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一种用于小鼠实验性细菌性肺炎诱导与表型分析的非侵入性且技术简便的方法

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DOI：

10.3791/54508

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2016年9月28日

 , 
1Immunity, Inflammation and Disease Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS), National Institutes of Health

本文内容

摘要

文献中已描述了多种在小鼠中建立细菌性肺炎模型的方法。本文介绍一种非侵入性、低成本且快速的方法，通过将细菌接种物滴加至口咽部，使其吸入（即，经气道吸入）以诱导肺炎。同时详细阐述了用于评估肺部固有免疫反应的后续检测方法。

摘要

尽管社区获得性肺炎仍然是一个重大的公共卫生问题，但近年来，小鼠细菌性肺炎模型极大地推动了我们对潜在细胞和分子发病机制的临床前研究进展。体内小鼠模型能够整合反映宿主防御反应的生理过程和抗病能力，这是其他简化的体外方法所无法揭示的。文献中已报道了多种将细菌接种至小鼠肺内的方法，包括气溶胶化、鼻内给药、“盲法”或可视化条件下的经口气管插管，以及经皮气管插管。这些方法各有优缺点。本文中，我们详细描述一种非侵入性、技术要求低、成本低廉且快速的气管内给菌方法，即在小鼠全身麻醉状态下，将感染性接种物滴入其口咽部，使其通过自主吸气（i.e.，吸入）进入肺内。该方法可用于递送多种非腐蚀性的生物和化学物质，且相对容易掌握，即使对先前缺乏肺部操作经验的实验室而言也是如此。除了介绍这种吸入性肺炎建模方法外，我们还提供了后续评估小鼠体内肺部固有免疫反应的分步操作流程，特别是定量细菌清除能力以及感染气道中细胞免疫反应的方法。这种整合性且简便的肺炎评估方法，可快速、可靠地评价遗传和环境干预对肺部固有免疫的影响。

引言

社区获得性肺炎仍然是美国感染相关死亡的首要原因，尽管过去40年中疫苗接种和抗生素治疗策略有所改进，但总体死亡率几乎没有变化1,2。尽管在公共卫生层面尚未看到明显进展，但近年来在肺炎分子和细胞致病机制方面的认识已取得显著进展，其中许多进展得益于小鼠肺部感染模型的应用。小鼠的遗传可操作性、小鼠与人类免疫系统的相似性，以及大量 commercially available 针对小鼠的免疫学试剂，共同推动了该领域的快速发展。

文献中描述的细菌性肺炎小鼠模型通常依赖于四种病原体接种技术途径之一：i）气溶胶化；ii）经鼻给药；iii）经口给药；以及 iv）手术经气管注射（即，气管切开术）3。所有感染途径均各有优缺点3。特别是，上呼吸道的相对暴露程度、口鼻部正常菌群混入的可能性、全身麻醉的需求、递送至远端肺部的接种剂量的变异性、病原体在肺叶中的分布情况、技术操作的熟练程度要求以及操作相关发病率等方面，这些方法之间存在显著差异。

常用的经口感染技术包括经气管（经喉）插管，可通过“盲法”（非可视化）途径或在直接喉部可视化下进行3-5。这两种方法虽然可靠，但均需要大量培训，且存在上呼吸道损伤的风险。在本报告中，我们描述了一种技术上不复杂、非侵入性、低成本且快速的经口感染方法：将细菌（例如中提供的为Klebsiella pneumoniae）移液至麻醉小鼠的口咽部，通过吸入（即，吸气）将其输送至肺部。我们及其他研究者已成功应用吸入性肺炎模型6-9。这种多功能且易于掌握的肺部递送方法可拓展用于向肺部递送多种非腐蚀性物质，包括细胞因子及其他蛋白质、病原体相关分子（例如，脂多糖）、细胞（即，过继性转移）以及毒素（例如，博来霉素）。除了讨论重要的技术要点外，我们还描述了一种综合性的定量方法，用于评估肺炎后的宿主反应，包括后续细菌清除情况的测定（即，肺组织及外周器官中的菌落形成单位[CFU]定量）以及气腔内白细胞的积聚情况。

