从冷冻研磨的哺乳动物细胞中进行蛋白质复合物亲和捕获

摘要

本文描述了在低温条件下通过固态研磨破碎哺乳动物细胞，从所得细胞粉末制备细胞提取物，并利用抗体偶联的微米级顺磁性珠进行亲和捕获以分离目标蛋白复合物的实验方案。

摘要

亲和捕获是一种用于分离内源性蛋白质复合物以进行后续研究的有效技术。当该技术与抗体联用时，通常也被称为免疫沉淀。亲和捕获既可用于常规实验规模，也可应用于高通量研究中。当与蛋白质质谱联用时，亲和捕获已成为相互作用组分析中的核心技术手段。尽管该技术各步骤可能存在多种实现方式，但以下方案采用的是我们偏好的方法，其中有两个显著特点：使用冷冻研磨的细胞粉末制备细胞提取物，以及采用抗体偶联的顺磁性微珠作为亲和介质。在许多情况下，我们获得的结果优于采用更传统的亲和捕获方法所得结果。冷冻研磨可避免其他细胞破碎方式带来的诸多问题，能够高效破碎样品，同时避免因加热或起泡导致的蛋白质变性。该方法可在提取前保持天然的蛋白质浓度，减轻大分子复合物的解离；减少提取后蛋白质在溶液中的暴露时间，从而限制有害的酶活性，并可能降低蛋白质对亲和介质的非特异性吸附。近年来，微米级磁性亲和介质日益普及，正逐步取代传统的琼脂糖和Sepharose基质介质。磁性介质的主要优势包括：通常具有更低的非特异性蛋白质吸附；由于蛋白质复合物结合发生在微珠表面而非孔隙内部，因此不存在排阻尺寸限制；并且可通过磁铁实现简便的操作与处理。

引言

本方案的典型应用是稳定并高效、高纯度地获得内源性蛋白质复合物，用于相互作用组学表征¹。目前公认，主要由蛋白质组成的稳定结合与瞬时结合的大分子复合物所构成的动态网络，协调调控着细胞的各种生命活动^2,3。尽管存在多种用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的实验方法，亲和捕获法仍是分离和解析生理状态下蛋白质复合物最广泛使用的技术之一^4-6。此外，该技术的优势在于能够获得以实体形式存在的大分子复合物，而不仅仅是检测信号中的数据点；因此，所获得的复合物可进一步用于多种下游生化、酶学及结构分析实验^7-9。本文所述实验方案的建立，旨在满足绘制蛋白质-蛋白质相互作用网络、并阐明大分子复合物作为细胞生物学效应分子功能的需求。方案详细描述了其在培养的哺乳动物细胞中的应用，但经过适当的体系特异性优化后，同样适用于多种生物样本。

亲和捕获技术的历史可追溯到20世纪初，最早的免疫亲和层析实验——类似于如今通常所说的免疫沉淀（IP）——在20世纪50年代初便已见于文献。该技术的广泛应用从本世纪初一直发展至今^10-13。过去四十年中，众多细胞与分子生物学研究采用了在低温条件下通过研磨实现细胞机械破碎的方法^14-19；而利用（超）顺磁性微珠进行分子分离的技术在过去二十年中也日益普及²⁰。将这些不同技术相结合，能够协同提升蛋白质复合物亲和捕获实验的结果质量¹，这一点已由我们团队及更广泛的研究群体所发表的大量研究成果所证实^{7,9,11,18,19,21-23}。支持性结果见图1。

有效实施亲和捕获实验的相关注意事项与考虑因素可参见参考文献¹通常，这种方法最适合用于：（I）鉴定目标蛋白的相互作用蛋白， 即， 使用蛋白质质谱法（MS）鉴定此前未知的共纯化蛋白质（探索性分析）；（II）检测特定相互作用伴侣的存在， 即， 使用质谱（MS）或蛋白质印迹法（Western blot）检测与目标蛋白相互作用的特定蛋白或有限数量的蛋白（假设验证）；或（III）制备含有目标蛋白的内源性组装蛋白复合物，用于后续其他技术的深入研究（制备性处理）。在开展亲和捕获实验之前，必须具备高质量的亲和试剂，该试剂能够结合目标蛋白，通常为针对天然目标蛋白的免疫沉淀兼容抗体，或针对融合蛋白所带标签的抗体。同时，必须建立适当的实验检测方法：蛋白质的一般染色（如SDS-PAGE后的考马斯亮蓝、Sypro Ruby或银染）、蛋白质印迹法以及蛋白质质谱分析，均常与亲和捕获技术联合使用。¹. 本方案采用抗体偶联的磁珠作为亲和介质。尽管亲和介质的功能可在仅包含少量实验参数的初步测试中进行验证，但为了获得最佳结果，每个实验均需进行经验性优化。^1,11,24方案分为三个 distinct 阶段：（1）冷冻细胞材料的制备；（2）在低温条件下通过固态研磨破碎细胞；（3）使用抗体偶联的超顺磁性微珠进行蛋白质提取与亲和捕获。

