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方法文章

植物病原真菌 Ustilago maydis 的遗传操作以研究真菌生物学及植物-微生物相互作用

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DOI：

10.3791/54522

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2016年9月30日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Microbiology, Heinrich-Heine University Düsseldorf, 2Bioeconomy Science Center (BioSC), 3Department of Genetics, Institute of Applied Biosciences, Karlsruhe Institute of Technology, 4Cluster of Excellence in Plant Sciences (CEPLAS), Heinrich-Heine University Düsseldorf

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们描述了一种可靠的基因替换策略，用于对黑粉菌 Ustilago maydis 进行遗传操作。本实验方案详细说明了如何构建基因敲除突变体以研究其感染表型。该方法可进一步拓展，以实现对基因的任意修饰，例如，插入编码荧光蛋白标签的序列。

摘要

基因敲除在基因功能分析中具有重要作用。实现基因靶向失活的最有效方法之一是通过同源重组，用可筛选标记完全替换目标基因。在同源重组过程中，DNA交换发生在具有高度相似性的序列之间。因此，位于目标基因两侧的线性基因组序列可用于将可筛选标记特异性地引导至预期的整合位点。敲除载体的平末端可激活细胞的DNA修复系统，从而促进载体通过同源重组或非同源末端连接方式整合到基因组中。在同源重组效率较高的生物体中，成功实现基因敲除的比例可超过50%，使该策略成为一种有价值的基因失活系统。黑粉菌Ustilago maydis是一种表现出高效同源重组能力的真核模式微生物。在其约6,900个基因中，许多基因已通过敲除突变体实现了功能表征，而反复无法完成基因替换则提示该基因可能具有必需功能。后续通过荧光标记或对预测功能域进行突变来进一步表征基因功能，也依赖于同源重组介导的DNA交换。本文将以最简单的实例——基因敲除，详细阐述U. maydis菌株的构建策略。

引言

Ustilago maydis 是一种被广泛研究数十年的植物病原性模式真菌 1,2它具有两种形态：一种是类酵母的非致病阶段，另一种是丝状的感染性形态。 3. 同源重组和DNA修复机制等具有普遍意义的突破性发现均是在该真菌的类酵母生长阶段取得的 4此外，其向感染性菌丝的形态转换以及对感染至关重要的毒力因子均已得到充分表征。 5,6这种黑粉真菌的生物学与致病性相关分子知识的不断增长，依赖于一种简便的基因替换策略。 7-9 得益于出色的基因组注释 10 以及利用反向遗传学的简便性， 例如，本研究所井然有序的质粒库（http://www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html）。在玉米幼苗中进行标准化的快速侵染实验，可对致病性因子进行深入研究 11.

基因组的 U. maydis 包含约6,900个基因 10为了研究其功能，可利用高效的同源重组系统对它们进行单独或组合删除。含有完全同源末端的约1 kb侧翼区域最适合实现超过50%的同源重组率，而仅含250 bp并带有非同源末端的侧翼区域也能实现一定程度的正确整合。 9目前已有五种不同的抗性盒， hygR, cbxR, natR, G418R, 和 phleoR 介导对潮霉素、羧菌灵、诺尔斯链霉素、G418 和博来霉素的抗性，用于筛选转化子 7,9此外，潮霉素抗性已开发成一种可回收的表达盒（FRT-hygR）可通过异源表达的瞬时表达去除 FLP 重组酶 12。这使得抗性盒可以被移除，从而理论上实现无限次的遗传修饰。博莱霉素具有致突变性 13，以便利用新的盒式结构，特别是可回收的 hygR 盒式元件，使用 phleoR 正在减少。因此，可以使用其余四个表达盒构建四重突变体，但对于五重突变体， FRT-hygR 推荐使用该系统 14.

