我们描述了一种可靠的基因替换策略，用于对黑粉菌 Ustilago maydis 进行遗传操作。本实验方案详细说明了如何构建基因敲除突变体以研究其感染表型。该方法可进一步拓展，以实现对基因的任意修饰，例如，插入编码荧光蛋白标签的序列。
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方法文章
植物病原真菌 Ustilago maydis 的遗传操作以研究真菌生物学及植物-微生物相互作用
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
基因敲除在基因功能分析中具有重要作用。实现基因靶向失活的最有效方法之一是通过同源重组，用可筛选标记完全替换目标基因。在同源重组过程中，DNA交换发生在具有高度相似性的序列之间。因此，位于目标基因两侧的线性基因组序列可用于将可筛选标记特异性地引导至预期的整合位点。敲除载体的平末端可激活细胞的DNA修复系统，从而促进载体通过同源重组或非同源末端连接方式整合到基因组中。在同源重组效率较高的生物体中，成功实现基因敲除的比例可超过50%，使该策略成为一种有价值的基因失活系统。黑粉菌Ustilago maydis是一种表现出高效同源重组能力的真核模式微生物。在其约6,900个基因中，许多基因已通过敲除突变体实现了功能表征，而反复无法完成基因替换则提示该基因可能具有必需功能。后续通过荧光标记或对预测功能域进行突变来进一步表征基因功能，也依赖于同源重组介导的DNA交换。本文将以最简单的实例——基因敲除，详细阐述U. maydis菌株的构建策略。
引言
Ustilago maydis 是一种被广泛研究数十年的植物病原性模式真菌 1,2它具有两种形态：一种是类酵母的非致病阶段，另一种是丝状的感染性形态。 3. 同源重组和DNA修复机制等具有普遍意义的突破性发现均是在该真菌的类酵母生长阶段取得的 4此外，其向感染性菌丝的形态转换以及对感染至关重要的毒力因子均已得到充分表征。 5,6这种黑粉真菌的生物学与致病性相关分子知识的不断增长，依赖于一种简便的基因替换策略。 7-9 得益于出色的基因组注释 10 以及利用反向遗传学的简便性， 例如，本研究所井然有序的质粒库（http://www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html）。在玉米幼苗中进行标准化的快速侵染实验，可对致病性因子进行深入研究 11.
基因组的 U. maydis 包含约6,900个基因 10为了研究其功能，可利用高效的同源重组系统对它们进行单独或组合删除。含有完全同源末端的约1 kb侧翼区域最适合实现超过50%的同源重组率，而仅含250 bp并带有非同源末端的侧翼区域也能实现一定程度的正确整合。 9目前已有五种不同的抗性盒， hygR, cbxR, natR, ....
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方案
1. 缺失构建体的制备
- 构建含有基因敲除元件的质粒（图1）包含各自的1 kb上游侧翼区（UF）和下游侧翼区（DF），以及位于平端切割限制性酶切位点之间的相应抗性筛选标记盒。
注意：可使用任何克隆策略（克隆方法参见参考文献） 22）我们推荐对这类质粒采用Golden Gate克隆方法 9. - 使用平末端切割酶从质粒中切除基因敲除片段以获得 1 µg 基因敲除构建体的DNA 9纯化缺失构建体以去除酶和缓冲液 22 例如 使用商业试剂并遵循制造商的说明。
注意：载体骨架可保留在转化混合物中。
2. 原生质体的制备
注意：实验全程需保持无菌条件。细胞壁是一种强大的保护屏障，限制了分子进入质膜。为了使含有缺失构建体的 DNA 能够被吸收，需要通过原生质体化反应中使用的细胞壁降解酶去除细胞壁。原生质体制备的关键步骤包括：1）培养基的渗透压稳定；2）避免对原生质体施加机械应力。
- 用带有圆底的 2 ml 离心管标记以冷冻原生质体，并将其冷却至 -20 °C从具有所需遗传背景的菌株新鲜平板上挑取菌落，接种于3 ml YEPS-Light培养基中，开始预培养。置于旋转轮上，24....