方案

1. 细胞收获与冻存

1. 在适当的培养条件下培养目标细胞系，获得1-8克细胞材料^25,26. 本方案适用于最多8克细胞（约10⁹ 细胞），根据参考文献修改^19,27,28通常，从八块500 cm²的培养皿中可获得约5 g的HEK-293或HeLa细胞。² 培养皿生长至约90%汇合度。
   警告：这些实验方案使用液氮（LN₂），可导致严重的低温灼伤。操作时需穿戴防护服，并采取适当的处理预防措施。
2. 将培养基（废弃物）倒入大烧杯中。
3. 将培养皿放置在大型长方形冰盘中的冰上。
4. 向培养皿中加入 20 ml 预冷的 1× 磷酸盐缓冲盐水（PBS），用大号细胞刮棒将细胞从培养皿上刮下；将细胞转移至预先置于冰上的 50 ml 离心管中，并将离心管置于冰上保存。
   注意：所有细胞操作步骤均应使用设定为 "低" 并使用25 ml移液管，以避免在转移操作过程中对细胞造成过度剪切。在开始实验前，将50 ml收集管和1×PBS置于冰桶中预冷。
5. 向同一培养皿中再加入 10 ml 冰冷的 1x PBS。收集剩余细胞并转移至 50 ml 离心管中。
6. 每皿重复操作；可合并来自不同培养皿的细胞悬液，以减少样本数量和塑料废弃物。
   注意：由于细胞本身在悬液中所占体积比例较小，因此三块培养板的细胞悬液可合并至两个50 ml离心管中。由于50 ml离心管的实际容量大于标称体积，通常可将八块培养板的细胞悬液分装至五个离心管中。
7. 在 1,000 × g、4 ℃ 条件下离心 5 分钟 °C.
8. 小心倒掉上清液。将每份沉淀重悬于10 ml预冷的1×PBS中。将重悬的沉淀合并，每50 ml离心管最多合并5份，以减少样品数量。
9. 1,000 × g，4℃离心5分钟 °C.
10. 小心倒出上清液。将沉淀重悬于10 ml预冷的1×PBS中。
11. 从20 ml注射器中取出活塞并暂置一旁。盖上注射器喷嘴，将细胞悬液转移至注射器中。
12. 将注射器放入50 ml离心管中，在4 °C条件下以1,000 x g离心5分钟 °C.
13. 用连接真空抽滤系统的细尖吸头移液器吸去上清液，直至最上层细胞即将被吸起时停止。这样可得到湿润的细胞沉淀。
14. 打开注射器帽，插入活塞，将细胞直接滴入装有液氮的大型塑料烧杯中₂，置于液氮中₂ 在泡沫箱中的水浴里，用力将剩余细胞从注射器中推出。
15. 将冻存的细胞通过倾倒转移至50 ml离心管中。松开管盖以允许过量液氮逸出₂ 蒸发；在 -80 下过夜放置 °C. 次日将管盖完全拧紧。冻存的细胞可在此条件下于 -80℃ 保存 °直至冷冻研磨前均保存于 C。
    注意：在所有液氮（LN₂）添加完毕前，切勿将管子完全密封。₂ 已明显蒸发，否则过高的压力可能导致管子爆炸。液氮处理后未及时关闭管子₂ 可能因霜在细胞材料上积聚，增加多余的水分重量，从而在研磨时有效降低蛋白质浓度。

2. 冷冻细胞的低温破碎

注意：所有用于研磨和操作的工具均应使用液氮（LN₂）预先冷却。需要一个小型分液漏斗，用于向研磨罐内添加液氮（LN₂），以及在密封的研磨罐顶部倾倒液氮（LN₂）。一种自制工具见参考文献¹⁹。操作经液氮（LN₂）冷却的研磨装置时需佩戴低温手套。本实验所用的研磨罐盖（见材料表）通常出厂时配有橡胶密封圈；为可靠执行以下实验方案，需将其更换为 commercially available 的聚四氟乙烯（Teflon）盖用密封圈。此外，由于研磨过程中罐内可能积聚大量氮气（N₂）压力，我们建议安装 commercially available 的5 bar/500 kPa压力阀作为安全泄压措施²⁸。

1. 从 -80℃ 中取出细胞磁珠 °C 储存并在液氮中用 50 ml 管架保存₂ 浴液
2. 将50 ml的罐子、两个20 mm的研磨珠以及盖子放入装有液氮的洁净矩形冰桶中预冷₂预冷聚四氟乙烯（PTFE）绝缘体（若使用）；可采用一组圆盘（参见参考文献²⁷），或套筒和样品托（参见 图2）。当液氮的剧烈沸腾停止时，预冷即已完成₂ 平静。
3. 在研磨机上设置适当的配重。
   注意：此质量等于罐体、罐盖、所用研磨球以及将要加入罐中的细胞量的总质量。如果使用了任何聚四氟乙烯（PTFE）绝缘垫片，也应将其质量计入。建议预先记录罐体、盖子、研磨球（以及包括所用绝缘垫片在内的总质量），并将其记录在存放于研磨仪附近的资料表中。
4. 用镊子将两个预冷的20 mm研磨球和冷冻的细胞放入预冷的研磨罐中。
   注意：由于研磨过程中球和罐表面会附着少量材料，因此随着研磨细胞质量的增加，回收材料的百分比也随之升高。根据所述方法，材料损失极小，约为0.3 g湿细胞质量（WCW）。制造商建议，装载样品的最大体积应约为罐体积的1/3。²⁹ 球的总体积应约为1/3，剩余约1/3的自由空间用于球的自由运动。
5. 加入LN₂ 至罐子的约~½ 装满后，盖上罐子的盖子，并将整个装置转移到研磨机中。
   注意：如果使用绝缘体，请先安装所选的绝缘体。
6. 将组件固定后，按照以下程序进行三轮研磨：400 rpm，3 分钟，每分钟反转一次，中间不暂停。使用液氮（LN₂）冷却研磨罐。₂ 每个循环之间。
   注意：研磨过程中，由于球在罐内以行星运动方式碰撞，会产生明显的撞击声。若未听到此类声音，则表明研磨未正常进行。此时应终止研磨循环，不计入有效循环次数，并将罐体组件移回液氮中₂ 检查罐内物质，确保无冰形成；若已结冰，需使用预冷的刮刀将冰从罐壁上刮除。然后从步骤2.5重新开始。
   若不使用绝缘体或使用绝缘体垫片，请将罐体组件移回液氮₂ 在循环之间重新冷却并添加液氮₂ 至 ~½ 每次都要装满。LN₂ 随着研磨过程中罐体温度升高，加入的物质将在罐内蒸发，导致罐内压力积聚。因此，在将罐体从研磨仪上取下时，应非常缓慢地松开卡箍。若快速松开卡箍，细胞粉末可能因迅速减压而逸出。缓慢松开卡箍可使罐内压力以温和、可控的方式释放，避免细胞材料损失。气体氮的缓慢逸出₂ 当缓慢松开夹具时，常可听到嘶嘶声——这是正常现象。
   若使用套管-圆盘绝缘体，可将罐组件留在研磨机中，并加入液氮₂ 添加到绝缘体/罐体组件中 原位.
7. 将罐子移回液氮中₂，并静置片刻以冷却。若使用套筒-圆盘绝缘装置，可借助两把刮刀从两侧施加杠杆力，将罐体从套筒中取出。待罐体置于液氮中静置后₂，小心打开盖子，用镊子取出研磨珠，并使用预冷的刮勺将粉末转移至预冷的50 ml离心管中。加入少量液氮（LN₂）₂ 将开口的罐子/粉末容器轻轻摇晃，有助于松动附着在球体上的结块粉末，然后再取出球体。
   注意：一旦打开罐子，需加入少量液氮（LN）₂ 在取出研磨珠之前，应向其中加入适量溶液，以回收附着在表面的粉末。细胞粉末应保存在 -80 °C或更低温度下保存至使用。根据我们的经验，细胞粉末以这种方式保存几乎可以无限期地保持其性能不受影响。