这种通用的基因敲除策略已成功应用于其他黑粉真菌，例如 Sporisorium reilianum15、U. hordei16 或 U. esculenta17，因此在其他具有高效同源重组系统的、尚难进行遗传操作的生物中也具有广阔的应用前景。此外，对于缺乏同源重组能力的生物，也可通过遗传改造来改善其基因工程操作效率，例如敲除 Neurospora crassa 中参与非同源末端连接的基因即为一例18,19。

本文描述了已发表的基因敲除策略 U. maydis 7,9 以实验细节为重点，着重快速而准确地验证候选菌株。以真菌几丁质酶为例，展示单基因突变体以及多基因缺失菌株的构建过程 20,21几丁质酶是一个有趣的例子，因为它们作用于构成刚性细胞壁的几丁质。细胞壁重塑对于细胞分裂过程中的形态变化、向丝状生长的转变以及孢子形成均是必需的。因此，在基因敲除突变体中，可在整个生命周期中观察到相应的表型。

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方案

1. 缺失构建体的制备

  1. 构建含有基因敲除元件的质粒（图1）包含各自的1 kb上游侧翼区（UF）和下游侧翼区（DF），以及位于平端切割限制性酶切位点之间的相应抗性筛选标记盒。
    注意：可使用任何克隆策略（克隆方法参见参考文献） 22）我们推荐对这类质粒采用Golden Gate克隆方法 9.
  2. 使用平末端切割酶从质粒中切除基因敲除片段以获得 1 µg 基因敲除构建体的DNA 9纯化缺失构建体以去除酶和缓冲液 22 例如 使用商业试剂并遵循制造商的说明。
    注意：载体骨架可保留在转化混合物中。

2. 原生质体的制备

注意：实验全程需保持无菌条件。细胞壁是一种强大的保护屏障，限制了分子进入质膜。为了使含有缺失构建体的 DNA 能够被吸收，需要通过原生质体化反应中使用的细胞壁降解酶去除细胞壁。原生质体制备的关键步骤包括：1）培养基的渗透压稳定；2）避免对原生质体施加机械应力。

  1. 用带有圆底的 2 ml 离心管标记以冷冻原生质体，并将其冷却至 -20 °C从具有所需遗传背景的菌株新鲜平板上挑取菌落，接种于3 ml YEPS-Light培养基中，开始预培养。置于旋转轮上，24°C培养24小时 28 °C.
    注意：菌株可以是单亲致病性菌株 SG200 10野生型菌株，测试菌株（如 AB33） 23，或任何突变背景以用于构建双突变体。确保该菌株不带有目标抗性。
  2. 在有挡板的锥形瓶中，将培养物用50 ml YEPS-Light培养基稀释，并置于摇床中振荡培养 28 °C 以 200 rpm 的转速培养。
    注意：野生型菌株的倍增时间约为2小时，至少允许进行三次倍增。
  3. 生长至对数期。确保在波长600 nm处测得的光密度（OD600)，约为0.8（可接受范围为0.6至1.0）。OD600 1.0 对应于约 1 至 2 x 107U. maydis 每毫升细胞数
  4. 在显微镜下检查细胞是否有污染，使用40倍物镜 离心。将50 ml培养液中的全部细胞以1,500 × g离心5分钟，弃去上清液。将菌体沉淀重悬于25 ml柠檬酸钠-山梨醇溶液（SCS）中，再以1,500 × g离心5分钟，弃去上清液。
    注意：细菌污染可通过微小且通常运动的细胞来识别。真菌污染则可根据与香肠状细胞在形态或大小上的差异来识别。 U. maydis.
  5. 离心过程中，准备原生质体化溶液（12.5 mg/ml） Trichoderma 溶壁酶，溶于 SCS；每份细胞沉淀准备 3 ml；经滤膜除菌 22 µm 过滤；溶液需新鲜配制以保证最佳酶活性）。SCS 是一种渗透稳定剂，用于防止原生质体在去除细胞壁后发生破裂。
  6. 将沉淀重悬于2 ml原生质体化溶液中。在室温下孵育5至20分钟，并在显微镜下观察，直至30%至40%的细胞呈圆形或针尖状（图2).
    注意：从现在开始，所有步骤均需在冰上进行，并小心操作原生质体！
  7. 用10 ml冷（4 °C）的无菌水洗涤3次4 °C) SCS，于 1,000 × g 离心 5 分钟。
  8. 将沉淀重悬于10 ml冷的山梨醇、TrisHCl、CaCl中2 溶液（STC），在1,000 × g下离心5分钟，弃上清液。将沉淀重悬于1 ml冰冷的STC中，制备 100 µl 分装至已冷却的离心管中。将分装样品于 -80 °C 直至进一步使用。

