核酸的传递通过显微注射胚胎在世界范围内的农业害虫，地中海实蝇

摘要

地中海果蝇 Ceratitis capitata （Diptera： Tephritidae） 是一种世界性的农业害虫。更深入地了解其生物学特性是控制麦蝇种群从而减少经济影响的关键。胚胎显微注射是允许该物种进行种系转化和反向遗传学研究的基本工具。

摘要

地中海果蝇（地中海果蝇） 地中海实蝇 （威德曼）（双翅目:实蝇科）是一种害虫具有极高的相关性农业。这是由于其繁殖行为:女性损坏的水果和蔬菜的外表面时，他们产卵和他们的纸浆孵仔鱼饲料。野生C.实蝇种群是通过传统的杀虫剂喷洒控制和/或环保的方法，最成功的是昆虫不育技术（SIT）。到SIT依赖于大规模饲养，基于辐射灭菌，并且保持它们交配能力，但不能够生成可育后代的男性字段释放。的出现和生物技术工具在随后的快速发展，与地中海果蝇基因组序列的可用性在一起，极大地增强了我们这一物种的生物学的理解。这种青睐的新战略增殖基因组操纵，其中CAN为适用于控制人口。

在这种情况下，胚胎显微注射对扩大工具箱为地中海果蝇控制的双重角色。与该调节键的生物过程的基因的功能，以干扰的能力，事实上，扩展了我们的分子机械地中海果蝇侵袭下层的理解。另外，为了达到种系转化的能力有利于生产，可以在新的SIT设置将来的现场应用进行测试的多个转基因品系。事实上，基因操作可以用来赋予能，例如，可以使用在该领域并监控育雄性能理想性状，或可能导致生命早期阶段致死。这里，我们描述的方法来microinject核酸导入地中海果蝇胚胎来实现这两个主要目标。

引言

地中海果蝇（地中海果蝇） 地中海实蝇是一个世界性的物种，广泛破坏水果栽培作物。它属于实蝇科家族，包括若干害虫种类，如那些属于属实蝇和实蝇 。在地中海果蝇是这个家庭的研究最多的物种，它不仅已成为昆虫入侵¹的研究，同时也为优化虫害治理策略²的模式。

在地中海果蝇是一种多化性品种可以攻击300余种野生和栽培植物^3,4。该损害是由成年人和幼体阶段既造成:交配雌刺穿水果的表面产卵，从而使微生物影响他们的商业品质，而在果肉幼虫饲料。经过三年幼虫阶段，幼虫从主机出现，化蛹成土壤。 实蝇结球甘蓝显示一个几乎全世界发行，包括非洲，中东，澳大利亚西部，中美洲和南美洲，欧洲，和美国⁵的领域。

最常见的策略，以限制地中海果蝇虫害包括使用杀虫剂（ 如马拉硫磷，多杀菌素）和环境友好型昆虫不育技术^{（SIT）6。}后一种方法涉及释放到几十万暴露进行消毒，以电离辐射的男性的野性。这样灭菌的男性野生雌性交配导致没有后代，导致种群大小的减少，最终导致消除。虽然坐在多个广告系列已被证明有效的全球，它的主要缺点包括饲养和灭菌数以百万计的昆虫被释放的高成本。发布的个人标记是必要区分期间在现场捕获的野生昆虫无菌监测活动，它是使用荧光粉末目前实现的。这些过程是昂贵的，并有不希望的副作用^7。

为了优化和/或制定这种害虫的控制更加有效的办法，地中海果蝇生物学和遗传学已广泛被全球众多研究人员探讨。在地中海果蝇基因组序列^8,9的可用性，将有利于对基因功能的新的调查。 RNA干扰是这类研究的强有力的工具，它可以通过双链RNA（双链RNA）或siRNA（小干扰RNA）的显微注射来实现。这一技术已被使用，例如，以证明在C中的性别决定分子级联实蝇仅部分相对于该果蝇 ¹⁰的保守的。