3. 从细胞提取物中亲和捕获蛋白质复合物

注意：以下方案使用亲和介质，该介质由与目标蛋白相互作用的亲和配体、诱饵或抗体与微米级顺磁性磁珠偶联而成。此类介质可自行制备^19,30，也可使用市售试剂盒制备，或直接购买预制成的试剂。

1. 细胞提取物制备
   注意：处理细胞冻粉时，务必使用经液氮预冷的工具和离心管₂含有细胞粉末的管子应始终置于液氮中₂ 当不在 -80 时 °C. 将含有细胞粉末的50 ml离心管放入装有液氮的泡沫塑料盒中的离心管架上₂.
   1. 将100 mg细胞粉末称量至1.5或2 ml微量离心管中。
      注意：我们观察到，对于中等表达水平的蛋白质（约 50 kDa 质量，每细胞数千拷贝），在假设目标蛋白的提取和捕获效率适中的情况下，此数量的细胞是一个良好的起始点，经亲和捕获后通常可获得数十至数百纳克的目标蛋白 ≳70%。该得率足以通过SDS-PAGE和蛋白质染色直接观察纯化组分。
   2. 用空的微量离心管称量天平。使用液氮将细胞粉末分装到管中₂ 冷却的药匙或刮刀。在分析天平上称量分装到管中的粉末质量。
      注意：为方便称量细胞粉末，可使用小型量匙。这些量匙已被证明可提供可重复的结果（参见参考文献）¹⁹）。我们发现使用螺口或“安全锁”微量离心管效果最佳。液氮蒸发产生的压力可能导致普通盖子的离心管破裂₂ 可能进入管内的气体会导致标准微量离心管在后续加样前的升温过程中突然弹开，从而可能导致样本丢失。
   3. 打开装有细胞冻粉的管子（或松开螺旋盖），室温放置1分钟。此步骤可释放管内压力，防止加入提取液时立即冻结。在此1分钟孵育期间未观察到冻粉发生解冻。
   4. 加入400 µ加入蛋白酶抑制剂的提取剂，涡旋混匀后置于冰上，继续进行步骤3.1.5。在后续所有操作步骤之间，样品均应置于冰上保存，直至洗脱。
      注意：提取剂的最佳组分取决于待纯化的蛋白质复合物。以下提供一些一般性指导建议。 表1 以及支持性参考文献。
   5. 使用微尖超声波破碎仪对样品进行短暂的低能量脉冲处理，以分散任何聚集体。（超）声处理，4次脉冲（每次2秒，2 A；总能量约15–20 J）。
      注意：涡旋可将细胞粉末分散到提取液中，但根据溶液性质的不同，可能会观察到一些聚集体。我们发现，在后续亲和捕获过程中，充分分散这些聚集体可获得最佳得率。短暂使用微探头超声处理即可有效分散这些聚集体。溶液应呈现半透明且均匀的状态，无明显聚集体。水浴超声仪的功率通常过低，若不显著延长样品处理时间，则难以有效分散此类聚集体，但在适当设置条件下仍可能适用。
   6. 通过离心澄清提取物（例如， 20,000 × g，10 分钟，4 ℃ °C）。
      注意：可保留一部分澄清的细胞提取物，用于与沉淀物、亲和捕获后的上清液以及从亲和介质洗脱后所得各组分进行比较，以评估目标蛋白的提取和捕获效率。 例如， 通过蛋白质印迹检测（见讨论部分）。
   7. 移除上清液（澄清的提取物），并进行亲和捕获。
      注意：沉淀物可在70℃下用SDS-PAGE样品上样缓冲液重新提取 °C 通过与步骤 3.1.6 中获得的提取物进行比较，确定目标蛋白在初始非变性提取过程中的释放程度。
2. 亲和捕获
   1. 预洗磁性亲和介质。此步骤可在细胞提取物离心的同时进行。
   2. 将管子置于磁架上，数秒内磁珠将聚集于管壁一侧，从而可去除储存溶液。
   3. 加入500 µ向珠子中加入提取液。在中等速度下短暂涡旋振荡（足以重悬珠子）。将离心管在小型离心机中瞬时离心，使所有液体沉降至管底。此步骤可确保溶液残留最少。将离心管置于磁架上，吸除上清液。