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方案

所有实验均在通过国家环境卫生科学研究所动物护理与使用委员会审查后，依照《动物福利法》和美国公共卫生服务政策中关于实验动物人道护理与使用的相关规定进行。

1. 准备 K. pneumoniae 培养

注意：所有步骤均须在生物安全二级（BSL2）生物安全柜或其他指定的生物安全二级区域中进行，并按照机构的生物安全二级指南处理废弃物。

  1. 用于悬浮培养生长 K. pneumoniae，解冻一管甘油保存的菌种，通过转移1 ml至培养基中接种工作菌液 K. pneumoniae 将菌种接种至50 ml胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，置于500 ml或更大体积的烧瓶内。
  2. 通过向900 µl对数生长期培养物中加入甘油制备甘油菌种保存液 K. pneumoniae 加入100 µl无菌甘油，于-20 °C或-80 °C冷冻保存。长期保存建议使用-80 °C。
  3. 从1.1步骤中取细菌培养物，在37 °C、200-225 rpm条件下振荡培养过夜（14-18小时）。为促进对数生长期的生长，于次日早晨将1-5 ml该过夜培养物转接至含有50 ml TSB的三角瓶中，37 °C振荡培养约2.5小时。
  4. 转移1 ml的 K. pneumoniae 将上一步的培养物转移至1.5 ml离心管中，以7,500 × g离心2 min。应可见白色沉淀。小心移除上清液，避免扰动沉淀，用移液器将细菌轻轻重悬于1 ml无菌生理盐水中，再次以7,500 × g离心2 min。
    1. 重复此洗涤步骤两次，最后将洗涤后的沉淀重悬于1 ml无菌生理盐水中。
  5. 对该原液接种物进行对数级倍比稀释。例如，将400 µl接种物依次加入3.6 ml无菌生理盐水中，制成10⁻¹稀释液-1-10-9 稀释系列
  6. 测定 OD600 洗涤后的 K. pneumoniae 通过将1:10和1:100稀释液各1 ml加入一次性比色皿中，测定其OD值600，先用无菌生理盐水封闭。测量重复样本来确保准确性。OD600 1.0 大致相当于 4-7 x 108 CFU/ml。请注意，OD 与 CFU/ml 之间的关系可能并非线性。
    1. 使用 OD600 从稀释液中计算浓度 肺炎克雷伯菌， 应用上述 OD:CFU/ml 转换关系，并计入稀释倍数。
  7. 使用 K. pneumoniae 浓度，以制备所需接种量的CFU剂量 <小鼠给药体积为100 µl（见下文）。
  8. 同时接种 100 µl 的 10-6-10-9 稀释后，取100 µl无菌生理盐水分别接种于胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）平板，在室温下进行。37 °C过夜培养后，计数细菌菌落，以计算实验中使用的准确浓度并检测污染情况。
    注意：最终接种液的实际细菌浓度可能比通过吸光度预测的值高或低 ± 500 CFU/ml。实验人员应 ideally 确认 OD600：在使用前通过预实验确定CFU/ml的关系 体内 在小鼠中，通过实验经验重新调整光密度（OD）600：根据个人经验进行CFU/ml换算。

2. 小鼠经口咽部吸入K. pneumoniae的气管内接种

  1. 确保小鼠通过尾部标记、纹身或其他经批准的标识方法进行唯一标识。
  2. 使用P200移液器在将小鼠移出异氟烷前预先吸取细菌接种剂量，以加快操作流程。为获得最佳气管内滴注效果，应使用以下体积： <100 µl 以防止溢出。此处使用 2000 CFU/50 µl 的 K. pneumoniae.
  3. 在透明麻醉舱中使用异氟烷气体对小鼠进行麻醉（例如，2% 异氟烷，流速为 1 L/min）或根据机构指南进行。同时麻醉的小鼠数量由实验者的操作舒适度决定，通常为 1–2 只 每次一只。观察呼吸，当出现深呼吸且呼吸间隔可达2-3秒时，确认麻醉深度。
    注意：如果存在挥发性（吸入性）麻醉剂可能产生混杂效应的顾虑，可改用腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪进行麻醉。采用上述方法时，深度麻醉仅持续数分钟。若实施更长时间的麻醉，应使用眼膏以防止眼球干燥。
  4. 小鼠麻醉后，将其置于半卧位仰卧姿势，用套在倾斜有机玻璃板钉子间的橡胶带钩住上颌门齿以固定图1).
  5. 用一对钝头无齿镊子轻轻将小鼠舌头拉向一侧，使用P200移液器将剂量注入口腔内。操作时需格外小心，避免对舌头或口咽部造成损伤。
  6. 在保持舌头后缩的同时，用戴着手套的手指轻轻闭合小鼠的鼻孔，直至其开始吸气。持续遮盖鼻孔，直到小鼠完成两次或更多次吸气，且口腔内无可见液体为止。由于小鼠为 obligate nose breather（ obligate nose breather），遮盖鼻孔有助于确保细菌被吸入肺部。
  7. 将小鼠从接种板上取下并放回笼中，将其置于仰卧位，以防止在小鼠从麻醉中恢复期间垫料或碎屑堵塞鼻孔。
  8. 所有小鼠给药并从麻醉中苏醒后，将小鼠饲养于独立的隔间或房间内，且该空间仅容纳接受过相同药物处理的小鼠 肺炎克雷伯菌 每天监测小鼠，若感染后时间超过48小时，需包括体重测量。
  9. 若让小鼠超过48小时，需每日进行垫料搅拌和/或提供辅助加热。