协议的发展microinject允许C.地中海果蝇胚胎实蝇是第一非-Drosophilid蝇种进行遗传修饰。作为它的卵是相似的果蝇的，无论是在形态和性方面对干燥^11中 ，协议递送质粒DNA到第一对D.开发胚前期胚胎黑 ^12,13 最初适合用于C.实蝇 。这些第一实验允许基于转座子米诺斯¹¹地中海果蝇种系改造。接着，将原来的系统是使用其他基于转座子的方法改性^14。这是piggyBac转从鳞翅目夜蛾 ¹⁵的情况。该协议已经被进一步优化，这已经允许的其他品种tephritid ^16-21的转型也有许多其他双翅目^22-31的。所有这些系统依赖于使用一个典型的二元矢量/辅助质粒转化体系:人为的，有缺陷的TRANSPO含有目的基因的儿子被组装到质粒DNA并通过提供转座酶³²集成到昆虫的基因组中。已经产生了许多转基因地中海果蝇线，具有多种功能，包括携带诱导杀伤力有条件的显性致死基因的菌株，株产仅限男性后代，因此不需要额外的性别鉴定的策略，并用荧光精子的菌株，这可以提高精度的SIT监测阶段^33-37。虽然在转基因生物的野生释放在导频测试已发生针对蚊子仅^38,39，至少一个公司正在评估一些转基因地中海果蝇菌株对它们在字段⁴⁰使用。

胚胎显微注射也可以偏向的新的基因组编辑工具，例如转录活化剂 - 样效应核酸（TALENS），群集定期相互间隔短回文重复序列的发展（CRISPR）/ CRISPR相关蛋白9核酸酶（Cas9）和归巢核酸内切酶基因（HEGs），这将使新的进化和发展的研究，以及扩大现有的生物技术工具箱。基因组编辑的办法已经允许在蚊子的基因⁴¹驱动系统的产生，和他们转移到地中海果蝇是迫在眉睫。在这里，我们描述了在显微注射胚胎地中海果蝇核酸可以为上述所有应用程序非常有用的通用协议。

方案

1.实验装置

1. 养虫要求
   1. 维护所有C.实蝇生命阶段在25°C，湿度65％和12/12小时的光/暗光周期。
   2. 将约1,500-2,000地中海果蝇蛹在6升笼子。使用笼黄铜一侧网有孔小到足以刺激产卵^42。插入海绵​​条通过在笼的底部的小开口通过毛细作用的手段，以提供与水蝇。使用酵母和糖（1:10）作为用于成年人（ 图1A）的食物源的混合物。提高酵母的量（高达1:3，酵母:糖）应女性不产卵。
   3. 将充满水笼下方的板收集通过网格沉积在鸡蛋。随着处女雌可以排卵，等到苍蝇是收集卵子显微注射实验先老，至少6-7天。这将确保女性都会有交配并且该鸡蛋将已受精。
   4. 通过用细网过滤器过​​滤的水收集鸡蛋。从过滤器转移蛋在塑料盒含有标准幼虫食物（1.5 LH ₂ O，加入100ml盐酸1％，5克的广谱抗微生物剂溶解在50毫升乙醇中400克糖，175克软化水啤酒酵母，1使用巴斯德吸管公斤软麦麸）。
   5. 放置每个方块在用网盖关闭的透明容器，让空气流通，并含有麸皮层有利于化蛹（ 图1B）。
   6. 经过约10天，检查3 ^龄幼虫，从幼虫的食物出现并且跳进了化蛹麸皮层。
   7. 24小时后，用软刷收集了一小杯蛹并把它们转移到一个新的成人笼子。正常成人化蛹后10天出现。新兴飞使用ptilinum，充气袋位于其头顶次触角电子基，以强制关闭puparium的末尾。出苗后，ptilinum永久性崩溃后脑勺里面。
2. 1升食品准备显微注射幼虫
   1. 溶解2.5克琼脂在300毫升H ₂ O
   2. 温馨500毫升H ₂ O于热搅拌盘和化解4克苯甲酸钠，4.5毫升37％的盐酸，41克酵母提取物和115克脱水胡萝卜粉。
   3. 添加到混合物溶于10毫升无水乙醇2.86克广谱抗微生物剂的溶液中。
   4. 分发媒体15厘米的圆形培养皿并冷却。如果有必要，应储存于4℃。
3. 幻灯片准备
   1. 放置双面胶带2厘米长条在显微镜载玻片（75×26 ^平方毫米）和标记有中国标记的边缘，以防止油扩散和注入胚胎的随后干燥。
4. 核酸制品
   1. 使用市售的试剂盒³⁴分离质粒DNA。用乙醇沉淀质粒，并在注射缓冲液（0.1 mM磷酸盐缓冲液pH 7.4，5mM的KCl）中在所需的浓度重新悬浮。
   2. 纯化在体外使用苯酚-氯仿原料合成长的dsRNA，沉淀用异丙醇和在注射缓冲液⁴³重新悬浮。