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结果
四个几丁质降解基因编码的缺失构建体 U. maydis 基因组通过使用Golden Gate克隆技术构建 hygR 用于缺失的盒式元件 cts1好的，这是译文： ， natR 用于缺失 cts2，该 G418R 用于删除的盒式结构 cts3 以及 cbxR 用于缺失 cts4 20基因替换策略的总体概述以基因的缺失为例进行说明 cts3 (图1）。单突变体和双突变体 cts1 通过在两种不同的遗传背景下依次使用相同的构建体，获得了携带第二个几丁质酶基因的菌株，用于分析几丁质酶在毒力中的作用。实验采用了两种不同的菌株背景：AB33 能够诱导丝状生长，这是致病性的第一步。 23，SG200 是一种单一致病菌株，可实现快速疾病评分 10转化后 cts3-缺失构建体转.......
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讨论
本方案描述了在U. maydis中进行反向遗传学研究时构建基因缺失突变体的方法。起始材料为一个缺失载体，该载体包含目的基因上下游约1 kb的序列（分别位于起始密码子上游和终止密码子下游）以及一个经过先前优化的合适抗性筛选盒7,9。每个基因都需要单独构建相应的缺失载体，并在用于基因缺失前仔细验证其序列准确性。侧翼序列中的点突变可能导致基因组序列发生非预期的改变，特别是当侧翼序列延伸至邻近基因，或突变影响调控元件时。这种情况会影响所有转化子，并可能引起与目标基因缺失无关的表型和副作用。
在规划基因敲除策略时，必须考虑预期的表型以选择合适的遗传背景。在本例中，选择了 AB33 23 和 SG200 10，以便检测形态转换和植物侵染中的表型。类似地，其他多种检测指标也可能具有研究意义，e.g. 与 cts1 的融合可用于异源蛋白的分泌 14,26，而带有荧光标记 rrm4 的菌株背景则可用于分析内体上的 RNA 运输 27.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Benedikt Steuten博士对本文稿的审阅。几丁质酶相关的原始研究由Thorsten Langner博士完成。VG实验室由植物科学卓越集群（CEPLAS，DFG EXC 1028）和BioSC资助，KS实验室由BioSC资助，KB由BioSC资助。生物经济科学中心（BioSC）的科研活动在北莱茵-威斯特法伦州创新、科学与研究部的资助下开展，属于NRW战略项目BioSC（编号：313/323-400-00213）。LF获得了DFG国际研究培训项目1525 iGRADplant的博士生奖学金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氨基苯甲酸（游离酸） | Sigma Aldrich | A-9878 | |
| Bacto 琼脂 | BD | 214010 | 或使用本地供应商 |
| 胰蛋白胨 | BD | 211677 | 或使用本地供应商 |
| 酵母提取物 | BD | 212750 | 或使用本地供应商 |
| CaCl2*2H2O | Grüssing GmbH | 10234 | 或使用本地供应商 |
| 泛酸钙（半钙盐） | Sigma Aldrich | P-2250 | |
| Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
| 酪蛋白氨基酸 | BD | 223050 | |
| 氯化胆碱 | Sigma Aldrich | C-1879 | |
| 柠檬酸 | ChemSolute | 24,321,000 | 或使用本地供应商 |
| CuSO₄4*5H2O | Fluka | 61240 | 或使用本地供应商 |
| D(+)蔗糖 | Roth | 4621.1 | 或使用本地供应商 |
| DNA降解相关游离酸 | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| FeCl3*6H2O | 基因删除在基因功能分析中起着重要作用。通过同源重组，用可筛选标记物替换整个目标基因，是实现基因靶向失活的最有效方法之一。在同源重组过程中，具有高度相似性的DNA序列之间发生交换。因此，可利用位于目标基因两侧的线性基因组序列，将可筛选标记物特异性地引导至预期的整合位点。删除构建体的平末端可激活细胞的DNA修复系统，从而促进构建体通过同源重组或非同源末端连接方式整合。在同源重组效率较高的生物中，成功实现基因删除的比例可超过50%，使该策略成为一种有价值的基因失活系统。黑粉菌（Ustilago maydis）是一种真核模式微生物，具有高效的同源重组能力。在其约6,900个基因中，许多基因已通过缺失突变体实现了功能表征，而反复无法完成基因替换则提示该基因可能具有必需功能。后续通过荧光标记物标记基因或对预测功能域进行突变以进一步表征基因功能，也依赖于同源重组介导的DNA交换。本文以最简单的基因删除为例，详细介绍了U. maydis菌株的构建策略。üssing GmbH | 10288 | 或使用本地供应商 |
