在小鼠实验为细菌性肺炎的诱导和表型非侵入性和技术上非密集型方法

Summary

几种方法已在文献中的小鼠模型细菌性肺炎进行了描述。在此，我们描述了用于通过移液到口咽细菌接种物的抽吸（ 即 ，吸入）诱导肺炎的非侵入性的，廉价的，快速的方法。对于肺先天免疫应答的评估下游方法也是详细说明。

Abstract

虽然社区获得性肺炎仍然是一个重大的公共卫生问题，细菌性肺炎小鼠模型中我们底层的细胞和分子发病机制的认识，最近促进显著临床进展。 在活体小鼠模型捕捉宿主防御反应的综合生理和弹性的方式不被替代的，简化的离体方法揭示。几种方法已在文献中小鼠细菌肺内接种，包括雾化，鼻内递送，"盲"和可视化的条件下经口气管插管，和经皮气管插管进行了描述。所有的方法都具有相对的优点和局限性。这里，我们详细描述用于细菌的气管内递送，通过鼠标涉及抽吸（ 即 ，吸入）的非侵入性的，在技术上不密集的，廉价且快速的方法的同时，在全身麻醉下吸移到口咽感染接种物。这种方法可用于各种各样的无腐蚀性生物和化学制剂的肺递送，并且相对容易学习，即使对于肺程序最小先前经验的实验室。除了描述的吸入性肺炎的方法，我们也用于测定随后在体内小鼠的肺先天免疫反应，特别是提供一步一步的程序，用于量化细菌清除和感染呼吸道的细胞免疫应答的方法。这种集成和简单的肺炎评估方法允许的遗传和环境操纵在肺先天免疫效果快速和强大的评估。

Introduction

社区获得性肺炎仍然感染在美国死亡的主要原因，死亡率在过去40年，尽管在接种疫苗的改进和抗生素的战略^1,2整体变化不大。尽管在公共卫生水平缺乏可察觉进展，近年来引人注目的进展已在我们的肺炎的分子和细胞发病机理的理解制成，具有许多的向前通过使用肺部感染的小鼠模型成为可能这些步骤。小鼠的遗传易处理性，鼠和人的免疫系统，和鼠靶向免疫试剂繁多，已成为商用的相似性都共同促进该领域的快速进步。

在文献中描述的细菌性肺炎的小鼠模型一般在四种情况之一的技术路线依赖于病原体接种:ⅰ）雾化; II）INTRanasal交付; III）口服交货;和iv）手术气管内注射（ 即气管切开术^）3。感染的所有路线各有优缺点^3。在上气道的特定，相对曝光，电位为口鼻菌群，对于全身麻醉要求的混合，递送至远端肺接种，的递送病原体大叶性肺炎分布，技术专长的要求，和程序的发病率的变异性在这些广泛地变化的方法。

常用的口服感染技术包括通过无论是"瞎子"（非可视）的方式，或直接在可视化喉气管^{3-5（translaryngeal）}插管。这两种方法，而健壮的，需要大量的训练，还可以携带创伤的风险的上气道。在本报告中，我们描述了经口感染的一个技术上的非密集，非侵入性的，廉价且快速的方法，W特此细菌（ 肺炎在所提供的示例克雷伯 ）吸移到麻....