      注意：具有不同特性的磁性介质可从众多商业供应商处获得。由于微珠大小、均一性、表面涂层及抗体偶联化学性质等特性差异，实验结果可能有所不同。建议在确定使用何种试剂前，先在您的应用中进行平行对照试验。
   4. 通过将澄清的细胞提取物转移至含有预洗涤亲和介质的1.5–2.0 ml离心管中，启动亲和捕获，并短暂涡旋振荡以重悬。
   5. 4℃孵育30分钟 °在旋转摇床中持续轻柔混匀，孵育期间磁珠应保持悬浮状态。
   6. 用微型离心机瞬时离心，使管内所有内容物沉至管底。吸除上清液，按照步骤3.2.3所述，用1 ml冷提取液洗涤磁珠三次。将管子置于磁力架上，移除液体。继续加入下一种溶液并重复上述操作。  在第2个^nd 洗涤后，用移液器将磁珠和洗涤液一同转移至新的微量离心管中。此步骤可减少在洗脱阶段因细胞提取物孵育管壁吸附的随机蛋白所导致的样品污染。完成3^rd 洗涤后，应将珠子在小型离心机中短暂离心，以使所有内容物沉降至管底。将离心管放回磁架上，去除残留液体。此步骤可确保彻底去除最后少量液体 µ确保洗脱前去除溶液，以保证洗脱样品体积一致。同时确保洗脱效率，避免洗脱液被残留的洗涤液稀释；此类残留物还可能引起盐效应，影响蛋白质在SDS-PAGE中的迁移（见下文）。   
      注意：可保留一部分结合后的上清液，用于与3.1.6步骤中获得的澄清提取物通过Western印迹进行比较。该结果可指示目标蛋白从细胞提取物中被去除的程度。
   7. 以天然或变性方式洗脱；根据下游应用选择最合适的策略¹.
      注意：天然洗脱策略的具体操作取决于所使用的亲和标签（见讨论部分）。对于大多数用户而言，建议采用SDS-PAGE上样缓冲液进行变性洗脱，随后通过SDS-PAGE结合蛋白质染色对样品进行分析³¹将是最实用的初步方法。
      注意：样品缓冲液的组成取决于所使用的电泳系统。许多实验室自行制备Tris-甘氨酸凝胶，采用不连续电泳和Laemmli缓冲系统^32-34一种常见的上样缓冲液配方（1×）包括：10%（w/v）蔗糖、50 mM DTT、2%（w/v）SDS、62.5 mM Tris-Cl（pH 8.8）、0.0004%（w/v）溴酚蓝³¹建议配制不含DTT的1.1倍浓度储存液。1/10^th 在进行SDS-PAGE之前，应向样品中加入500 mM DTT的适当体积（见下文）。市面上还可提供多种商业化的SDS-PAGE系统，这些系统可能包含特定于该系统的样品缓冲液。
   8. 加入不含还原剂的SDS-PAGE上样缓冲液（以减少抗体链从磁珠上解离），室温振荡孵育5-10分钟。
      注意：这会干扰大多数基于亲和力的相互作用，使捕获的蛋白质释放到上清液中。对于更稳定的相互作用，可通过提高温度促进释放（通常为70℃）。 °C 是足够的。
   9. 收集并保存上清液。样品可在 -20℃ 冻存 °短期保存（数天）可置于 C，长期则置于 -80 °C 用于长期保存，直至需要分析。
   10. 将样品进行SDS-PAGE电泳，随后采用标准技术进行蛋白质染色³¹质谱法可用于表征样品组成¹可将单个蛋白质条带切下用于鉴定，或仅对样品进行短时间电泳（进入凝胶4-6 mm），将样品中所有蛋白质作为一个“胶块”整体处理，通过单次分析对整个样品进行表征。
       注意：在开始电泳前加入 DTT。如果计划进行质谱分析，可在电泳后对样品进行烷基化处理。³⁵；然而，在电泳之前进行烷基化通常更为方便³⁶. 