3. 支气管肺泡灌洗液（BALF）的采集与分析

  1. 根据机构指南对小鼠实施安乐死。此处使用每千克体重150 mg的戊巴比妥钠致死剂量注射 戊巴比妥钠  或商业安乐死溶液的等效剂量 随后进行放血，以避免与CO相关的肺部可能并发症2 吸入麻醉和颈椎脱位
  2. 将小鼠仰卧放置，用70%乙醇喷洒其毛发进行消毒，尤其注意胸部和颈部区域。
  3. 在胸骨下方做一个纵向切口，然后用镊子夹住胸骨，切开膈肌，使肺部回缩至胸腔内。沿血管两侧向上切开胸腔，再沿颈部向上切开，暴露气管。
  4. 由于气管两侧均有纵行肌肉环绕，应小心沿中线剪开，并将组织向两侧推开，以避免损伤周围血管，防止血液进入气管。若不慎损伤血管，需在进入气管腔之前，先用纱布清洁周围区域。
  5. 从头部向下约¼处用手术剪或针头在气管上剪开一个小口，将连接预先装有1 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）注射器的套管沿尾侧方向插入气管。若使用小鼠 <8周龄或雌性小鼠，灌洗液体积减少至600–800 µl。
  6. 缓慢将液体推入肺部，使所有肺叶充分膨胀，然后用注射器回抽液体，重复此操作3次。若 PBS 从鼻孔流出，说明套管插入气管的深度不足，或灌注速度过快。若肺部膨胀不良，则可能是套管插入过深，应稍作回撤。
  7. 将收集的洗涤液置于冰上，用15 ml离心管收集。
  8. 以1,200 × g离心空气灌洗液5分钟，收集上清液至1.5 ml离心管中，并于-80 °C冻存。随后使用该上清液（即支气管肺泡灌洗液（BALF）用于蛋白质、细胞因子及多种其他生化检测。沉淀物代表来自支气管肺泡腔的细胞。
  9. 如果根据颜色判断细胞沉淀中存在红细胞（RBCs），则用1 ml ACK裂解缓冲液裂解1分钟，随后加入5 ml 1×PBS以终止裂解反应并稀释缓冲液。所有样本均应进行相同处理，无论是否使用ACK裂解缓冲液。
  10. 以 1,200 x g 离心 5 分钟，弃去上清液，将细胞重悬于 1 ml 1x PBS 中。
  11. 涡旋混匀并在血细胞计数板上对细胞进行计数，以测定总气道腔细胞数量。
  12. 根据细胞密度，向细胞离心机的载片腔内加入约 80–150 µl 悬液（感染小鼠约 80 µl，未免疫小鼠约 150 µl）。通过细胞离心将细胞沉淀至显微镜载片，用于后续染色以分析细胞分类群。
  13. 让细胞在载玻片上过夜干燥。用三色染色液对细胞进行染色（例如，Hema 3（见表格）染色：将玻片浸入固定液中7次，染液1中9次，染液2中7次（染色之间无需冲洗），然后晾干。染色干燥后，加盖盖玻片，显微镜下人工计数分类。通常，中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞可根据其大小和核形态 easily 被区分。