Protocol

所有实验均按照动物福利法和人文关怀和实验动物的使用美国公共卫生服务政策审核后，由动物护理和NIEHS的使用委员会进行。

1. K.的制备肺炎文化

注意:执行在生物安全2级（BSL2）罩或其他BSL2指定区域的所有步骤，并丢弃每个学院BSL2指引浪费。

1. 对于K的悬浮生长肺炎 ，细菌解冻的甘油和转移1毫升K的接种工作文化肺炎库存到在500毫升或更大烧瓶50毫升胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）组成。
2. 通过加入900微升培养数期克雷伯使甘油原液肺炎至100μl无菌甘油中，并在-20℃或-80℃冷冻。对于长期储存，建议-80℃。
3. 从文化的细菌由隔夜摇瓶TEP 1.1 - 在37℃下在200-225 rpm.In为了促进对数期生长（14 18小时），稀1-5毫升此过夜培养的成含50ml TSB在早晨烧瓶中并放回在37℃下振摇〜2.5小时。
4. 转移1毫升K的从最后一步到1.5ml试管和自旋经7,500×g离心2分钟肺炎培养。白色颗粒应该是可见的。不干扰沉淀除去上清液，轻轻地用移液管在1毫升的无菌盐水的悬浮细菌和7,500 xg离心再次旋转2分钟。
   1. 执行此清洗步骤2倍，造就了决....

Results

C57BL / 6小鼠被感染K的2000 CFU 肺炎 43816（2型），通过口咽部吸入肺。在这个剂量，一般老鼠开始出现临床症状12-24小时后感染，包括嗜睡，皱皮，体重减轻5％-10％（ 图2A）的。内48-72小时感染后，许多小鼠表明，通常是由平均20％的重量损失和结果的在具有降低活性驼背姿势之前和响应减少到刺激疾病和发病的症状。更长的持续时间的研究中，可能需要K的低剂量肺炎 。感染K. 500 CFU 肺炎导致较温和的疾病峰值3-5ð感染后，其特点是有恢复和体重增加开始由5-6天（ 图2B）的重量损失10-15％。体重是经常预测的生存，以20％的稀有的重量损失LY与恢复相关。

宿主反应的最终成功可能存活研究，其中小鼠10-14天为濒死的迹象，如最小的响应，以触觉刺激和/.......

Discussion

细菌性肺炎小鼠模型，用基因靶向和体内生物和药物干预合作，提供了重要的见解肺宿主防御反应。伟大的进步特别是取得我们的支配中性粒细胞招募到受感染空域^10,11趋化因子和粘附分子的理解。 体内肺炎模型，不同于基于细胞或替代办法，还提供了关键洞察内分泌被感染的肺和其他器官，如肝脏（急性期反应）之间发生的通信¹²和肾上腺（应力糖皮质激素^）13。最后，由体内肺炎模型揭示了一个重要和临床高度相关的一点是，成功的病原体清除不等于主机的成功。在许多情况下，一个overexuberant免疫反应可导致宿主死亡由于过度的旁观者肺损伤，甚至在成功的病原体清除^8,14的脸。鉴于此，病原体清除和免疫反应的平行测量通常最翔实，并可能最终需要存活研究以显示主机的综合韧性。

这里，我们已经通过抽吸描述了一个简单和非侵入性的方法用于递送细菌对鼠肺。相比雾化，这种方法执行学习人员的呼吸曝光下潜在风险，提供了高浓缩的接种物递送至肺深部，并通过眼和上呼吸道的免疫应答避免潜在的混杂。鼻.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
肺炎克雷伯菌，血清型 2	ATCC	43816
胰蛋白酶大豆汤	Becton Dickenson	211825
Excel Safelet IV 导管，18 G x 1 1/4"	Claflin 医疗设备	MEDC-031122
Hema 3 解决方案 1	Fisher	23-122-937
Hema 3 解决方案 2	Fisher	23-122-952
Hema 3 固定剂	Fisher	23-122-929
27½ 量规结核菌素注射器	Fisher	14-826-87
肝素锂血浆收集器	Fisher	2675187
L 形一次性铺展器	实验室科学	DSC
1x PBS，pH 7.4	内部制备	n/a	蒸馏水 （5 L）、NaCl （40 g）、KCl （1 g）、Na2HPO4 （5.75 g）、KH2PO4 （1 g）
ACK 裂解缓冲液		n/a	NH4Cl （4.145 g）、KHCO3 （0.5 g）、EDTA （18.6 mg），用蒸馏水和 pH 值至 7.4 加热至 500 ml