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方法文章

用于肽类激动剂效价测定实验中系列稀释的自动化声波移液技术

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DOI:

10.3791/54542

2016年11月10日

本文内容

摘要

在传统的基于移液头的连续稀释过程中,多肽吸附到塑料器皿上会显著影响活性测定结果,并干扰对药物发现过程中先导化合物筛选和优化阶段所依赖的构效关系的理解。本文描述了多肽样品自动化声学非接触式连续稀释的方法。

摘要

与小分子药物发现类似,筛选肽类激动剂需要对肽进行系列稀释以生成浓度-反应曲线。肽类筛选具有更高的复杂性,因为传统的基于移液枪头的样品操作方法会使肽暴露于大量塑料器皿表面,从而增加肽通过吸附作用损失的风险。减少肽与塑料器皿的过度接触可降低因黏附导致的肽损失,从而减少效价预测中的误差。我们此前已描述了非接触式声波移液技术在此类应用中的优势。 体外 高通量筛选肽类激动剂1在此,我们讨论一种完全集成的自动化解决方案,用于在微孔板中非接触式声波制备肽类系列稀释液,并以筛选小鼠胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)的肽类激动剂为例进行说明。我们的方法可实现基于细胞的高通量筛选以检测激动剂,并且易于扩展,以支持更高的样品通量,或允许增加检测板的复制数量例如,针对更多靶细胞系的检测 panel)。

引言

GLP-1R 是治疗2型糖尿病的已知药物靶点2该受体的天然肽类激动剂GLP-1具有一个 体内 半衰期为2-3分钟3GLP-1 与其G蛋白偶联受体结合后,通过内源性G蛋白激活腺苷酸环化酶,从而在下游生成第二信使cAMP。检测累积的cAMP可提供一种可靠的检测方法,用于监测受体激活状态,并筛选具有理想理化性质的GLP-1类似物。该检测方法需对测试样品进行系列稀释以构建浓度-反应曲线,而在处理肽类样品时尤为复杂。基于移液头的系列稀释制备过程中可能产生的误差此前已有报道。1,4,5肽类物质会吸附于塑料器皿,导致效价评估结果不可靠。通过在缓冲液中添加牛血清白蛋白(BSA)并使用硅化处理的塑料器皿,可在一定程度上减少肽的损失,但蛋白质结合仍具有不可预测性。特别是已有文献报道GLP-1在不同实验容器中的结合存在显著差异。6此外,实验室塑料器皿中使用的稳定剂可能会从吸头和微孔板中渗出,进入水相测定缓冲液,从而干扰蛋白质功能7, 8因此,有必要采用减少接触塑料器皿的方法,以提高测量结果的准确性。

声学液体分配器将高频声波聚焦于液体样品表面,从而将精确的纳升级液滴喷射到相邻的检测板中9。在制药行业中,声学喷射技术已广泛用于大规模合成化合物库的制备与筛选,并且该技术在小分子应用方面已得到充分验证10。据我们所知,我们是首个描述采用声学分配技术进行重组肽和合成肽制备的研究团队,并且我们此前已报道过该方法相较于传统的基于移液头的方法具有更高的准确性1

本文介绍了一种将非接触式声波转移技术用于制备肽段系列稀释液和直接稀释液,并将其整合到全自动微孔板操作机器人系统中的方法。此前已有多种涉及样本声波转移的方法被报道11。我们采用两步法来制备中间储备浓度,并对肽类似物进行系列稀释,以生成完整的剂量-反应曲线。将制备好的肽段与表达靶标小鼠GLP-1R的细胞共同孵育,利用 commercially available 均相时间分辨荧光(HTRF)检测法测定细胞内cAMP的累积量,作为肽激动剂活性的读数。该检测方法稳定可靠,适用于高通量384孔板格式,常规应用于检测方法开发和药物筛选项目12