3. U. maydis的转化

注意：玉米黑粉菌（U. maydis）原生质体的转化依赖于聚乙二醇（PEG）介导的转化方法，该方法在技术上较为简便，且与电穿孔或基因枪转化不同，无需使用特殊设备。

  1. 准备双层筛选平板（每个转化反应准备2个平板）。底层含有双倍浓度的抗生素。用移液器吸取12 ml含RegLight的培养基 400 µg/ml 潮霉素（或 300 µg/ ml 诺尔斯苏林 4 µg/ml 将羧菌灵或含1 mg/ml G418的培养基倒入培养皿中，避免产生气泡。
    注意：底层平板可在 4 °C，但在转化过程中需新鲜制备顶层（见下文）。
  2. 在冰上解冻原生质体（每转化使用1管）。加入 1 µl 肝素（15 mg/ml）。加入 1 µg DNA（线性化构建体）或 10 µl H2O（水对照）。冰上孵育10分钟。
  3. 在此期间，将12 ml液化的RegLight（煮沸后冷却至 60 °C) 加入 RegLight 底板中。
    注意：该层不含抗生素。
  4. 添加 500 µl 将STC/PEG（聚乙二醇）加入转化管（3.2）中，轻轻翻转混匀。冰上孵育15分钟。
  5. 将每个转化反应液分别涂布于两个双层 RegLight 平板上。使用玻璃涂布棒小心缓慢地涂布均匀。. 将培养皿直立孵育于 28 °C 培养5至7天，直至转化子形成菌落。每块平板可获得约100-200个菌落。
    注意：较低的数值可能由以下原因造成 "错误" 原生质体可能含有过多细胞壁而无法摄取DNA，或无法再生。前者可通过使用自主复制质粒进行转化来检测，后者则通过在无抗生素培养基上检测再生能力来验证。
  6. 制备含有适当抗生素的 YEPS-Light 平板 200 µg/ml 潮霉素（或 150 µg/ ml 诺尔斯苏氨酸 2 µg/ml carboxin 或 500 µg/ml G418；这些浓度等于底层平板所用浓度的一半）。在这些平板上重新纯化至少24个假定的转化子菌落，应获得单菌落。同时将原始菌株划线接种于非选择性培养基上。
    注意：平板可在 4 °C 1-2 周。

4. 正确基因删除事件的验证

注意：突变体的验证通过三步法进行（图1）。首先，通过 PCR 排除含有基因野生型拷贝的候选菌株；其次，通过 PCR 验证抗性盒是否整合到目标位点；第三，通过 Southern 印迹分析验证抗性盒仅整合到预期的基因位点。严谨的菌株验证至关重要，以确保突变表型确实与基因缺失相关联。