2.胚芽制备

1. 将含有6-7日龄成虫笼下一个装满水的托盘。
2. 允许雌性产卵30分钟，然后通过使用一个细滤网过滤水收集胚胎。始终保持滤网的水，以避免胚胎干燥。
3. 通过浸没式为5秒的过滤器在商业50％漂白溶液Dechorionate胚胎。
4. 通过反复佛光普照清洁超纯水过滤（至少仔细清洗胚胎4-5倍）。最后，将干净的超纯水过滤。使用最多2小时内的胚胎。
   注:显微注射的定时相关的必要性时细胞化之前核分裂的相位以注入胚前期胚胎，。这允许将要采取行动的注射DNA导入细胞核，具体到原始生殖细胞的细胞核，将发起的配子。在果蝇中 ，细胞化在极细胞开始在约90分钟受精后（在25℃），具有胚形成中发生约30分钟后^44，而在地中海果蝇细胞化需要9和12小时^45,46之间。
5. 行胚胎方向
   1. 使用精细的画笔，收集约50胚胎，并把它们用清水浸泡黑色滤纸的磁盘上。
   2. 在解剖立体显微镜，安排在一排的胚胎在双面胶带的上表面上用细画笔（000）的显微镜载片（ 图1C）。
      注:对齐都在同一个方向的胚胎，作为喷射在后极，其中，种系将发起执行;后极是相反的珠孔区域。
   3. 盖上三氟了一层油确保油不溢出中国的标记边界（见1.3）的胚胎。
      注意:覆盖油胚胎之前，可以执行进一步的步骤:胚胎可以干燥处理几分钟，以减少它们的液体含量，从而促进注入的DNA溶液的入口。这可以帮助避免注射或注射溶液的过量泄漏期间胚胎破裂，因为高的液体压力的结果。

3.胚胎显微注射

1. 填充针（1-2微升）用质粒DNA或用微量的dsRNA溶液（1-2微克/微升）。
2. 针连接到微注射装置，其控制喷射时间（0.5秒），压力（800百帕）和背压（150帕斯卡）。
3. 在立体显微镜下进行的显微注射，使用显微来控制针（ 图1D）的运动。使用显微镜舞台上移动的幻灯片。
   1. 广场上的范围阶段的幻灯片。
   2. 插入针的尖端进入胚胎（ 图1E）的后极。
   3. 通过激活显微注射系统与踏板注入该溶液。注入的液体引起的内压增加，从而导致胚胎的轻微运动。
   4. 松开踏板，马上，而是轻轻，取出胚胎针。
   5. 观察注射部位稍微细胞质泄漏。
      注:由于注射亲DNA /双链RNA / siRNA和死亡率的潜在致命影响区分cedure本身，对照实验必须执行。这些包括缓冲器的注入，或仅在反向遗传学实验的情况下，绿色荧光蛋白（GFP）的衍生双链RNA（dsRNA的-GFP），或siRNA。
4. 注射后孵育胚胎在25℃。