结果

图1，I部分说明了低温研磨与磁珠可协同作用以提高样品质量。IA-C部分表明，用于亲和捕获的不溶性介质的材料组成会影响回收的蛋白质组¹⁹。将目标蛋白——纯化的带FLAG标签的细菌碱性磷酸酶（BAP）——加入人细胞裂解物中。BAP预期不会特异性地与人源蛋白相互作用或共纯化。通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色判断，共纯化蛋白的特征随所用介质的不同而变化。微米级磁珠显示出最干净的条带，表明非特异性蛋白吸附水平相对较低。ID和IE部分说明细胞裂解方法也会影响回收的蛋白质组。在所提供的示例中，一种内源性蛋白复合物（NEXT复合物³⁷）从低温研磨或超声处理的细胞裂解物中进行亲和捕获¹⁹。当细胞裂解物来源于低温研磨的细胞粉末时，观察到的高分子量污染物更少。

利用亲和捕获技术研究内源性蛋白质复合物时面临的一个挑战是，难以将目标蛋白真正的生理相互作用蛋白与假阳性（FP）区分开来。假阳性可能来源于多种因素，包括蛋白质非特异性吸附到离心管和容器表面、亲和介质、抗体或亲和配体，以及目标蛋白本身。因此，必须投入大量精力优化捕获过程。检测假阳性始终是一个核心难题，为此已开发出大量不同的工具，包括实验方法^38-40和计算方法^41-43，每种方法各有优缺点。在我们先前的实验中注意到一种假阳性蛋白结合模式：将抗-FLAG磁性介质与对照细胞裂解液孵育后所获得的结合蛋白谱，明显不同于在存在3xFLAG标签蛋白时所获得的谱型。此外，这些假阳性蛋白可通过与3xFLAG肽段孵育而从介质上释放⁷。这一现象表明，在缺乏相应表位的情况下，假阳性蛋白可能机会性地结合至抗-FLAG抗体的抗原结合位点（paratope）。理解此类假阳性背景的性质非常重要，因为许多研究使用未标记的“亲本细胞系”作为亲和捕获的模拟对照；然而，这类对照可能并不适合用于判断与标签蛋白相互作用的特异性。为了确定在抗体抗原结合位点被占据或未被占据的情况下，我们的亲和介质所贡献的背景结合水平，我们使用抗-FLAG磁性介质和HEK 293T细胞裂解液（不表达任何标签蛋白）进行了模拟亲和捕获实验，并在有或无添加3xFLAG肽段的情况下进行比较。结果如图1面板II所示。简言之，将抗-FLAG磁性介质在细胞裂解液（总蛋白浓度 ≳10 mg/ml）中孵育30分钟，裂解液组成为20 mM HEPES-Na（pH 7.4），含500 mM NaCl和1% v/v Triton X-100。随后，将介质分别与1 mg/ml的3xFLAG肽段孵育，以竞争性置换原本结合在抗-FLAG抗原结合位点上的蛋白；或使用SDS-PAGE上样缓冲液进行变性洗脱。此外，还分别在细胞裂解液中添加1 µg/ml和10 µg/ml的3xFLAG肽段，重复相同实验。所有洗脱组分均进行SDS-PAGE电泳并银染。我们观察到，在缺乏相应表位的情况下，抗-FLAG介质确实会捕获一定水平的背景蛋白，这些蛋白可被3xFLAG肽段洗脱——如图1-II所示示例中，在37至50 kDa之间出现一条主导条带。使用SDS-PAGE上样缓冲液洗脱所得的条带模式与此相似，但额外出现若干明显条带。然而，当裂解液中存在1 µg/ml的3xFLAG肽段时，亲和介质上的假阳性结合被完全消除，降至检测限以下，在天然或变性洗脱组分中均未观察到。该结果表明，当抗体抗原结合位点未被占据时，即使对于像3xFLAG/抗-FLAG M2配对这样高亲和力结合表位的抗体，其抗原结合位点也可能表现出广泛的非特异性结合，并显著影响亲和捕获过程中获得的蛋白质组。同时，该结果也提示，常用于减少非特异性结合的高盐等严格洗涤条件，若缺乏抗原-抗体相互作用，则可能无效。为进一步验证，我们进行了类似实验，并结合SDS-PAGE分析和定量质谱（MS）检测（图S1）。在定量的347种蛋白中，除一种蛋白外（错误发现率 = 1%；表S1），其余所有蛋白均与3xFLAG标签诱饵蛋白相关，而非出现在添加3xFLAG肽段的对照样本中。这些结果表明，在我们的实验条件下，绝大多数被检测到的蛋白很可能要么与标签蛋白共纯化，要么是未被占据的抗-FLAG抗原结合位点导致的脱靶产物。根据我们的经验，高质量的高信噪比亲和捕获结果在SDS-PAGE及蛋白染色图谱中表现为清晰、丰度高且大致符合化学计量比的离散条带，同时其他微弱的背景条带极少；这一原则的大量实例可参见文献¹¹。

在 cryomilling 过程中使用聚四氟乙烯（PTFE）绝缘体（推荐使用）的目的是降低研磨罐在研磨过程中的升温速率，减轻研磨过程中反复液氮（LN₂）冷却的负担，并减少研磨罐内冰的形成程度。这有助于保持稳定的研磨性能，并便于细胞粉末的处理。示例绝缘体可参见参考文献²⁷（圆盘状）以及下文的图2（套筒-圆盘组合）。

图1：代表性结果示例。 （I）本图组经参考文献¹⁹修改而来。考马斯亮蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶。（左侧）微米级磁珠相较于基于琼脂糖的介质具有更低的非靶向结合。（A）磁珠；（B）传统琼脂糖；（C）含铁（磁性）琼脂糖；上述介质均偶联抗FLAG M2抗体，并用于从液氮研磨破碎的HEK-293细胞提取物中捕获FLAG标签的细菌碱性磷酸酶（BAP；已标记）。基于琼脂糖的纯化显示出更高水平的非特异性吸附（未标记条带）。（右侧）使用抗体偶联磁珠纯化内源性蛋白复合物时，由液氮研磨HeLa细胞制备的提取物相较于超声破碎法制备的提取物表现出更低的非靶向吸附。利用偶联多克隆抗GFP抗体的磁珠对LAP标签⁴⁴的RBM7进行亲和捕获，以纯化NEXT复合物^19,37。（D）由液氮研磨粉末制备的提取物；（E）通过超声破碎完整细胞制备的提取物。垂直黑色条带标示出在超声处理样品中高分子量非特异性互作蛋白富集的凝胶区域。黑色箭头指示预期的特异性互作蛋白（已标记）。在泳道D和E中约50 kDa处观察到的条带归因于羊驼IgG重链。（II）银染SDS-聚丙烯酰胺凝胶。（Std.）在HEK-293T细胞提取物上按标准方法进行的模拟亲和捕获实验。捕获后，结合物质通过（N）含1 mg/ml 3xFLAG肽的非变性洗脱，或（D）SDS-PAGE上样缓冲液中的变性洗脱进行释放；（PB 1）与Std.相同，但在提取液中加入1 µg/ml 3xFLAG肽以封闭亲和介质上的抗FLAG互补位点；（PB 10）与PB 1相同，但3xFLAG肽浓度为10 µg/ml。IgG相关条带和3xFLAG肽均已标注。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：套筒与垫片式聚四氟乙烯（PTFE）绝缘体。 图示为一个250 ml的PTFE罐（1）。一个50 ml的不锈钢研磨罐（2）可嵌入PTFE罐内（3），从而允许在多次研磨循环之间将研磨罐保留在研磨机中。在夹紧装置与罐盖之间使用一个上部PTFE绝缘垫片（2）。为了冷却已安装的罐体与绝缘体组件（3），可将液氮（LN₂）直接注入绝缘体本体中，使其包围研磨罐。随后即可开始下一轮研磨循环。请点击此处查看该图的放大版本。