  1. 第一次诊断性 PCR 20
    1. 设计一对位于待删除基因内部的引物，扩增产物长度为 250–600 bp（图 1）。此类较小的扩增片段易于在菌落 PCR 中扩增，并且长度足以在标准琼脂糖凝胶电泳中被检测到。
    2. 对于每个候选菌株以及作为阳性对照的原始菌株，用牙签挑取少量（针尖大小）单菌落细胞材料，悬浮于 20 µl 0.02 M NaOH 中。室温孵育 30 分钟。
      注意：使用新鲜菌落。若平板存放超过 1 周，应重新划线以获得新鲜菌落。
    3. 立即取 1 µl 细胞悬浮液进行 PCR。进行标准 PCR 反应并分析所得扩增片段。
      注意：这些样品不可长期保存。
      注意：该 PCR 用于检测野生型基因的存在，从而快速鉴定出目标基因未被替换的阴性候选菌株。在此 PCR 中出现条带的克隆将被弃用。应至少保留一个此类阴性克隆作为额外的阴性对照。无 PCR 扩增产物的候选菌株需进一步分析。对于无有害效应的基因，大约一半的候选菌株应含有野生型基因（出现条带），另一半则无条带。这对应于 50% 的同源重组率。
  2. 第二次诊断性 PCR
    1. 基因组 DNA 的制备
      注意：基因组 DNA（gDNA）可通过两种不同方案制备。第一种方案涉及苯酚和氯仿等有毒试剂，因此仅建议由经验丰富的研究人员操作（见 4.2.1.1 至 4.2.1.5）；第二种方案则适用于经验较少的学生（见 4.2.1.6 至 4.2.1.11）。两种方案均可靠有效。步骤 4.2.1.1 对两种方案均相同。
      1. 用各候选菌株接种 5 ml YEPS-Light 培养基，在 28 °C 条件下于旋转轮上培养 24 小时。取 2 µl 培养物点种于 CM 平板上。保持培养物无菌。
        注意：以下为标准操作流程（警告：包含有毒步骤）。
      2. 向 2 ml 离心管中加入一勺 HCl 洗涤过的玻璃珠（约 200 µl），再加入 2 ml U. maydis 培养物。12,000 × g 离心 5 分钟。弃去上清液（此阶段可将沉淀冷冻保存）。向沉淀中加入 500 µl 苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）。警告！苯酚具有毒性！
      3. 加入 500 µl Usti-lysis-buffer 1。在振荡器（Vibrax）上以 1,000 rpm 震荡 6 至 10 分钟。确认细胞沉淀完全重悬，但避免长时间震荡以防基因组 DNA 断裂。12,000 × g 离心 15 分钟。将 400 µl 水相转移至新的反应管中（切勿接触中间相）。
      4. 加入 1 ml 100%（v/v）乙醇。轻轻颠倒混匀 3 次，观察短暂出现的 DNA 絮状沉淀。12,000 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，用 200 µl 70% 乙醇洗涤。此阶段不要重悬沉淀。
      5. 彻底去除上清液（避免沉淀完全干燥）。加入 50 µl TE/RNase 缓冲液，在 50°C、400 rpm 条件下震荡 10 分钟以溶解 gDNA。取 2 µl gDNA 在 0.8% 琼脂糖凝胶上进行电泳分析20。
        注意：以下步骤为替代的无毒方案。
    2. 替代的基因组 DNA 制备方法
      1. 向 2 ml 离心管中加入一勺经 HCl 洗涤的玻璃珠（约 200 µl），加入 2 ml U. maydis 培养物，12,000 × g 离心 5 分钟。弃去上清液 （此阶段沉淀可冷冻保存）。
      2. 向沉淀中加入 500 µl Usti Lysis buffer 2。在振荡器（Vibrax）上以 1,000 rpm 震荡 5 至 15 分钟。确认细胞沉淀完全重悬。
      3. 将离心管置于 65 °C 水浴中孵育 15 至 20 分钟。使用专为 2 ml 管设计的恒温设备至关重要。随后将管置于冰上冷却 5 分钟。
      4. 加入 100 µl 8 M 乙酸钾，涡旋或颠倒混匀 8 至 10 次。室温下 12,000 × g 离心 15 分钟。
      5. 将 500 µl 上清液转移至新的 1.5 ml 离心管中，加入 400 µl 异丙醇。涡旋或颠倒混匀 8 至 10 次。12,000 × g 离心 15 分钟。弃去上清液，用 500 µl 70% 乙醇洗涤。12,000 × g 离心 5 分钟。
      6. 彻底吸除上清液！必要时可短暂离心（10 秒）以去除残留液体。让 DNA 沉淀干燥 3 至 5 分钟。加入 50 µl TE/RNase 缓冲液，在 50 °C、400 rpm 条件下孵育 10 至 15 分钟。
    3. PCR
      1. 设计两对引物，其中一对引物结合位点位于同源臂外侧，另一对中的一条引物结合于抗性筛选标记内部（UF-f, RC-r；RC-f, DF-r，图 1）9。
      2. 将每个候选菌株 gDNA 进行 1:10 稀释，取 1 µl 作为模板，分别进行两个 PCR 反应，以验证抗性标记在上下游的正确插入9。
      3. 对每个候选菌株进行标准 PCR 反应，并分析扩增产物22。
        注意：这些 PCR 用于检测抗性筛选标记是否正确插入目标基因组位点。若上下游均获得预期扩增产物，则该候选菌株很可能为正确插入。然而，对于仅有一侧（上游或下游）得到验证的候选菌株，也应保留并进一步分析，以防某一侧因 PCR 失败而未检出。
  3. 通过 Southern 印迹分析验证基因组正确插入22
    1. 取突变体候选菌株及相应野生型/亲本菌株的 gDNA（4.2.1 步骤制备）15 µl，使用合适的限制性内切酶进行消化。该酶应在目标位点/构建片段外切割，同时在目标基因或抗性筛选标记内部切割，从而产生明显可区分的条带模式（图 1）8。
      注意：所有预期条带均不应大于 10 kb，以便与未消化的 DNA 明确区分。
    2. 以上游和下游同源臂作为探针。可使用 PCR DIG 标记试剂盒或任何类似的常规方法进行探针标记。将标记后的探针以 1:1 的分子比例混合后进行 Southern 印迹杂交。每种突变体至少保留两个独立的正确转化子。
      注意：原始菌株中应清晰检测到野生型条带模式，而正确克隆中仅应出现预期条带。仅在候选菌株中出现的额外条带提示构建片段在错误位点发生了非特异性插入，此类克隆应被弃用。在第一次诊断性 PCR 中鉴定出的阴性候选菌株应同时含有野生型条带以及大小不可预测的错误整合构建片段的条带。
  4. 甘油保存菌种
    注意：甘油保存菌种可用于在菌种库中长期（数年）保存克隆。每种突变体至少应保留两个独立的转化子，以便比较其表型是否一致。
    1. 将已确认的突变菌株在 YEPS-Light 培养基中 28 °C、旋转轮上培养 24 小时，制备 5 ml 培养物。取每种培养物 500 µl 与 500 µl NSY-Glycerol 培养基混合。轻轻颠倒混匀，确保培养物与培养基充分混合。培养基中的甘油可防止冰晶形成。
    2. 于 -80 °C 冻存。取部分冻存菌液重新划线培养，以检测保存菌种是否具有活性。