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方案

1. 肽的系列稀释

  1. 配制检测缓冲液:在Hanks平衡盐溶液(HBSS)中加入25 mM HEPES、0.1% BSA和0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX),调节pH至7.4。
  2. 使用大量试剂分液器,向五块384孔低容量检测板的每孔中系统加入5 µl检测缓冲液。
    1. 根据制造商说明,使用内部软件创建加样程序,向384孔板的每个孔中加入5 µl体积的液体。
    2. 将分配卡式管路浸入检测缓冲液中,并用液体预冲洗管路。
    3. 将384孔低容量检测板放置于板架上。
    4. 按下开始。
  3. 将所有肽样品(无论储存介质如何)用检测缓冲液稀释,配制成100倍浓度的肽储备液。
    注意:根据具体情况,用于筛选的肽段可提供于磷酸盐缓冲液(PBS)或二甲基亚砜(DMSO)中 (例如, DMSO 会对具有二级修饰(如聚乙二醇化)的肽产生不利影响。
  4. 将25 µl 100倍浓度的肽段储备液加入声学兼容的384孔聚丙烯微孔板的第1至第5列中。该微孔板指定为“源板A”。确保源板(而非目标板)为平底,并符合声学仪器制造商规定的特定声学公差要求。
  5. 向A板的A23和A24孔中各加入25 µl 100倍参考对照品。
  6. 向A源板的第11-15列加入10 µl检测缓冲液,向第21-22列加入30 µl检测缓冲液。
  7. 向第二个经声波验证合格的384孔聚丙烯微孔板的第6-10列和第16-20列中每孔加入10 µl检测缓冲液。该板标记为“源板B”。
  8. 将源板 A 和 B 在 300 × g 离心 1 分钟。需放置适当的平衡板。
  9. 使用集成在自动化机器人系统中的声波液体分配器,将A源第1列中的100倍浓度肽储备液用检测缓冲液依次进行三步1:100的中间稀释。
    注意:编程需要进行板式重排,并使用剂量反应软件(由声学液体分配仪制造商提供),以实现从源 A 到源 B 的三次声学转移(参见 图1 用于板布局)。步骤1.9详细说明了本实验室在自动化机器人控制下所使用的液体分配器(参见 材料表):
    1. 将源板和检测板装入自动化系统中的板架区域。
    2. 打开自动化机器人软件,加载平板重格式化和剂量反应程序扩展方案,点击“运行”。
      注意:自动化系统指示一台声波液体分配器将源板A第1-5列中的250 nl液体转移至源板B第6-10列中,同时使用另一台可处理较大液体体积的声波液体分配器加入15 µl检测缓冲液进行补足以实现混匀。随后,自动化系统将源板B转移至集成离心机中,在300 × g条件下离心1分钟(所有离心步骤均包含适当的配平板)。源板B随后被送回声波液体分配器,将其中第6-10列的250 nl液体转移至源板A第11-15列,并加入15 µl检测缓冲液进行补足以实现混匀。自动化系统再将源板A转移至集成离心机中,在300 × g条件下离心1分钟。接着,源板A被送回声波液体分配器,将其中第11-15列的250 nl液体转移至源板B第16-20列,并加入15 µl检测缓冲液进行补足以实现混匀。随后,自动化系统将源板B转移至集成离心机中,在300 × g条件下离心1分钟。
      注意:最后,剂量反应实验方案指导声波液体处理系统从源板A和源板B中各4个连续稀释的孔中转移所需体积,以在检测板中建立完整的11个浓度点、每个点设复孔的剂量反应曲线(检测板已在上述步骤1.2中预先加入5 µl检测缓冲液)。自动化系统将检测板转移至内置离心机,以300 × g离心1分钟。