试剂	建议浓度	备注
氯化钠	0.1–0.5 M	高浓度（>300 mM）通常有助于提高总蛋白的提取效率并降低背景信号，但可能会去除一些原本稳定的相互作用蛋白。低于 150 mM 的浓度通常对减少非特异性背景无效。
乙酸铵	0.2–2 M	一种由两种缓冲体系组成的盐，可形成中性 pH 溶液57。较高浓度有助于稳定某些蛋白质复合物。若结晶态乙酸铵储存不当或存放过久，可能因氨的流失而产生酸性溶液。含有乙酸铵的提取液无需额外添加 pH 缓冲剂或其他盐类。可与 NaCl 联合使用以调节实验结果。
Tween 20	0.1% v/v	一种非离子型去垢剂58；通常与 NaCl 联合使用。
Triton X-100	0.5–1% v/v	一种非离子型去垢剂58；通常与 NaCl 或 NH4CH3CO2H 联合使用。
CHAPS	5 mM	一种两性离子去垢剂58；通常与 NaCl 联合使用。
Sarkosyl	1 mM	一种阴离子去垢剂58，可降低背景信号，但也可能剥离稳定的复合物组分，从而揭示二元相互作用关系；通常与 NaCl 联合使用。
Tris-Cl	20 mM	在 4 °C 时 pKa 为 8.8，在 25 °C 时为 8.1。
	(pH 8.0)
HEPES-Na	20 mM	在 4 °C 时 pKa 为 7.8，在 25 °C 时为 7.5。根据提取液中所用盐类（e.g., NaCl、KCl 或 CH3CO2K）的不同，使用 NaOH 或 KOH 进行 pH 平衡。
	(pH 7.4)

表1：纯化蛋白质复合物时建议使用的一些试剂。 本表格列出了我们在从人源细胞系中纯化蛋白质复合物时发现有用的一些试剂，并提供了建议的工作浓度。典型的提取液配方包含pH缓冲剂、盐和去污剂^{1,11,24,45-48}。最佳实践是确定能够获得理想结果的最简试剂组合。

图 S1：纯化后混合（MAP-）SILAC 分析假阳性结果。I. 示意图：本实验中，分别从重同位素标记和轻同位素标记的 HEK-293T 细胞⁷中纯化出表达自 pLD401 质粒的 3xFLAG 标签 ORF2p 蛋白复合物。轻标记细胞裂解液中加入 3xFLAG 肽段，以通过竞争性抑制防止 3xFLAG 标签 ORF2p 的亲和捕获；但该处理不会阻断可能非特异性结合磁珠介质或抗体非抗原结合位点结构的蛋白质。从磁珠洗脱后，将重标记和轻标记样品在纯化后混合，并通过定量质谱（MAP-SILAC³⁹）分析，以确定各组样品中相关蛋白的比例；更多方法学细节见表 S1。II. 银染凝胶显示，轻标记和重标记样品结果具有可比性（比较 L 与 H），且在添加 3xFLAG 肽段（LI）的情况下进行的纯化过程发生了竞争性抑制。下方为混合后的 H 与 LI 组分的考马斯亮蓝 G-250 染色凝胶切块，在基于凝胶的蛋白质组分析前制备，具体操作如表 S1所述。请点击此处下载此图的高清版本。

表 S1：MAP-SILAC。 本工作表包含执行 图 S1 中所述 MAP-SILAC 实验所获得的数据。请点击此处下载该表格。

讨论

这三种方案协同工作，旨在（1）通过冷冻研磨为细胞进行固态破碎做准备，（2）在行星式球磨机中实现细胞破碎，（3）从细胞粉末中制备提取物，以亲和捕获目标蛋白及其生理相互作用伴侣的复合物。目前存在多种不同的细胞裂解技术，包括利用挤压冲击、剪切和/或压力的机械/物理方法，以及化学/酶法，各类方法均有其各自的优缺点。^49,50每位研究者都应探索最适合其分析需求的方法，同时需注意，所选用的细胞破碎和蛋白质提取方法均可能引入偏差。^51,52 需要进行经验性优化（下文讨论）。机械方法可能产生大量热和/或剪切力，从而破坏蛋白质复合物。冷冻研磨通过使用液氮（LN）避免了加热效应₂ 在整个过程中对样品进行冷却。行星式球磨机通过冲击力和摩擦力（包括剪切应力）来实现粒径减小，这些力是颗粒尺寸减小过程中的关键因素。^53,54在报告的设置下，我们未观察到蛋白质复合物的降解。事实上，我们已提取并获得了看似完整的约50 MDa核孔复合物¹¹ 且具有酶活性的逆转座子，其比活性高于使用“温和”去垢剂裂解法制备的样品⁷化学/酶法细胞裂解存在局限性，即细胞内容物会释放到溶液中 体外 一种支持破坏细胞膜和结构大分子的环境，但可能不适合维持目标蛋白质复合物的完整性。通常，在实验前并不了解与目标蛋白质形成的复合物的组成成分，或稳定这些目标复合物所需的条件。固态研磨的一个主要优势在于破碎与提取过程相互分离，使得样品材料可在无添加液体的情况下制备，便于储存（-80 °C或更低温度）、积累，并可根据实验需求随时取用。 例如， 探索优化方案 体外 亲和捕获的条件。蛋白质相互作用在高浓度下最为稳定^55,56因此，尽量减少提取剂的体积有助于维持生理相互作用。另一方面，还需考虑实际因素——蛋白质复合物必须从细胞中分离并转入无不可溶性聚集体的非黏稠水相中，以便目标复合物与亲和介质充分混合。此外，还需对某些条件进行标准化和控制 体外 环境（pH、盐浓度， 等。) 对于系统的建立和实验的可重复性至关重要。我们发现，在 1:4–1:9（w:v）稀释范围内制备的提取物能够满足实际操作与理论要求，获得高质量的结果。此外，还需确定细胞提取物与亲和介质之间的最佳比例。该比例需通过使用不同量的亲和介质对提取物进行滴定实验，凭经验确定，且可能对实验的信噪比产生可检测的影响，下文将进一步讨论。通常情况下，目标蛋白的有效去除率应达到其可溶性组分的 ≥70%。 >90% 的得率是可取的，通过仔细优化提取条件可能实现。许多此类实际问题在参考文献中均有论述。¹使用钕磁铁在特制的微量离心管架中操控顺磁性微珠，尽管自制替代装置也可行。当放置于管架中时，微珠在磁场作用下聚集于管壁一侧，随后可移除溶液而不扰动微珠。