| 遗传霉素（G418）二硫酸盐 | Sigma Aldrich | A1720 | |
| 木霉溶菌酶 | Sigma Aldrich | L1412 | |
| D(+)葡萄糖 | Caelo | 2580 | 或使用本地供应商 |
| 甘油 | Fisher Chemical | G065015 | 或使用本地供应商 |
| H3BO3 | AppliChem | A2940 | 危险物质。请查阅生产商的安全说明。 |
| 肝素钠盐 | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
| 潮霉素B溶液 | Roth | 1287.2 | 危险物质 |
| KCl | VWR | 26764298 | 或使用本地供应商 |
| KH2PO4 | AppliChem | A3620 | 或使用本地供应商 |
| MgSO₄4 无水 | 默克 | 7487-88-9 | 无水环境至关重要。也可使用本地供应商提供的无水试剂 |
| MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | 或者使用本地供应商 |
| 肌-肌醇 | Sigma Aldrich | I-5125 | |
| Na2-EDTA·2H₂O2O | AppliChem | A2937 | 或使用本地供应商 |
| Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | 或使用本地供应商 |
| Na2SO4 | 基因删除在基因功能分析中发挥着重要作用。通过同源重组，用可筛选标记完全替换整个基因，是实现基因靶向失活的最有效方法之一。在同源重组过程中，高相似性序列之间发生DNA交换。因此，可利用位于靶基因两侧的线性基因组序列，将可筛选标记特异性地引导至目标整合位点。删除载体的平末端可激活细胞的DNA修复系统，从而促进载体通过同源重组或非同源末端连接方式整合。在同源重组效率较高的生物中，基因删除的成功率可超过50%，使该策略成为一种有价值的基因失活系统。黑粉真菌Ustilago maydis是一种具有高效同源重组能力的真核模式微生物。在其约6,900个基因中，许多基因已借助缺失突变体实现了功能表征，而反复无法完成基因替换则提示该基因可能具有必需功能。后续通过荧光标记或对预测功能域进行突变来进一步表征基因功能，同样依赖于同源重组介导的DNA交换。本文以最简单的基因删除为例，详细阐述U. maydis菌株的构建策略。üssing GmbH | 12174 | 或使用本地供应商 |
| NaCl | Fisher Chemical | S316060 | 或使用本地供应商 |
| NaOH | ChemSolute | 13,751,000 | 或使用本地供应商 |
| NH4否3 | Roth | K299.1 | 或使用本地供应商 |
| 烟酸（游离酸） | Sigma Aldrich | N-4126 | |
| Nourseothricin 二氢硫酸盐 | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
| 营养肉汤 | Difco | 本地供应商 | |
| 苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1) pH 6.7 | Sigma Aldrich | P3803 | 危险物质。请查阅制造商的安全说明。 |
| 聚乙二醇（PEG） | Sigma Aldrich | P-3640 | |
| 乙酸钾 | AppliChem | 121479 | 或使用本地供应商 |
| 吡哆醇（盐酸单水合物） | Sigma Aldrich | P-9755 | |
| 核黄素 | Sigma Aldrich | R4500 | |
| RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Roth | Cn30.3 | 或使用本地供应商 |
| 小型注射器 | BD | 300300 | 或使用本地供应商 |
| 无菌滤器， 22 µm | VWR | 28145-477 | 或使用本地供应商 |
| 山梨醇 | Roth | 6213.1 | 或使用本地供应商 |
| 硫胺素盐酸盐 | 塞尔瓦 | 36020.02 | 或使用本地供应商 |
| 三水合柠檬酸钠 | Fisher Chemical | S332060 | 或使用本地供应商 |
| 三(羟甲基)氨基甲烷 | VWR | 103156X | 或使用本地供应商 |
| Tris 盐酸盐 | Roth | 9090.4 | 或使用本地供应商 |
| Triton X-100 | Serva | 37240 | 或使用本地供应商 |
| ZnCl2 | Fluka | 96470 | 或使用本地供应商 |
| 溶液组成/材料制备 | 溶液的配制 | ||
| Carboxin | 储存液：甲醇中 5 mg/ml，终浓度： 2 µg/ml | ||
