肺炎仍然是美国感染相关死亡的首要原因，尽管过去40年中疫苗接种和抗生素治疗策略有所改进，但总体死亡率几乎没有变化1,2。尽管在公共卫生层面尚未看到明显进展，但近年来在肺炎分子和细胞致病机制方面的认识已取得显著进展，其中许多进展得益于小鼠肺部感染模型的应用。小鼠的遗传可操作性、小鼠与人类免疫系统的相似性，以及大量 commercially available 针对小鼠的免疫学试剂，共同推动了该领域的快速发展。
文献中描述的细菌性肺炎小鼠模型通常依赖于四种病原体接种技术途径之一：i）气溶胶化；ii）经鼻给药；iii）经口给药；以及 iv）手术经气管注射（即，气管切开术）3。所有感染途径均各有优缺点3。特别是，上呼吸道的相对暴露程度、口鼻部正常菌群混入的可能性、全身麻醉的需求、递送至远端肺部的接种剂量的变异性、病原体在肺叶中的分布情况、技术操作的熟练程度要求以及操作相关发病率等方面，这些方法之间存在显著差异。
常用的经口感染技术包括经气管（经喉）插管，可通过“盲法”（非可视化）途径或在直接喉部可视化下进行3-5。这两种方法虽然可靠，但均需要大量培训，且存在上呼吸道损伤的风险。在本报告中，我们描述了一种技术上不复杂、非侵入性、低成本且快速的经口感染方法：将细菌（例如中提供的为Klebsiella pneum....
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方案
所有实验均在通过国家环境卫生科学研究所动物护理与使用委员会审查后，依照《动物福利法》和美国公共卫生服务政策中关于实验动物人道护理与使用的相关规定进行。
1. 准备 K. pneumoniae 培养
注意：所有步骤均须在生物安全二级（BSL2）生物安全柜或其他指定的生物安全二级区域中进行，并按照机构的生物安全二级指南处理废弃物。
- 用于悬浮培养生长 K. pneumoniae，解冻一管甘油保存的菌种，通过转移1 ml至培养基中接种工作菌液 K. pneumoniae 将菌种接种至50 ml胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，置于500 ml或更大体积的烧瓶内。
- 通过向900 µl对数生长期培养物中加入甘油制备甘油菌种保存液 K. pneumoniae 加入100 µl无菌甘油，于-20 °C或-80 °C冷冻保存。长期保存建议使用-80 °C。
- 从1.1步骤中取细菌培养物，在37 °C、200-225 rpm条件下振荡培养过夜（14-18小时）。为促进对数生长期的生长，于次日早晨将1-5 ml该过夜培养物转接至含有50 ml TSB的三角瓶中，37 °C振荡培养约2.5小时。
- 转移1 ml的 K. pneumoniae 将上一步的培养物转移至1.5 ml离心管....
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结果
通过经口咽部吸入的方式，将2000 CFU的K. pneumoniae 43816（血清型2）感染至C57BL/6小鼠肺部。在此剂量下，小鼠通常于感染后12–24小时开始出现临床症状，包括嗜睡、毛发竖立以及5–10%的体重下降（图2A）。感染后48–72小时内，许多小鼠表现出疾病和病态症状，通常在出现症状前平均体重已下降20%，并表现为蜷缩姿势、活动减少以及对刺激反应性降低。若需进行更长时间的研究，可能需要使用较低剂量的K. pneumoniae。以500 CFU的K. pneumoniae感染可导致较轻的疾病，症状在感染后3–5天达到高峰，表现为10–15%的体重下降，并于第5–6天开始恢复并逐渐增重（图2B）。体重变化常可预测存活情况，体重下降达20%时极少能恢复。
宿主应答的最终效果可能通过生存研究得到最佳体现，其中小鼠被监测.......
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讨论
细菌性肺炎的小鼠模型结合基因靶向技术 体内 生物和药理学干预手段为深入了解肺部宿主防御反应提供了关键见解，尤其在调控中性粒细胞向感染气道募集的趋化因子和黏附分子方面取得了显著进展10,11. 在体 肺炎模型与基于细胞或其他替代方法不同，还为感染肺部与其他器官（如肝脏，急性期反应）之间发生的内分泌通讯提供了关键见解。12 和肾上腺（应激性糖皮质激素）13最后，一个关键且具有重要临床意义的发现是 体内 肺炎模型的一个关键点在于，成功的病原体清除并不等同于宿主的最终成功。在许多情况下，即使病原体被有效清除，过于强烈的免疫反应仍可能因过度的旁观者肺损伤而导致宿主死亡。8,14因此，同时检测病原体清除情况和免疫反应通常最具信息量，而最终可能需要通过生存研究来揭示宿主的整体抗病能力。
本文介绍了一种通过经口吸入方式将细菌递送至小鼠肺部的简单且非侵入性方法。与气溶胶化方法相比，该方法对研究人员的呼吸道暴露风险较低，可将更高浓度的接种物递送至深部肺组织，并避.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作部分由美国国立卫生研究院环境健康科学研究所的院内研究计划（Z01 ES102005）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 肺炎克雷伯菌，2型血清型 | ATCC | 43816 | |
| 胰蛋白胨大豆肉汤 | Becton Dickenson | 211825 | |
| Excel Safelet IV 导管，18 G × 1 1/4" | Claflin 医疗设备公司 | MEDC-031122 | |
| Hema 3 溶液 1 | Fisher | 23-122-937 | |
| Hema 3 溶液 2 | Fisher | 23-122-952 | |
| Hema 3 固定液 | Fisher | 23-122-929 | |
| 27½ 号结核菌素注射器 | Fisher | 14-826-87 | |
| 锂肝素血浆采集管 | Fisher | 2675187 | |
| L型一次性涂布棒 | Lab Scientific | DSC | |
| 1× PBS，pH 7.4 | 实验室自制 | n/a | 蒸馏水（5 L）、NaCl（40 g）、KCl（1 g）、Na2HPO4（5.75 g）、KH2PO4（1 g） |
| ACK 裂解缓冲液 | 实验室自制 | n/a | NH4Cl（4.145 g）、KHCO3（0.5 g）、EDTA（18.6 mg），加蒸馏水至 500 ml，调 pH 至 7.4 |
参考文献
- Mizgerd, J. P. Acute lower respiratory tract infection. N Engl J Med. 358 (7), 716-727 (2008).
- Waterer, G. W., Rello, J., Wunderink, R. G. Management of community-acquired pneumonia in adults. Am J Respir Crit Care Med. 183 (2), 157-164 (2011).
- Mizgerd, J. P., Skerrett, S. ....
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