该冷冻研磨方案的一个局限性在于，其开发所用的行星式球磨机（见 材料表），是因为使用该设备研磨并回收细胞粉末时，所需材料的最小用量较少>1 g）。此类样品量在许多微生物、细胞系和模式生物中容易获得，也常可通过实验动物的离体组织获取。然而，某些细胞系可能难以大量培养，动物组织也可能较为稀缺。对于样品量较少的情况，可使用其他设备配合更小的容器进行类似研磨，但可能在一定程度上牺牲所得粉末的细度。此外，机械研磨设备的成本对部分实验室而言可能过高。冷冻研磨可通过多种替代装置实现^14-19，包括使用研钵和研杵手工研磨，这是成本最低的方法，但破碎效率显著降低。亲和捕获实验方案通常要求实现高效的细胞裂解，以促进蛋白质最大程度地释放到溶液中，从而最大限度地捕获目标蛋白复合物。另一方面，已有研究在酵母中证实 体外 剪接提取物中，最大程度的裂解可能并不等同于最大程度的 体外 生化活性^57,58在我们迄今测试的系统中尚未观察到此类问题，因此在进行低温研磨时我们并未有意限制细胞破碎程度。然而，在优化过程中应考虑到这种可能性 体外 酶学检测。尽管低温研磨是一种高效的细胞破碎方法，但在制备哺乳动物组织的均一全细胞提取物时，通常辅以有限强度的超声处理有助于获得更均匀的提取效果，因为在低至中等盐浓度（100–300 mM）和非离子型去污剂（0.1–1% v/v）条件下提取时，有时可通过肉眼观察到不均匀的聚集体。由于我们发现这些聚集体的存在可能降低后续亲和捕获的得率和/或质量，因此我们常规采用超声处理以分散这些聚集体（即使肉眼未见明显沉淀）。这些聚集体的特征与膜碎片的聚集物一致，类似于先前在研磨酵母细胞提取物中所报道的聚集体。⁵⁸超声处理在某些方案中也用于剪切DNA并将染色质片段释放到溶液中，但本方案所采用的超声处理程度不会显著打断DNA。针对特定目标蛋白的高效亲和配体或抗体的可获得性有限（或成本较高）可能是另一个障碍。当模式生物适用于基因组标记或可转染外源表达载体时，可利用市场上种类繁多的商业亲和试剂，实现目标蛋白以亲和标签融合蛋白的形式表达。然而，定制抗体的制备已变得越来越可行，且多克隆抗体和单克隆抗体在亲和捕获应用中均可表现出优异性能。上述诸多考虑因素在参考文献中也有更详细的论述。¹.

细胞裂解方法及亲和介质选择如何影响实验结果的示例如下所示 图1不同提取剂作用效果的示例可参见参考文献^1,11,24. 由于这些及其他实验参数会影响亲和捕获的质量，导致难以区分荧光蛋白（FPs），因此需要建立 "珠蛋白组" 并已开发出计算方法以去除非特异性污染物，辅助鉴定荧光蛋白（FPs）^40-43然而，这些方法在很大程度上仅能有限地替代最佳的样品制备⁵⁹遵循最佳实践并基于实验结果优化亲和捕获实验，可为后续分析提供最高质量的样品，相关内容将在下文进一步讨论。一种易于实施且可提高样品纯度的操作是天然洗脱。天然洗脱最常用于获取完整无损的亲和分离蛋白复合物，以用于后续实验；但由于其通常能提升样品纯度，也可单独出于此目的而采用。然而，如文中所示， 图1，图II，天然洗脱提高样品纯度的能力可能取决于亲和介质用量与细胞提取物中目标蛋白丰度之间的精确滴定——当介质过量时，未结合的抗原结合位点可能导致非特异性靶蛋白在天然洗脱组分中积累，从而观察到荧光蛋白（FP）的污染。根据本文所述试剂与操作步骤，我们的经验表明，实验中荧光蛋白（FP）污染的最大来源往往是标签蛋白自身，一旦其脱离活细胞环境即可能发生此类问题。图 1.II 和 图 S1）。在这种情况下，使用在无抗原条件下产生无关蛋白质组的亲本细胞系作为对照并无实际价值；同样，仅含标签或仅加入目标抗原的对照（不含其他成分）也无实际意义。因此，只要条件允许，我们均会采用 I-DIRT^7,38，该方法利用定量质谱直接检测裂解后蛋白质相互作用的累积情况。如步骤 3.2.7 中所述 该方案中，天然洗脱的具体步骤取决于所使用的亲和系统的细节。天然洗脱最常通过竞争性置换带标签的蛋白复合物，或对标签进行蛋白酶切割，从而将复合物从亲和介质上释放出来。目前已存在多种由小分子表位标签组成的亲和系统，这些系统的表位本身可作为肽段用于竞争性洗脱带标签的蛋白复合物。⁶⁰同样，已有多种蛋白酶可用于特异性切割位于亲和标签融合蛋白中特定位置的相应位点⁶¹根据所选亲和系统的具体特性，可采用相应的洗脱方案。