5. 显微表型

  1. 在28 °C条件下，将5 ml野生型和突变株的YEPS-Light培养液置于旋转轮上培养12小时。
  2. 次日，将培养液稀释至OD600约为0.1，并继续培养至OD600 达到0.5至0.7之间。OD600为1.0时，相当于每毫升含有约1至2 × 107 U. maydis细胞。
  3. 在显微镜下观察细胞形态。
    注意：健康细胞呈雪茄形（图4，WT）。明显的液泡或菌丝形成表明细胞处于应激状态。
    注意：根据预期的突变表型，可调整分析方法，例如，若使用报告菌株，可在该阶段进行相应的检测。若细胞形态发生变化，应进行统计学分析，例如，测定平均细胞长度。

6. 感染实验

注：幼苗侵染实验此前已在本期刊中可视化展示11。该实验可使用单倍体、单体致病菌株（如 SG20010）作为遗传背景进行，也可通过混合携带相同突变的相容性交配伙伴来实施。

  1. 每种菌株至少培养40株玉米幼苗，在16小时光照周期（200 µE）、28 °C/22 °C（昼/夜）条件下培养7天。接种当天，幼苗应处于三叶期，高度为10–15 cm。
  2. 接种前两天，在5 ml YEPS-Light培养基中接种菌株，于28 °C、旋转摇床上培养24小时，启动预培养。随后在50 ml YEPS-Light培养基中进行主培养，培养至OD600 = 1.0（细胞倍增时间为2小时，至少进行3次倍增，可过夜完成）。
  3. 将50 ml培养液在1,500 × g离心5分钟，弃去上清液。用无菌H2O洗涤细胞3次。将细胞重悬于无菌H2O中，调节OD600至3.0。如有需要，混合交配伙伴菌株。
  4. 使用小型注射器将250–500 µl细胞悬液注入7日龄玉米幼苗的茎部。以无菌H2O作为对照。将接种后的幼苗继续在相同的光照和温度条件下培养7–14天。根据植株表型进行评分：健康、黄化、花青素积累、小肿瘤、大肿瘤、植株死亡10。
    注意：最早可在接种后7天开始评分，并在14天时重复评分，以动态观察感染进程。

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结果

四个几丁质降解基因编码的缺失构建体 U. maydis 基因组通过使用Golden Gate克隆技术构建 hygR 用于缺失的盒式元件 cts1好的，这是译文： ， natR 用于缺失 cts2，该 G418R 用于删除的盒式结构 cts3 以及 cbxR 用于缺失 cts4 20基因替换策略的总体概述以基因的缺失为例进行说明 cts3 (图1）。单突变体和双突变体 cts1 通过在两种不同的遗传背景下依次使用相同的构建体，获得了携带第二个几丁质酶基因的菌株，用于分析几丁质酶在毒力中的作用。实验采用了两种不同的菌株背景：AB33 能够诱导丝状生长，这是致病性的第一步。 23，SG200 是一种单一致病菌株，可实现快速疾病评分 10转化后 cts3-缺失构建体转...

