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方法文章

通过胚胎显微注射将核酸递送至全球重要农业害虫昆虫地中海实蝇 Ceratitis capitata

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DOI：

10.3791/54528

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2016年10月1日

 , 
1Department of Biology and Biotechnology, University of Pavia

本文内容

摘要

地中海实蝇（Ceratitis capitata）（双翅目：实蝇科）是全球农业的重要害虫。深入了解其生物学特性对于控制地中海实蝇种群、减少经济损失至关重要。胚胎显微注射是该物种中实现生殖系转化和反向遗传学研究的基本工具。

摘要

地中海果蝇（Ceratitis capitata）（Wiedemann）（双翅目：实蝇科）是一种具有极高农业重要性的害虫。这与其繁殖行为密切相关：雌虫在果实和蔬菜表面产卵时会造成果表损伤，孵化出的幼虫则以果肉为食。传统的野生型C. capitata种群防控方法主要包括化学杀虫剂喷洒和/或环境友好型策略，其中最为成功的是昆虫不育技术（Sterile Insect Technique, SIT）。SIT技术依赖于大规模饲养、利用辐射使雄虫不育，并将其释放到田间；这些雄虫仍具备交配能力，但无法产生可育后代。随着生物技术工具的出现及其快速进展，以及地中海果蝇基因组序列的获得，人们对这一物种生物学特性的理解得到了极大提升。这促进了多种新型基因组操作策略的发展，可用于种群控制。

在此背景下，胚胎显微注射在扩展地中海实蝇防控工具方面具有双重作用。通过干扰调控关键生物学过程的基因功能，能够加深我们对地中海实蝇入侵性背后分子机制的理解。此外，实现生殖系转化的能力有助于产生多种转基因品系，可用于未来在新型不育昆虫技术（SIT）环境下的田间试验。事实上，遗传操作可用于赋予理想的性状，例如用于监测田间不育雄虫的表现，或导致早期生活阶段的致死效应。本文介绍了一种对地中海实蝇胚胎进行核酸显微注射的方法，以实现上述两个主要目标。

引言

地中海果蝇（Ceratitis capitata）是一种世界性分布的物种，对水果和栽培作物造成严重危害。它属于实蝇科（Tephritidae），该科包含多个害虫种类，例如Bactrocera属和Anastrepha属的物种。地中海果蝇是该科中研究最为深入的物种，不仅成为研究昆虫入侵的模式生物1，也被广泛用于优化害虫管理策略的研究2。

地中海实蝇是一种多化性物种，可侵害300多种野生和栽培植物3,4。其成虫和幼虫阶段均会造成危害：交配后的雌虫在果实表面刺孔产卵，导致微生物侵入并影响果实的商品品质；而幼虫则取食果肉。经过三个幼虫阶段后，幼虫从寄主果实中钻出，进入土壤化蛹。Ceratitis capitata的分布几乎遍及全球，包括非洲、中东、西澳大利亚、中美洲和南美洲、欧洲、美国部分地区5。

目前控制地中海实蝇侵害的最常见策略包括使用杀虫剂（例如，马拉硫磷、多杀菌素）以及环境友好型的“昆虫不育技术”（Sterile Insect Technique, SIT）6。后者涉及向野外释放数十万只经电离辐射处理而失去生育能力的雄性个体。这些不育雄性与野生雌性交配后无法产生后代，从而导致种群数量下降，最终实现根除。尽管SIT已在全球多个防控项目中证明有效，但其主要缺点包括大规模饲养和不育数百万昆虫所带来的高昂成本。在监测过程中，必须对释放的个体进行标记，以区分田间捕获的不育个体与野生昆虫，目前这一标记主要通过荧光粉末实现。这些操作成本较高，并可能带来不良副作用7。

为了优化和（或）开发更有效的地中海实蝇防控方法，全球众多研究人员已广泛开展了地中海实蝇生物学与遗传学的研究。地中海实蝇基因组序列的获得8,9将有助于开展基因功能的新颖研究。RNA干扰是此类研究的有力工具，可通过显微注射双链RNA（dsRNA）或小干扰RNA（siRNA）实现。例如，该技术已被用于证明，地中海实蝇（C. capitata）的性别决定分子级联途径相对于果蝇（Drosophila）仅部分保守10。