| CM 平板 | 0.25 % (w/v) 酪蛋白氨基酸，0.1 % (w/v) 酵母提取物，1.0 % (v/v) Holliday 维生素溶液，6.25 % (v/v) Holliday 盐溶液，0.05 % (w/v) DNA 酶解物游离酸，0.15 % (w/v) NH₄Cl4否3，2.0 % (w/v) Bacto 琼脂；用 5 M NaOH 调至 pH 7.0；高压灭菌后加入 1 % 葡萄糖 | ||
| 遗传霉素（G418） | 储存液：50 mg/ml，溶于H2O，终浓度： 500 µg/ml | ||
| HCl清洗的玻璃珠（0.35-0.45 mm） | 用浓 HCl（25 %，7.8 M）覆盖玻璃珠，孵育 60 分钟，期间晃动数次。倾去 HCl（保留倾出液），用 3 M HCl 洗涤玻璃珠（保留倾出液）。用双蒸水反复洗涤玻璃珠数次2直至 pH 为 7（液体不再呈黄绿色）。分装玻璃珠并在 180 °C倾析出的盐酸在处理前必须中和。 | ||
| 肝素 | 储存液：15 mg/ml | ||
| Holliday 盐溶液 | 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl₂2*2H2O, 8.0 ‰ （v/v）微量元素，2.0 ‰ (w/v) MgSO₄4；无菌滤液 | ||
| 霍利迪维生素溶液 | 0.1‰ (w/v) 硫胺素，0.05‰ (w/v) 核黄素，0.05‰ （质量/体积）吡哆醇，0.2‰ (w/v) 泛酸钙，(0.05‰ （质量体积比）氨基苯甲酸，0.2‰ (w/v) 烟酸，0.2‰ （质量/体积）氯化胆碱，1.0‰ （w/v）肌醇；可保存于 -20 °C | ||
| 潮霉素 | 储存液：PBS 中 50 mg/ml，终浓度： 200 µg/ml | ||
| Nourseothricin | 储存液：200 mg/ml，溶于H2O，终浓度： 150 µg/ml | ||
| NSY-甘油培养基 | 0.8 % (w/v) 营养肉汤，0.1 % (w/v) 酵母提取物，0.5 % (w/v) 蔗糖 80.0 % (v/v) 87% 甘油（终浓度 69.6%） | ||
| RegLight | 1.0%（w/v）酵母提取物 0.4 % (w/v) Bacto Peptone，0.4 % (w/v) 蔗糖，18.22 % (w/v) 山梨醇，1.5 % (w/v) 琼脂 | ||
| SCS，pH 5.8 | 溶液1：20 mM 三钠柠檬酸盐，1 M 甘露醇；溶液2：20 mM 柠檬酸，1 M 甘露醇；将溶液2加入溶液1中，直至pH达到5.8；高压灭菌 | ||
| STC，pH 8 | 1 M 山梨醇，10 mM Tris-HCl pH 7.5，100 mM CaCl₂2；过滤除菌 | ||
| STC/PEG | STC 缓冲液中含 40 % (v/v) PEG | ||
| TE缓冲液，pH 8 | 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O | ||
| TE/RNase | 10 µg/ml RNaseA in TE 缓冲液 | ||
| 微量元素 | 0.06‰ （质量体积比）H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl·4H₂O2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl₂2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ （质量/体积百分比）CuSO₄4*5H2O | ||
| 木霉溶菌酶溶液 | 12.5 mg/ml SCS；过滤除菌；临用前配制 | ||
| Tris-HCl pH 7.5 | 806 mM Tris-HCl，194 mM Tris-Base；检测pH值，必要时用HCl调节；高压灭菌 | ||
| Usti-lysis 缓冲液 1，pH 8 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，10 mM NaCl，1% (w/v) SDS，2% (v/v) TritonX-100，1 mM EDTA。不要使用pH计测定pH值。 | ||
| Usti-lysis 缓冲液 2 | 将 Usti 裂解缓冲液 1 与 1x TE 按 1:1 体积比混合 | ||
| YEPS-轻培养基 | 1.0% (w/v) 酵母提取物，0.4% (w/v) 胰蛋白胨，0.4% (w/v) 蔗糖；用于平板：1.5% (w/v) 胰琼脂 |
参考文献
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
- Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (201....
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