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讨论

本方案描述了在U. maydis中进行反向遗传学研究时构建基因缺失突变体的方法。起始材料为一个缺失载体，该载体包含目的基因上下游约1 kb的序列（分别位于起始密码子上游和终止密码子下游）以及一个经过先前优化的合适抗性筛选盒7,9。每个基因都需要单独构建相应的缺失载体，并在用于基因缺失前仔细验证其序列准确性。侧翼序列中的点突变可能导致基因组序列发生非预期的改变，特别是当侧翼序列延伸至邻近基因，或突变影响调控元件时。这种情况会影响所有转化子，并可能引起与目标基因缺失无关的表型和副作用。

在规划基因敲除策略时，必须考虑预期的表型以选择合适的遗传背景。在本例中，选择了 AB33 23 和 SG200 10，以便检测形态转换和植物侵染中的表型。类似地，其他多种检测指标也可能具有研究意义，e.g. 与 cts1 的融合可用于异源蛋白的分泌 14,26，而带有荧光标记 rrm4 的菌株背景则可用于分析内体上的 RNA 运输 27...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Benedikt Steuten博士对本文稿的审阅。几丁质酶相关的原始研究由Thorsten Langner博士完成。VG实验室由植物科学卓越集群（CEPLAS，DFG EXC 1028）和BioSC资助，KS实验室由BioSC资助，KB由BioSC资助。生物经济科学中心（BioSC）的科研活动在北莱茵-威斯特法伦州创新、科学与研究部的资助下开展，属于NRW战略项目BioSC（编号：313/323-400-00213）。LF获得了DFG国际研究培训项目1525 iGRADplant的博士生奖学金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氨基苯甲酸（游离酸）Sigma AldrichA-9878
Bacto 琼脂 BD214010或使用本地供应商
胰蛋白胨BD211677或使用本地供应商
酵母提取物 BD212750或使用本地供应商
CaCl2*2H2OGrüssing GmbH10234或使用本地供应商
泛酸钙（半钙盐）Sigma AldrichP-2250
Carboxin Sigma Aldrich45371
酪蛋白氨基酸 BD223050
氯化胆碱Sigma AldrichC-1879
柠檬酸ChemSolute24,321,000或使用本地供应商
CuSO₄4*5H2OFluka61240或使用本地供应商
D(+)蔗糖 Roth4621.1或使用本地供应商
DNA降解相关游离酸 Sigma-AldrichD-3159
EDTASigma AldrichE4378
FeCl3*6H2O基因删除在基因功能分析中起着重要作用。通过同源重组，用可筛选标记物替换整个目标基因，是实现基因靶向失活的最有效方法之一。在同源重组过程中，具有高度相似性的DNA序列之间发生交换。因此，可利用位于目标基因两侧的线性基因组序列，将可筛选标记物特异性地引导至预期的整合位点。删除构建体的平末端可激活细胞的DNA修复系统，从而促进构建体通过同源重组或非同源末端连接方式整合。在同源重组效率较高的生物中，成功实现基因删除的比例可超过50%，使该策略成为一种有价值的基因失活系统。黑粉菌（Ustilago maydis）是一种真核模式微生物，具有高效的同源重组能力。在其约6,900个基因中，许多基因已通过缺失突变体实现了功能表征，而反复无法完成基因替换则提示该基因可能具有必需功能。后续通过荧光标记物标记基因或对预测功能域进行突变以进一步表征基因功能，也依赖于同源重组介导的DNA交换。本文以最简单的基因删除为例，详细介绍了U. maydis菌株的构建策略。üssing GmbH10288或使用本地供应商
遗传霉素（G418）二硫酸盐Sigma AldrichA1720
木霉溶菌酶Sigma AldrichL1412
D(+)葡萄糖Caelo2580或使用本地供应商
甘油 Fisher ChemicalG065015或使用本地供应商
H3BO3AppliChemA2940危险物质。请查阅生产商的安全说明。
肝素钠盐Sigma AldrichH3393-50KU
潮霉素B溶液Roth1287.2危险物质 
KClVWR26764298或使用本地供应商
KH2PO4AppliChemA3620或使用本地供应商
MgSO₄4 无水默克7487-88-9无水环境至关重要。也可使用本地供应商提供的无水试剂
MnCl2*4H2OAppliChemA2087或者使用本地供应商
肌-肌醇Sigma AldrichI-5125
Na2-EDTA·2H₂O2OAppliChemA2937或使用本地供应商
Na2MoO4*2H2ORoth0274.2或使用本地供应商
Na2SO4基因删除在基因功能分析中发挥着重要作用。通过同源重组，用可筛选标记完全替换整个基因，是实现基因靶向失活的最有效方法之一。在同源重组过程中，高相似性序列之间发生DNA交换。因此，可利用位于靶基因两侧的线性基因组序列，将可筛选标记特异性地引导至目标整合位点。删除载体的平末端可激活细胞的DNA修复系统，从而促进载体通过同源重组或非同源末端连接方式整合。在同源重组效率较高的生物中，基因删除的成功率可超过50%，使该策略成为一种有价值的基因失活系统。黑粉真菌Ustilago maydis是一种具有高效同源重组能力的真核模式微生物。在其约6,900个基因中，许多基因已借助缺失突变体实现了功能表征，而反复无法完成基因替换则提示该基因可能具有必需功能。后续通过荧光标记或对预测功能域进行突变来进一步表征基因功能，同样依赖于同源重组介导的DNA交换。本文以最简单的基因删除为例，详细阐述U. maydis菌株的构建策略。üssing GmbH12174或使用本地供应商