显微注射地中海实蝇胚胎的实验方案的建立使得 C. capitata 首个经过基因改造的非果蝇属蝇类物种。因其卵子与果蝇的卵子相似 果蝇在形态和抗干燥能力方面均如此11，将质粒DNA导入囊胚前期胚胎的实验方案最初是为 D. melanogaster12,13 最初被改进以用于 C. capitata这些初步实验实现了基于转座元件Minos的地中海实蝇种系转化。11随后，对原始系统进行了修改14 使用其他基于转座子的方法。这种情况适用于 piggyBac 来自鳞翅目 Trichoplusia ni15该方案此后得到了进一步优化，从而实现了对其他实蝇科物种的转化。16-21 以及其他许多双翅目昆虫22-31所有这些系统均依赖于典型的双元载体/辅助质粒转化系统：将含有目的基因的人工缺陷型转座子构建到质粒DNA中，并通过提供转座酶将其整合到昆虫基因组中32已培育出多种转基因地中海实蝇品系，其特征多样，包括携带可诱导致死的条件性显性致死基因的品系、仅产生雄性后代因而无需额外性别筛选策略的品系，以及具有荧光精子的品系，后者可能提高昆虫不育技术（SIT）监测阶段的准确性33-37尽管转基因生物在野外的释放仅在针对蚊子的试点测试中进行过38,39至少有一家公司正在评估多种转基因地中海实蝇品系在田间应用的可行性40.

胚胎显微注射还有助于开发新的基因组编辑工具，例如转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）、成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9核酸酶（Cas9）以及归巢内切酶基因（HEGs），这些工具将推动新的进化与发育研究，并拓展现有的生物技术工具箱。基因组编辑技术已成功用于在蚊子中构建基因驱动系统41，而将其应用于地中海实蝇的工作也即将实现。本文描述了一种适用于地中海实蝇胚胎核酸显微注射的通用方案，可为上述所有应用提供支持。

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方案

1. 实验设置

  1. 昆虫饲养室要求
    1. 保持所有 C. capitata 25 °C、65% 湿度及 12/12 小时光照/黑暗光周期条件下的生活史阶段。
    2. 将约1,500–2,000只地中海实蝇蛹放入一个6 L的笼子中。使用一侧带有金属网的笼子，网孔应足够小以刺激产卵42通过笼底的小开口插入一条海绵条，利用毛细作用为果蝇提供水分。使用酵母与蔗糖按1:10比例配制的混合物作为成虫的食物来源。图1A）。若雌虫产卵量不足，可增加酵母量（最高至酵母:糖 = 1:3）。
    3. 将装有水的培养皿置于笼子下方，用于收集通过网筛产下的卵。由于处女雌蝇也可能产卵，因此在收集用于显微注射实验的卵之前，需等待果蝇至少达到6-7日龄。这可确保雌蝇已完成交配，所产卵已受精。
    4. 用细网筛过滤水以收集卵。将筛子中的卵转移至含有标准幼虫食物的塑料盒中（1.5 L H2O，100 ml 1% HCl，5 g 广谱抗菌剂溶于 50 ml 乙醇，400 g 蔗糖，175 g 去矿物质啤酒酵母，1 kg 软小麦麸皮）使用巴斯德吸管。
    5. 将每个盒子放入透明容器中，用网状盖子密封以保证空气流通，并在容器内铺一层麦麸以促进化蛹（图1B).
    6. 大约10天后，检查3rd 从幼虫食物中孵出的龄期幼虫会跳入米糠层中化蛹。
    7. 24 小时后，用软毛刷将蛹收集到小杯中，并转移到新的成虫饲养笼中。成虫通常在化蛹后 10 天羽化。羽化时，果蝇利用其额囊 ptilinum，一个位于其头部触角基部上方的可充气囊状结构，以顶开蛹壳末端。羽化后， ptilinum 永久性地向内塌陷回头部。
  2. 微注射幼虫用1升食物的制备
    1. 将2.5 g琼脂溶解于300 ml H2O.
    2. 将500 ml H2在加热搅拌板上加热，并溶解4 g苯甲酸钠、4.5 ml 37% HCl、42 g酵母提取物和115 g脱水胡萝卜粉。
    3. 向混合物中加入由2.86 g广谱抗菌剂溶于10 ml无水乙醇中制成的溶液。
    4. 将培养基分装至15 cm圆形培养皿中，静置冷却。如需保存，置于4 °C环境中。
  3. 载玻片制备
    1. 在载玻片（75 × 26 mm）上放置一条2 cm长的双面胶带2）并用陶瓷标记笔标记边缘，以防止油扩散及注射后胚胎随之干燥。
  4. 核酸制备
    1. 使用市售试剂盒分离质粒DNA34使用乙醇沉淀质粒，并用注射缓冲液（0.1 mM 磷酸盐缓冲液 pH 7.4，5 mM KCl）重悬至所需浓度。
    2. 纯化 体外 使用酚-氯仿法合成长链dsRNA，异丙醇沉淀后重悬于注射缓冲液中43.