2. 细胞制备

  1. 在37 ºC水浴中快速解冻表达目标小鼠GLP-1受体的中国仓鼠卵巢(CHO)冷冻细胞,并将其重悬于20 ml分析缓冲液中。
  2. 将细胞悬液在室温(RT)下以200 × g离心5分钟。需使用适当的平衡。
  3. 弃去上清液,并将细胞沉淀重悬于10 ml分析缓冲液中。
  4. 用台盼蓝将细胞储备液按1:1稀释,使用自动细胞计数仪测定活细胞密度。将细胞重悬于分析缓冲液中,浓度为每毫升1.6 × 106个细胞(相当于每孔分析板中8,000个细胞)。
  5. 使用大量试剂分配器将5 µl细胞悬液加入分析板的每孔中(每孔已含有5 µl分析缓冲液中系列稀释的多肽),并在室温下孵育30分钟。

3. HTRF cAMP 检测实验

  1. 使用前将HTRF cAMP检测试剂盒置于室温下30分钟。
  2. 分别用裂解缓冲液(制造商提供的cAMP检测专用配方)将每种HTRF试剂(cryptate和d2)按1:20比例稀释。
    注意:警告:裂解缓冲液含有氟化钾(KF),具有毒性且为致畸物13。处理时,含KF的检测板应密封后焚烧,所有液体废弃物在排入下水道前必须用水稀释至<1 mmol/L。
  3. 使用多通道试剂分配器向检测板的所有孔中加入5 µl cryptate试剂。
  4. 使用多通道试剂分配器向检测板的第1至22列孔中加入5 µl d2试剂。
  5. 立即手动移液5 µl裂解缓冲液至检测板A23-D24孔,作为非特异性结合(NSB)对照孔;向E23-P24孔中加入5 µl d2试剂。
  6. 将检测板在室温下以200 × g离心1分钟,以充分混匀各孔内容物。
  7. 覆盖检测板以减少蒸发和光漂白,并在室温下孵育1小时。
  8. 使用酶标仪在320 nm激发光下检测荧光共振能量转移(FRET)信号,分别在620 nm和665 nm处读取发射光信号。

4. 数据分析

  1. 使用平均非特异性结合(NSB)值从所有孔中扣除背景。
  2. 根据665 nm/620 nm的比值计算%Delta F,方法如下:
    比值 = (A665nm/A620nm) × 104
    Delta F = ((样本比值 - RatioNSB) / RatioNSB) × 100
    其中,RatioNSB 为未加d2试剂的孔的比值。
  3. 计算未刺激细胞与用最大浓度GLP-1配体刺激的细胞之间的%激活率,方法如下:
    %激活 = (%Delta F样本 - %Delta F未刺激细胞) / (%Delta F GLP-1刺激细胞 - %Delta F未刺激细胞) × 100
  4. 通过四参数逻辑分析法分析浓度-反应曲线,并以参照对照定义的%激活率为纵坐标作图1

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结果

我们常规采用两步法通过声波转移技术稀释多肽。第一步,将声波分配器与自动化系统对齐,用于在两个源板上制备四种多肽储备液的中间稀释液(图1ab)。第二步,使用声波分配器进一步将源板A和B中的储备稀释液稀释,为每种待测多肽生成11个浓度点的浓度梯度(图1c)。每个多肽浓度梯度在检测板上从左到右以复孔形式点样,使得每块384孔检测板可同时筛选16种不同的多肽(图1c)。通过向检测板各孔补充检测缓冲液,确保每个孔中的总体积保持恒定(图1d)。同时,将参比多肽阳性对照以最大有效浓度转移至目标板中。

使用荧光酶标仪读取微孔板数据,并展示一个包含16种肽段(每个样本设两个复孔)的示例微孔板的热图(图 2a)。所使用的cAMP累积检测是一种反向竞争性检测,因此低值(显...

