在传统的基于移液头的连续稀释过程中，多肽吸附到塑料器皿上会显著影响活性测定结果，并干扰对药物发现过程中先导化合物筛选和优化阶段所依赖的构效关系的理解。本文描述了多肽样品自动化声学非接触式连续稀释的方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
与小分子药物发现类似，筛选肽类激动剂需要对肽进行系列稀释以生成浓度-反应曲线。肽类筛选具有更高的复杂性，因为传统的基于移液枪头的样品操作方法会使肽暴露于大量塑料器皿表面，从而增加肽通过吸附作用损失的风险。减少肽与塑料器皿的过度接触可降低因黏附导致的肽损失，从而减少效价预测中的误差。我们此前已描述了非接触式声波移液技术在此类应用中的优势。 体外 高通量筛选肽类激动剂1在此，我们讨论一种完全集成的自动化解决方案，用于在微孔板中非接触式声波制备肽类系列稀释液，并以筛选小鼠胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）的肽类激动剂为例进行说明。我们的方法可实现基于细胞的高通量筛选以检测激动剂，并且易于扩展，以支持更高的样品通量，或允许增加检测板的复制数量例如，针对更多靶细胞系的检测 panel）。
引言
GLP-1R 是治疗2型糖尿病的已知药物靶点2该受体的天然肽类激动剂GLP-1具有一个 体内 半衰期为2-3分钟3GLP-1 与其G蛋白偶联受体结合后，通过内源性G蛋白激活腺苷酸环化酶，从而在下游生成第二信使cAMP。检测累积的cAMP可提供一种可靠的检测方法，用于监测受体激活状态，并筛选具有理想理化性质的GLP-1类似物。该检测方法需对测试样品进行系列稀释以构建浓度-反应曲线，而在处理肽类样品时尤为复杂。基于移液头的系列稀释制备过程中可能产生的误差此前已有报道。1,4,5肽类物质会吸附于塑料器皿，导致效价评估结果不可靠。通过在缓冲液中添加牛血清白蛋白（BSA）并使用硅化处理的塑料器皿，可在一定程度上减少肽的损失，但蛋白质结合仍具有不可预测性。特别是已有文献报道GLP-1在不同实验容器中的结合存在显著差异。6此外，实验室塑料器皿中使用的稳定剂可能会从吸头和微孔板中渗出，进入水相测定缓冲液，从而干扰蛋白质功能7, 8因此，有必要采用减少接触塑料器皿的方法，以提高测量结果的准确性。
声学液体分配器将高频声波聚焦于液体样品表面，从而将精确的纳升级液滴喷射到相邻的检测板中9。在制药行业中，声学喷射技术已广泛用于大规模合成化合物库的制备与筛选，并且该技术在小分子应用方面已得到充分验证10。据我们所知，我们是首个描述采....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 肽的系列稀释
- 配制检测缓冲液：在Hanks平衡盐溶液（HBSS）中加入25 mM HEPES、0.1% BSA和0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX），调节pH至7.4。
- 使用大量试剂分液器，向五块384孔低容量检测板的每孔中系统加入5 µl检测缓冲液。
- 根据制造商说明，使用内部软件创建加样程序，向384孔板的每个孔中加入5 µl体积的液体。
- 将分配卡式管路浸入检测缓冲液中，并用液体预冲洗管路。
- 将384孔低容量检测板放置于板架上。
- 按下开始。
- 将所有肽样品（无论储存介质如何）用检测缓冲液稀释，配制成100倍浓度的肽储备液。
注意：根据具体情况，用于筛选的肽段可提供于磷酸盐缓冲液（PBS）或二甲基亚砜（DMSO）中 （例如， DMSO 会对具有二级修饰（如聚乙二醇化）的肽产生不利影响。 - 将25 µl 100倍浓度的肽段储备液加入声学兼容的384孔聚丙烯微孔板的第1至第5列中。该微孔板指定为“源板A”。确保源板（而非目标板）为平底，并符合声学仪器制造商规定的特定声学公差要求。
- 向A板的A23和A24孔中各加入25 µl 100倍参考对照品。
- 向A源板的第11-15列加入10 µl检测缓冲液，向第21-22列加入30 µl检测缓冲液。 ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
我们常规采用两步法通过声波转移技术稀释多肽。第一步，将声波分配器与自动化系统对齐，用于在两个源板上制备四种多肽储备液的中间稀释液（图1a、b）。第二步，使用声波分配器进一步将源板A和B中的储备稀释液稀释，为每种待测多肽生成11个浓度点的浓度梯度（图1c）。每个多肽浓度梯度在检测板上从左到右以复孔形式点样，使得每块384孔检测板可同时筛选16种不同的多肽（图1c）。通过向检测板各孔补充检测缓冲液，确保每个孔中的总体积保持恒定（图1d）。同时，将参比多肽阳性对照以最大有效浓度转移至目标板中。