NaClFisher ChemicalS316060或使用本地供应商
NaOHChemSolute13,751,000或使用本地供应商
NH4否3RothK299.1或使用本地供应商
烟酸（游离酸）Sigma AldrichN-4126
Nourseothricin 二氢硫酸盐  Werner BioAgents5,001,000
营养肉汤 Difco本地供应商
苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1) pH 6.7Sigma AldrichP3803危险物质。请查阅制造商的安全说明。
聚乙二醇（PEG）Sigma AldrichP-3640
乙酸钾AppliChem121479或使用本地供应商
吡哆醇（盐酸单水合物）Sigma AldrichP-9755
核黄素 Sigma AldrichR4500
RNaseASigma AldrichR5503
十二烷基硫酸钠RothCn30.3或使用本地供应商
小型注射器BD300300或使用本地供应商
无菌滤器， 22 µmVWR28145-477或使用本地供应商
山梨醇Roth6213.1或使用本地供应商
硫胺素盐酸盐塞尔瓦36020.02或使用本地供应商
三水合柠檬酸钠Fisher ChemicalS332060或使用本地供应商
三(羟甲基)氨基甲烷VWR103156X或使用本地供应商
Tris 盐酸盐Roth9090.4或使用本地供应商
Triton X-100 Serva 37240或使用本地供应商
ZnCl2Fluka96470或使用本地供应商
溶液组成/材料制备溶液的配制
Carboxin储存液：甲醇中 5 mg/ml，终浓度： 2 µg/ml
CM 平板0.25 % (w/v) 酪蛋白氨基酸，0.1 % (w/v) 酵母提取物，1.0 % (v/v) Holliday 维生素溶液，6.25 % (v/v) Holliday 盐溶液，0.05 % (w/v) DNA 酶解物游离酸，0.15 % (w/v) NH₄Cl4否3，2.0 % (w/v) Bacto 琼脂；用 5 M NaOH 调至 pH 7.0；高压灭菌后加入 1 % 葡萄糖 
遗传霉素（G418）储存液：50 mg/ml，溶于H2O，终浓度： 500 µg/ml
HCl清洗的玻璃珠（0.35-0.45 mm）用浓 HCl（25 %，7.8 M）覆盖玻璃珠，孵育 60 分钟，期间晃动数次。倾去 HCl（保留倾出液），用 3 M HCl 洗涤玻璃珠（保留倾出液）。用双蒸水反复洗涤玻璃珠数次2直至 pH 为 7（液体不再呈黄绿色）。分装玻璃珠并在 180 °C倾析出的盐酸在处理前必须中和。 
肝素储存液：15 mg/ml
Holliday 盐溶液16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl₂2*2H2O, 8.0 ‰ （v/v）微量元素，2.0 ‰ (w/v) MgSO₄4；无菌滤液
霍利迪维生素溶液 0.1‰ (w/v) 硫胺素，0.05‰ (w/v) 核黄素，0.05‰ （质量/体积）吡哆醇，0.2‰ (w/v) 泛酸钙，(0.05‰ （质量体积比）氨基苯甲酸，0.2‰ (w/v) 烟酸，0.2‰ （质量/体积）氯化胆碱，1.0‰ （w/v）肌醇；可保存于 -20 °C
潮霉素储存液：PBS 中 50 mg/ml，终浓度： 200 µg/ml
Nourseothricin储存液：200 mg/ml，溶于H2O，终浓度： 150 µg/ml
NSY-甘油培养基0.8 % (w/v) 营养肉汤，0.1 % (w/v) 酵母提取物，0.5 % (w/v) 蔗糖  80.0 % (v/v) 87% 甘油（终浓度 69.6%） 
RegLight1.0%（w/v）酵母提取物  0.4 % (w/v) Bacto Peptone，0.4 % (w/v) 蔗糖，18.22 % (w/v) 山梨醇，1.5 % (w/v) 琼脂
SCS，pH 5.8溶液1：20 mM 三钠柠檬酸盐，1 M 甘露醇；溶液2：20 mM 柠檬酸，1 M 甘露醇；将溶液2加入溶液1中，直至pH达到5.8；高压灭菌
STC，pH 81 M 山梨醇，10 mM Tris-HCl pH 7.5，100 mM CaCl₂2；过滤除菌
STC/PEGSTC 缓冲液中含 40 % (v/v) PEG 
TE缓冲液，pH 81.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O
TE/RNase10 µg/ml RNaseA in TE 缓冲液
微量元素0.06‰ （质量体积比）H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl·4H₂O2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl₂2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ （质量/体积百分比）CuSO₄4*5H2O
木霉溶菌酶溶液12.5 mg/ml SCS；过滤除菌；临用前配制
Tris-HCl pH 7.5806 mM Tris-HCl，194 mM Tris-Base；检测pH值，必要时用HCl调节；高压灭菌
Usti-lysis 缓冲液 1，pH 810 mM Tris-HCl (pH 8.0)，10 mM NaCl，1% (w/v) SDS，2% (v/v) TritonX-100，1 mM EDTA。不要使用pH计测定pH值。 
Usti-lysis 缓冲液 2将 Usti 裂解缓冲液 1 与 1x TE 按 1:1 体积比混合
YEPS-轻培养基1.0% (w/v) 酵母提取物，0.4% (w/v) 胰蛋白胨，0.4% (w/v) 蔗糖；用于平板：1.5% (w/v) 胰琼脂