2. 胚胎制备

  1. 在装有6-7日龄成虫的笼子下方放置一个盛有水的托盘。
  2. 让雌虫产卵30分钟，然后用细筛过滤水收集胚胎。始终将筛子保持在水中，以防止胚胎干燥。
  3. 将筛子浸入商用50%次氯酸钠溶液中5秒，以去除胚胎的卵壳。
  4. 用洁净的超纯水反复浸洗筛子（至少4-5次），小心清洗胚胎。最后将筛子置于洁净的超纯水中。胚胎应在最多2小时内使用。
    注意：显微注射的时间取决于必须在囊胚前期胚胎阶段进行注射，即在细胞化之前的核分裂阶段。这使得注射的DNA能够进入细胞核，特别是进入将发育为配子的原始生殖细胞核。在Drosophila中，极细胞的细胞化始于受精后约90分钟（25 °C时），囊胚形成则在约30分钟后发生44，而在地中海果蝇中，细胞化发生在受精后9至12小时之间45,46。
  5. 将胚胎排列成行
    1. 使用细毛笔收集约50个胚胎，并将其放置在用水浸湿的黑色滤纸圆片上。
    2. 在解剖立体显微镜下，用细毛笔（000号）将胚胎排列在载玻片双面胶带的上表面，排成一行（图1C）。
      注意：应使所有胚胎朝向一致，因为注射部位位于将来形成生殖系的后极；后极与卵孔区域相对。
    3. 用一层氯三氟乙烯油覆盖胚胎，确保油不溢出中国记号笔所画的边界（见1.3）。
      注意：在用油覆盖胚胎之前，可额外进行一步操作：将胚胎干燥数分钟，以减少其液体含量，从而促进注射的DNA溶液进入。这有助于避免因内部液体压力过高而导致胚胎在注射时破裂或注射液大量泄漏。

3. 胚胎显微注射

  1. 使用微量移液器将质粒DNA或dsRNA溶液（1-2 µg/µl）吸入针头（1-2 µl）中。
  2. 将针头连接至显微注射装置，该装置可控制注射时间（0.5秒）、压力（800 hPa）和回压（150 hPa）。
  3. 在体视显微镜下进行显微注射，使用显微操作器控制针头的移动（图1D）。通过显微镜载物台移动载玻片。
    1. 将载玻片放置在显微镜载物台上。
    2. 将针头尖端插入胚胎的后极（图1E）。
    3. 踩下脚踏开关启动显微注射系统，注入溶液。注入的液体导致内部压力升高，从而引起胚胎轻微移动。
    4. 松开脚踏开关，并立即轻柔地将针头从胚胎中抽出。
    5. 观察注射部位是否有少量细胞质渗出。
      注意：为了区分DNA/dsRNA/siRNA可能引起的致死效应与显微注射操作本身导致的死亡率，必须进行对照实验。对照实验包括仅注射缓冲液，或在反向遗传学实验中注射绿色荧光蛋白（GFP）来源的双链RNA（dsRNA-GFP）或siRNA。
  4. 注射后，将胚胎在25 °C条件下孵育。

4. 注射后操作步骤

  1. 注射两天后，检查载玻片上是否有孵化的幼虫（图1F在体视显微镜下进行操作。幼虫可在油中活动，但需尽快转移至幼虫食物中。因此，应每天多次检查载玻片。
  2. 使用细毛画笔（000号）将孵化的幼虫轻轻转移至以胡萝卜为基础的幼虫培养基中。每个培养皿转移的幼虫数量最多不超过200条。
  3. 在25 °C、65%湿度条件下培养幼虫。确保盖子不粘附于培养皿，以免影响气体交换。
  4. 将培养皿的皿盖大部分保持关闭，以确保仍有空气流通至幼虫。为避免过度干燥，需每天检查培养皿，必要时添加水以补偿蒸发损失。
  5. 将培养皿放入一个透明容器中，容器口用网状盖子封闭，并在容器内铺一层麦麸以促进化蛹。至于常规昆虫饲养室的饲养，3rd 二龄幼虫从幼虫食物中跳出，在麦麸中化蛹。
  6. 收集蛹并将其放入小笼中进行成虫饲养和筛选（此为第0代，G0）。将后代饲养在标准幼虫食物上。
  7. 在进行生殖系转化实验时，应在下一代（G1）中检测可能的转化个体，因为被注射的个体通常为嵌合体。实际上，转座事件可能发生在胚胎合胞体的任一细胞核中，这些细胞核将发育为生殖系或体细胞。
    1. 孵化后不久，使用CO₂麻醉G1代个体2 在落射荧光体视显微镜下检查转化事件。筛选红色荧光时，使用DsRedwide滤光片（激发波长546/12；发射波长605/75）；筛选绿色荧光时，使用EYFP滤光片（激发波长500/20；发射波长535/30）。
    2. 将转化个体与相反性别的野生型成虫共同放入一个小笼子中，建立一个新的初始为杂合子的品系。