使用荧光酶标仪读取微孔板数据，并展示一个包含16种肽段（每个样本设两个复孔）的示例微孔板的热图（图 2a）。所使用的cAMP累积检测是一种反向竞争性检测，因此低值（显.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案描述了采用自动化声波移液技术对肽样品进行系列稀释的成功应用，浓度范围可达3 × 106，且所需样品量少于1 µl。该方法的主要优势在于，通过减少样品与实验容器及塑料耗材（如移液枪头）的接触——这些耗材通常用于试剂转移和混合——从而最大限度地降低肽在塑料器皿上的吸附，提高数据质量。尽管声波移液技术并未完全排除塑料耗材的使用，但已显著减少了其使用量。此外，去除基于枪头的移液操作还可消除样品交叉污染，避免误差在整个系列稀释过程中累积，从而实现可靠且可重复的浓度-反应曲线制备14,15。
其他研究团队已报道，将溶解在DMSO中的测试化合物通过声波转移直接递送至细胞，用于长期检测（>48小时），除倒置检测板并在一定时间内孵育外，无需额外的混匀步骤16,17。DMSO具有高度极性，与必须在PBS中配制和保存的生物样品相比，更易于与水溶液混合。因此，在采用自动化方法进行肽样品的声波转移时，我们增加了回补和离心步骤，以确保充分混匀，从而实现准确的样品系列稀释。我们的经验表明，仅靠离心不足以确保水相样品的完全混合，因此开.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突披露。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 汉克斯’ 平衡盐溶液 | Sigma-Aldrich | H8264 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | Sigma-Aldrich | I7018 | 以DMSO配制为0.5 M的储存液 |
| GLP-1（7-36）酰胺 | Bachem | H-6795 | 以 PBS 配制为 1 mg/ml 的储存液，称为“100倍参考对照” |
| 测试肽段 | 在MedImmune内部生产 | 根据需要以不同浓度提供于DMSO或PBS中 | |
| 100倍肽段储备液 | 在MedImmune内部生产 | 将测试多肽用测定缓冲液稀释至最终所需浓度的100倍 | |
| 0.4% 台盼蓝溶液 | 赛默飞世尔科技 | 15250-061 | |
| Cedex XS 细胞分析仪 | Innovatis | ||
| 康宁384孔低容量板 | Sigma-Aldrich | 4514 | |
| Echo认证的384孔聚丙烯微孔板 | Labcyte Inc. | P-05525 | |
| Echo认证储液槽 | Labcyte Inc. | ER-0055 | |
| Echo 550 液体处理仪 | Labcyte Inc. | 液滴转移体积以2.5 nl为增量 | |
| Echo 525 液体处理仪 | Labcyte Inc. | 液滴转移体积，以25 nl为增量 | |
| ACell 台式自动化系统 | HighRes Biosolutions | MC522 | |
| 生命科学机器人用 Cellario 实验室自动化排程软件 | HighRes Biosolutions | ||
| Multidrop Combi 试剂分配器 | 赛默飞世尔科技 | 5840300 | 被称为“大量试剂分配器” |
| HTRF cAMP 动态 2 试剂盒 | Cisbio Bioassays | 62AM4PEJ | |
| EnVision 多功能酶标仪 | PerkinElmer |
参考文献
- Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow. J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).
- Campbell, J. E., Drucker, D. J. Pharmacology, phys....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