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讨论

本方案描述了采用自动化声波移液技术对肽样品进行系列稀释的成功应用,浓度范围可达3 × 106,且所需样品量少于1 µl。该方法的主要优势在于,通过减少样品与实验容器及塑料耗材(如移液枪头)的接触——这些耗材通常用于试剂转移和混合——从而最大限度地降低肽在塑料器皿上的吸附,提高数据质量。尽管声波移液技术并未完全排除塑料耗材的使用,但已显著减少了其使用量。此外,去除基于枪头的移液操作还可消除样品交叉污染,避免误差在整个系列稀释过程中累积,从而实现可靠且可重复的浓度-反应曲线制备14,15

其他研究团队已报道,将溶解在DMSO中的测试化合物通过声波转移直接递送至细胞,用于长期检测(>48小时),除倒置检测板并在一定时间内孵育外,无需额外的混匀步骤16,17。DMSO具有高度极性,与必须在PBS中配制和保存的生物样品相比,更易于与水溶液混合。因此,在采用自动化方法进行肽样品的声波转移时,我们增加了回补和离心步骤,以确保充分混匀,从而实现准确的样品系列稀释。我们的经验表明,仅靠离心不足以确保水相样品的完全混合,因此开...

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披露

作者无任何利益冲突披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
汉克斯’ 平衡盐溶液Sigma-AldrichH8264
HEPESSigma-AldrichH3375
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA9418
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤Sigma-AldrichI7018以DMSO配制为0.5 M的储存液
GLP-1(7-36)酰胺BachemH-6795以 PBS 配制为 1 mg/ml 的储存液,称为“100倍参考对照”
测试肽段在MedImmune内部生产根据需要以不同浓度提供于DMSO或PBS中
100倍肽段储备液在MedImmune内部生产将测试多肽用测定缓冲液稀释至最终所需浓度的100倍
0.4% 台盼蓝溶液赛默飞世尔科技15250-061
Cedex XS 细胞分析仪Innovatis
康宁384孔低容量板Sigma-Aldrich4514
Echo认证的384孔聚丙烯微孔板Labcyte Inc.P-05525
Echo认证储液槽Labcyte Inc.ER-0055
Echo 550 液体处理仪Labcyte Inc.液滴转移体积以2.5 nl为增量
Echo 525 液体处理仪Labcyte Inc.液滴转移体积,以25 nl为增量
ACell 台式自动化系统 HighRes BiosolutionsMC522
生命科学机器人用 Cellario 实验室自动化排程软件HighRes Biosolutions
Multidrop Combi 试剂分配器赛默飞世尔科技5840300被称为“大量试剂分配器”
HTRF cAMP 动态 2 试剂盒Cisbio Bioassays62AM4PEJ
EnVision 多功能酶标仪PerkinElmer

参考文献

  1. Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow. J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).
  2. Campbell, J. E., Drucker, D. J. Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action. Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).
  3. Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects. Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).
  4. Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, contact-free volume transfers minimize compound loss in dose-response experiments. J.Biomol.Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
  5. Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses. PLoS ONE. 8 (5), 62325(2013).
  6. Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
  7. McDonald, G. R., et al. Bioactive Contaminants Leach from Disposable Laboratory Plasticware. Science. 322 (5903), 917(2008).
  8. Belaiche, C., Holt, A., Saada, A. Nonylphenol ethoxylate plastic additives inhibit mitochondrial respiratory chain complex I. Clin Chem. 55 (10), 1883-1884 (2009).
  9. Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. J.Lab.Autom. 21 (1), 166-177 (2016).
  10. Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. J.Biomol.Screen. 14 (5), 452-459 (2009).
  11. Turmel, M., Itkin, Z., Liu, D., Nie, D. An Innovative Way to Create Assay Ready Plates for Concentration Response Testing Using Acoustic Technology. J.Lab.Autom. 15 (4), 297-305 (2010).
  12. Butler, R., et al. Use of the site-specific retargeting jump-in platform cell line to support biologic drug discovery. J.Biomol.Screen. 20 (4), 528-535 (2015).
  13. Panchal, S., Verma, R. J. Effect of sodium fluoride in maternal and offspring rats and its amelioration. Asian Pac.J.Reprod. 3 (1), 71-76 (2014).
  14. Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies. J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).
  15. Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments. J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
  16. Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing. J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).
  17. Roberts, K., et al. Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays. J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).

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