4.后喷射过程

1. 注射后两天，查体视显微镜下孵幼虫（ 图1F）的幻灯片。幼虫可在油中移动，但需要被尽快转移到幼虫的食物。为此，检查幻灯片，每天数次。
2. 使用精细的画笔（000），在孵幼虫轻轻地转移到基于胡萝卜幼虫的食物。传输最高可达每每个培养皿200幼虫。
3. 孵育幼虫在65％的湿度（25℃）。确保盖子不沾的菜，影响空气交换。
4. 保持培养皿的盖大多关闭，使得仍有空气流的幼虫。为了避免过度干燥，每天检查的菜，如果需要，加水以补偿蒸发。
5. 放置培养皿中在由网状盖关闭明确容器和含有麸皮层有利于化蛹。至于日常的养虫室饲养，3 ^龄幼虫跳出幼虫的食物和化蛹在麸皮。
6. 收集蛹，并放置在一个小笼子成人饲养和筛选（这是第0代，G0）。后在标准幼虫食后代。
7. 在种系转化实验的情况下，为您在下一代可能改变个人（G1），作为注入个人通常是嵌合体。换位事件，事实上，可能发生在任何胚胎合胞体的核，这将形成任一种系或体细胞的。
   1. 出苗后不久，使用_二氧化碳麻醉G1个人和检查TRANSF落射荧光立体显微镜下ormation事件。为了筛选红色荧光的存在，可以使用一个DsRedwide滤波器（内线一十二分之五百四十六;电解金属锰七十五分之六百〇五），而到屏幕为绿色荧光使用EYFP滤波器（内线二十○分之五百;电解金属锰三十〇分之五百三十五） 。
   2. 将转化个人在一个小笼子里与异性的野生型成人和发起新的初始杂，应变。

结果

在这里，我们分别报告指示在感兴趣的基因的功能表征胚胎显微注射的两个应用程序（情况1）中，在（情况2）的代转基因品系的。

dsRNA的交付成胚胎解开基因的功能。

所述innexin-5基因编码，在昆虫，具体在雄性和雌性性腺^43,47,48表示的间隙连接。根据可用于密切相关的物种中的信息中，dsRNA诱导的基因沉默被预期导致在地中海果蝇雌性和雄性种系的消融。 2400胚胎的总数目用2微克/微升的dsRNA混合物，从中548幼虫孵出和216成人存活（未公布的数据）注射。在成人，睾丸和卵巢的约75％似乎是任一欠开发板的PED或完全不存在（ 图2）。 innexin -5-转录物丰度在从两性个体的腹部的量化证实了基因的显著低表达，如与对照相比。

讨论

核酸在昆虫胚胎显微注射是一个普遍的技术，该技术有利于基因的功能和生物技术应用中的两个分析。

最近从越来越多的昆虫物种的基因组序列的出版物导致为未知功能的基因的功能表征工具的迫切需要。 RNA干扰已被证明是最有价值的方法之一来推断分子功能⁴⁹和胚胎显微注射利于这些研究。

质粒DNA注射可用于修改使用转座介导的基因插入昆虫基因组，并且，最近，基因组编辑工具（ 例如，TALEN，CRISPR / Cas9，HEGs）。这些技术已允许可能被用于害虫控制程序多种昆虫物种的菌株的发展，无论是在根除或在替换野生种群W的目标第i虫改良生物学特性。在这个协议中，我们描述了无论使用哪种质粒DNA双链RNA或地中海果蝇胚胎显微注射的优化方法。

的可用性成熟和具有成本效益的地中海果蝇饲养，以及由研究人员在研究该物种的性别鉴定和细胞化过程中取得了多年来的大量分子信息半干幼虫介质，大大方便建立了可靠的胚胎显微注射的协议。特别是，饲养协议已被优化，以确保在胚胎的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 x 进样缓冲液			0.1 mM 磷酸盐缓冲液 pH 7.4， 5 mM KCl
构建质
粒辅助质粒 质粒
dsRNA			苯酚-氯仿纯化
的标准幼虫食品			1.5 L H2O，100 ml HCl 1%，5 g 广谱抗菌剂，用于药品，溶于 50 ml 乙醇、400 g 糖、175 g 脱盐啤酒酵母、1 kg 软麦麸
幼虫食品			2.5 g 琼脂、4 g 苯甲酸钠、4.5 ml 37% HCl、42 g 酵母提取物、115 g 胡萝卜粉、2.86 g 广谱抗菌剂，水至 1 L
成人食品			酵母提取物和糖 （1：10）
显微镜载玻片	Sigma-Aldrich	Z692247
注射针	Eppendorf	5242956000
微型加载机	Eppendorf	5242956003
双滑带
Whatman 黑色圆圈纸	Sigma-Aldrich	Z695505
漂白剂			1：2 使用前
（000）
显微作器	Narishige	MN-153
显微注射器	Eppendorf		Femtojet
成人笼
子 三氟氯乙烯油	Sigma-Aldrich	H8898
头状脑炎			使用的菌株是 ISPRA