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结果

本文报道了胚胎显微注射技术的两种应用，分别用于目的基因的功能表征（案例1）和转基因品系的建立（案例2）。

将dsRNA递送至胚胎以揭示基因功能。

innexin-5 基因编码一种间隙连接蛋白，在昆虫中特异性表达于雄性和雌性性腺43,47,48。根据近缘物种的相关信息，预期通过dsRNA诱导的基因沉默将导致地中海实蝇雌雄生殖系的消退。共向2,400枚胚胎注射了浓度为2 µg/µl的dsRNA混合物，其中548只孵化为幼虫，216只发育为成虫（未发表数据）。约75%的成虫睾丸和卵巢表现为发育不良或完全缺失（图2）。对两性个体腹部innexin-5转录本丰度的定量分析证实，其基因表达水平显著低于对照组。

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讨论

向昆虫胚胎显微注射核酸是一种通用技术，可促进基因功能分析和生物技术应用。

近年来，越来越多昆虫物种的基因组序列被公布，这导致迫切需要开发用于功能未知基因功能表征的工具。RNA干扰已被证明是推断分子功能最有价值的方法之一49，而胚胎显微注射技术有助于开展此类研究。

质粒DNA注射可用于通过转座酶介导的基因插入来修饰昆虫基因组，近年来也可结合基因组编辑工具实现例如， TALEN、CRISPR/Cas9、HEGs）。这些技术已推动了多种昆虫品系的开发，这些品系可用于害虫防控项目，旨在根除野生种群，或以具有改良性状的昆虫取代野生种群。在本方案中，我们描述了一种针对地中海实蝇胚胎显微注射的优化方法，可用于注射质粒DNA或双链RNA（dsRNA）。

地中海实蝇的饲养已有成熟且经济高效的半干幼虫培养基，加之多年来研究人员在该物种性别决定和细胞化过程方面积累了丰富的分子信息，这些都极大地促进了建立可靠的胚胎显微注射方案。特别是，饲养方案已得到优化，...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者谨向“昆虫遗传学与基因组学”实验室的所有成员致以感谢，特别感谢Lorenzo Ghiringhelli，他在过去三十年中致力于地中海实蝇的饲养体系的开发、优化与维护工作。本文的部分代表性结果已获许可转载自Scolari F. 等，发表于《N. Biotechnology》，25(1)，76-84，2008年，文章标题为《利用荧光标记精子以改进对害虫昆虫地中海实蝇 Ceratitis capitata（Wiedemann；双翅目：果蝇科）的防控》，转载已获Elsevier出版社授权（许可号：3796240759880）。本研究得到了Cariplo-Regione Lombardia“IMPROVE”项目（FS）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 × 注射缓冲液0.1 mM 磷酸盐缓冲液 pH 7.4，5 mM KCl
质粒构建体
辅助质粒
双链RNA苯酚-氯仿纯化
标准幼虫饲料1.5 L H2O，100 ml 1% HCl，5 g 药用广谱抗菌剂溶于 50 ml 乙醇中，400 g 蔗糖，175 g 去矿物质啤酒酵母，1 kg 软小麦麸皮
胡萝卜幼虫饲料2.5 g 琼脂，4 g 苯甲酸钠，4.5 ml 37% HCl，42 g 酵母提取物，115 g 胡萝卜粉，2.86 g 广谱抗菌剂，加水至 1 L
成虫饲料酵母提取物与蔗糖（1:10）
显微镜载玻片Sigma-AldrichZ692247
注射针 Eppendorf5242956000
微量加样器Eppendorf5242956003
双面胶带
Whatman 黑色圆圈滤纸Sigma-AldrichZ695505
漂白剂使用前按 1:2 稀释
画笔（000号）
显微操作仪NarishigeMN-153
显微注射仪EppendorfFemtojet
成虫饲养笼
三氟氯乙烯油Sigma-AldrichH8898
Ceratitis capitata所用品系为 ISPRA

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