参考文献

  1. Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
  2. Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).
  3. Banuett, F. Ustilago maydis, the delightful blight. Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).
  4. Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. The homologous recombination system of Ustilago maydis. Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).
  5. Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis. Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).
  6. Ökmen, B., Doehlemann, G. Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).
  7. Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).
  8. Kämper, J. A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).
  9. Terfrüchte, M., et al. Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi. Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).
  10. Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
  11. Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. Journal of Visualized Experiments. (83), e50712(2014).
  12. Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis. New Phytologist. 187, 957-968 (2010).
  13. van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune. Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).
  14. Sarkari, P., et al. Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).
  15. Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities. Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).
  16. Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei. Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).
  17. Yu, J. J., et al. An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta. FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).
  18. Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining. P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).
  19. Colot, H. V., et al. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).
  20. Langner, T., et al. Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis. Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).
  21. Langner, T., Göhre, V. Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions. Current Genetics. , (2015).
  22. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloining: a laboratry manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  23. Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).
  24. Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis. Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).
  25. Vollmeister, E., et al. Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis. RNA. 15, 2206-2218 (2009).
  26. Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
  27. Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes. Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).
  28. Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking. eLife. 4, (2015).
  29. Kronstad, J. W., Leong, S. A. Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago. P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).
  30. Koepke, J., et al. The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1. Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).
  31. Schuler, D., et al. Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis. New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).
  32. Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system. Fungal Genetics and Biology. , (2015).

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植物病原真菌 Ustilago maydis 的遗传操作以研究真菌生物学及植物-微生物相互作用
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