通常，实验结果的质量会受到样品制备质量的显著影响。在进行这些实验方案的每一步时，必须仔细、精确地操作，并在保证细致和准确的前提下尽可能快速完成。建议追踪目标蛋白在每一步骤中的分布情况，以了解每项操作的效率。例如：目标蛋白在相应细胞或组织中的丰度如何？由于丰度较低，所研究的蛋白（及其复合物）可能难以通过质谱进行表征。如果纯化的复合物可通过常规蛋白质染色法检测到（约在纳克水平），则质谱分析很可能成功；如果目标蛋白仅能通过高灵敏度增强化学发光Western blot检测到（约在皮克水平），则质谱分析的成功可能性较低。即使目标蛋白在细胞中丰度较高，其在制备的细胞提取物中的丰度又如何？该蛋白是分布在上清中还是沉淀中？如果是后者，可尝试设计新的提取溶液以提高回收率。当细胞提取物与亲和介质结合后，目标蛋白的捕获效率如何？该蛋白是否能在后续洗涤步骤中稳定结合？其他共纯化的蛋白情况如何？通过在实验方案的适当步骤保存每份样品的等分试样，通常可通过针对目标蛋白的Western blot或常规蛋白质染色，以及其他合适的检测方法，轻松回答上述问题。优化每一步操作将有助于提高捕获复合物的得率和纯度，但有时在最大化某一项指标的同时，可能需要在另一项指标上做出权衡。

对于许多研究人员而言，亲和捕获的典型应用是鉴定少量目标蛋白的候选体内相互作用分子；这些候选分子通常需通过其他正交方法在体内进行验证，以证明这些物理相互作用分子的生物学意义。亲和捕获也被高通量研究用于生成在（接近）全蛋白质组范围内共纯化的蛋白质列表，从而促进对潜在体内复合物的计算推断。文献中已有大量此类研究的实例。该方法不针对任何特定靶标优化捕获条件，而是侧重于探索大量靶标；因此，在任一样本中，所推断出的复合物本身很少能被完整且高纯度地回收。相反，推断的基础来自于多个不同亲和捕获样本之间观察到的组分部分重叠⁴²。这两种策略均为我们理解相互作用组提供了宝贵的数据。然而，亲和捕获的一个主要优势在于，只要对实验流程进行优化，通常就有可能获得完整且高度纯化的复合物。我们认为，该方法的未来发展方向在于提高内源性蛋白质复合物捕获过程的便捷性和效率¹¹，以便更准确地评估生理条件下全部的相互作用分子，并更频繁地应用于后续的生物化学、酶学及结构研究中，例如参考文献^7,9,23。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养基 &和细胞培养用具			用于制备冻存细胞（I）
500 cm2 培养皿	康宁	431110	用于制备冻存细胞（I）
大烧杯（1-2 L）			用于制备冻存细胞（I）
矩形制冰盘	Fisher Scientific	13-900-747	用于制备冻存细胞（I）， &和低温研磨（II）
磷酸盐缓冲液（PBS）			用于制备冻存细胞（I）
大细胞刮刀	Fisher Scientific	08-100-242	用于制备冻存细胞（I）
液氮			用于制备冷冻细胞（I）， cryomilling（II） &和亲和捕获（III）
50 ml 离心管	康宁	352098	用于制备冻存细胞（I）， &和冷冻研磨（II）
20 ml 鲁尔锁式注射器			用于制备冻存细胞（I）
勒洛克注射器盖帽	www.dymax.com	T11182	用于制备冻存细胞（I）
冷藏离心机			用于制备冻存细胞（I）
50 ml 离心管架，4 孔位			用于制备冷冻细胞（I）， cryomilling（II） &和亲和捕获（III）
泡沫箱			用于制备冷冻细胞（I）， cryomilling（II） &以及亲和捕获（III）
行星式球磨仪，PM 100	Retsch	20.540.0001	用于冷冻研磨（II）
50 ml 不锈钢研磨罐	Retsch	01.462.0149	用于冷冻研磨（II）
不锈钢研磨球，20 mm Ø	Retsch	05.368.0062	用于冷冻研磨（II）
盖垫圈：PFA 包覆弹簧加压密封圈，2.62 mm × 44.63 mm	www.marcorubber.com	T1044-2.62x44.63	用于冷冻研磨（II）
微型LN2 离心机	自制的	参见参考文献19	用于冷冻研磨（II）
250 ml 聚四氟乙烯（PTFE）广口瓶绝缘套（可选）	自制的	洛克菲勒大学	用于冷冻研磨（II）；可由洛克菲勒大学高能物理仪器车间生产，或应要求提供设计蓝图
聚四氟乙烯圆盘绝缘体（可选）	自制的	洛克菲勒大学	用于冷冻研磨（II）；可由洛克菲勒大学高能物理仪器车间生产，或应要求提供设计蓝图。
5 bar/500 kPa 压力释放阀（可选）	http://www.leeimh.com/	558 系列止回阀	用于冷冻研磨（II）
1.5-2 ml 微量离心管			用于亲和捕获（III）
提取剂			用于亲和捕获（III）
完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合片剂	罗氏应用科学	11873580001	用于亲和捕获（III）
涡旋混合器			用于亲和捕获（III）
冰桶			用于亲和捕获（III）
微尖超声波破碎仪，Q700	Qsonica	Q700	用于亲和捕获（III）
低强度 1/16” 微型探针	Qsonica	4717	用于亲和捕获（III）
台式制冷微量离心机			用于亲和捕获（III）
Dynabeads M-270 Epoxy	赛默飞世尔科技	14302D	用于亲和捕获（III）
与Dynabeads偶联的抗体或亲和配体	自制的		用于亲和捕获（III）；参见参考文献19
样品旋转仪			用于亲和捕获（III）
钕磁铁	Life Technologies	123-21D	用于亲和捕获（III）
SDS-PAGE 样品缓冲液（不含还原剂）			用于亲和捕获（III）
DTT			用于亲和捕获（III）
SDS-PAGE 系统			用于亲和捕获（III）
SDS-聚丙烯酰胺凝胶			用于亲和捕获（III）
蛋白质染色			用于亲和捕获（III）