4. 测定肺部及外周组织中的细菌载量

  1. 开始前：为肺和脾准备含有900 µl 1x PBS的稀释管，为血液准备含有90 µl 1x PBS的稀释管。标记用于细菌培养的平板并置于室温；这样在组织采集后，可最大限度缩短从匀浆到接种培养之间的时间。
    注意：由于通过吸入途径感染时细菌在肺部的沉积可能不均一，建议每只小鼠仅用于分析总气道细胞数量或总（双侧）肺细菌负荷，二者选其一。
  2. 按照步骤3.1处死小鼠，随后从左心室采集血液，放入肝素抗凝管中以防止凝血。取出所有肺叶并置于含有5 ml 1x PBS的15 ml离心管中，接着取出脾脏并放入含有2 ml 1x PBS的离心管中。将所有样本管置于冰上。每次处理不同组织或小鼠之间，需用乙醇清洁器械。
  3. 在冰上进行组织匀浆，建议使用一次性匀浆器，并在每个样本之间更换。一次性匀浆器头可在实验间经高压灭菌后重复使用。
  4. 组织匀浆完成后，进行系列稀释并接种平板。通过在塑料平板上划线分隔区域，将同一组织/稀释度的样本以复孔形式接种于同一块TSA平板上。以下列出了接种与稀释建议（所有情况下均取10 µl样本涂布于平板），该建议基于感染后24小时的解剖结果。若分析48–72小时的样本，由于后期细菌负荷增加，可能需要接种更多稀释度。
    1. 血液样本：通过将10 µl血液加入90 µl无菌1x PBS中进行1:10稀释。将未稀释样本及1:10稀释样本均以复孔形式接种。血液接种完成后，将剩余血液在9,300 × g离心10分钟，收集上清液用于细胞因子和趋化因子的检测。
    2. 肺组织：将100 µl肺匀浆液依次加入900 µl无菌1x PBS中，进行1:10至1:100的系列稀释。将原始匀浆液及所有稀释液均以复孔形式接种。
    3. 脾组织：将100 µl脾匀浆液依次加入900 µl无菌1x PBS中，进行1:10至1:100的系列稀释。将原始匀浆液及两个稀释度的样本均以复孔形式接种。
  5. 让涂布的样本短暂干燥。
  6. 将TSA平板倒置，放入37 °C静置培养箱中过夜培养。
  7. 通过计算平板两侧菌落的平均值以及各稀释度的数据，确定定植细菌数量。结合肺组织初始体积5 ml、脾组织初始体积2 ml的稀释因素，计算组织中总的菌落形成单位（CFU）。

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结果

通过经口咽部吸入的方式，将2000 CFU的K. pneumoniae 43816（血清型2）感染至C57BL/6小鼠肺部。在此剂量下，小鼠通常于感染后12–24小时开始出现临床症状，包括嗜睡、毛发竖立以及5–10%的体重下降（图2A）。感染后48–72小时内，许多小鼠表现出疾病和病态症状，通常在出现症状前平均体重已下降20%，并表现为蜷缩姿势、活动减少以及对刺激反应性降低。若需进行更长时间的研究，可能需要使用较低剂量的K. pneumoniae。以500 CFU的K. pneumoniae感染可导致较轻的疾病，症状在感染后3–5天达到高峰，表现为10–15%的体重下降，并于第5–6天开始恢复并逐渐增重（图2B）。体重变化常可预测存活情况，体重下降达20%时极少能恢复。

宿主应答的最终效果可能通过生存研究得到最佳体现，其中小鼠被监测...

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讨论

细菌性肺炎的小鼠模型结合基因靶向技术 体内 生物和药理学干预手段为深入了解肺部宿主防御反应提供了关键见解，尤其在调控中性粒细胞向感染气道募集的趋化因子和黏附分子方面取得了显著进展10,11. 在体 肺炎模型与基于细胞或其他替代方法不同，还为感染肺部与其他器官（如肝脏，急性期反应）之间发生的内分泌通讯提供了关键见解。12 和肾上腺（应激性糖皮质激素）13最后，一个关键且具有重要临床意义的发现是 体内 肺炎模型的一个关键点在于，成功的病原体清除并不等同于宿主的最终成功。在许多情况下，即使病原体被有效清除，过于强烈的免疫反应仍可能因过度的旁观者肺损伤而导致宿主死亡。8,14因此，同时检测病原体清除情况和免疫反应通常最具信息量，而最终可能需要通过生存研究来揭示宿主的整体抗病能力。

本文介绍了一种通过经口吸入方式将细菌递送至小鼠肺部的简单且非侵入性方法。与气溶胶化方法相比，该方法对研究人员的呼吸道暴露风险较低，可将更高浓度的接种物递送至深部肺组织，并避...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作部分由美国国立卫生研究院环境健康科学研究所的院内研究计划（Z01 ES102005）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
肺炎克雷伯菌，2型血清型ATCC43816
胰蛋白胨大豆肉汤Becton Dickenson211825
Excel Safelet IV 导管，18 G × 1 1/4"Claflin 医疗设备公司MEDC-031122
Hema 3 溶液 1Fisher23-122-937
Hema 3 溶液 2Fisher23-122-952
Hema 3 固定液Fisher23-122-929
27½ 号结核菌素注射器Fisher14-826-87
锂肝素血浆采集管Fisher2675187
L型一次性涂布棒Lab ScientificDSC
1× PBS，pH 7.4实验室自制n/a蒸馏水（5 L）、NaCl（40 g）、KCl（1 g）、Na2HPO4（5.75 g）、KH2PO4（1 g）   
ACK 裂解缓冲液实验室自制n/aNH4Cl（4.145 g）、KHCO3（0.5 g）、EDTA（18.6 mg），加蒸馏水至 500 ml，调 pH 至 7.4

参考文献

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