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使用磁性蛋白A和蛋白G微珠对抗体进行荧光染料标记

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DOI：

10.3791/54545

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2016年9月15日

 ,  , 
1Promega Corporation

本文内容

摘要

使用磁珠法对抗体进行小分子标记，可直接从细胞培养基中对少量抗体进行标记。该方法适用于胺基和巯基化学标记，可手动或借助自动化平台并行处理多个样本。

摘要

使用小分子（如荧光染料、细胞毒性药物和放射性示踪剂）标记的抗体是生物医学研究、免疫诊断以及近年来作为治疗剂的重要工具。传统的小分子标记抗体方法需要高浓度的纯化抗体，涉及多个透析步骤，且通量有限。然而，包括抗体药物偶联物（ADC）领域在内的多种应用将受益于能够直接从细胞培养基中对抗体进行标记的新方法。此类方法可能使抗体能够在具有生物学相关性的检测中进行筛选，例如在ADC研究中进行受体介导的抗体内化检测。本文介绍一种“磁珠上标记法”（on-bead method），可实现直接从细胞培养基中对微量抗体进行标记。该方法利用高载量的磁性蛋白A和蛋白G亲和磁珠从细胞培养基中捕获抗体，随后通过胺基或巯基化学反应对磁珠上的抗体进行小分子标记，最后洗脱获得标记后的抗体。以荧光染料作为小分子的替代物，我们展示了利用胺基和巯基两种标记化学方法，直接从细胞培养基中对三种不同的小鼠抗体进行磁珠上标记。由于抗体与蛋白A和蛋白G具有高亲和力，可确保标记抗体的高回收率和高纯度。此外，磁珠的使用使得可手动同时处理多个样品，从而显著提高标记通量。

引言

用小分子标记的抗体可能是生物学中最常用的试剂之一1,2。用荧光染料和生物素标记的抗体被广泛应用于成像、免疫测定、流式细胞术、蛋白质印迹（western blot）和免疫沉淀等多种实验技术中3-6。放射性同位素标记的抗体3,7在成像和治疗中也有广泛应用，而与细胞毒性药物偶联的抗体（ADCs）为癌症治疗提供了新的选择，已有两种ADC药物获批用于临床治疗8。尽管这些标记抗体被广泛使用，其标记方法却出乎意料地长期未有显著改进，通常仍涉及多个反应步骤和脱盐纯化过程9-12。溶液相标记法在仅需标记少量抗体、且抗体样品纯度高、浓度高、体积充足的情况下效果良好。然而，对于ADC等新兴应用，需要在杂交瘤早期阶段即对抗体进行标记，以便筛选具有生物学相关特性的抗体，例如受体介导的抗体内化能力13-16。在杂交瘤阶段，样品体积有限，抗体表达浓度较低，且样品数量较多，因此基于溶液的标记方法并不适用。

为了简化并提高传统抗体标记方法的通量，已提出几种替代方案17,18。其中一种方法是使用非磁性蛋白A亲和微珠填充的小型色谱柱捕获抗体，随后进行标记反应，并洗脱出已标记且纯化的蛋白。该方法可直接从细胞培养上清中对标记抗体，但使用色谱柱的操作较为繁琐。最近报道了一种基于磁珠的方法19，该方法无需使用色谱柱，提高了通量；但由于磁珠的抗体结合容量有限，仅能对标记纳克至低微克量级的抗体。

我们近期开发并使用了高容量磁性 Protein A 和 Protein G 微珠（>每毫升沉降微珠可结合超过 20 mg 人 IgG），用于在细胞培养基中将小分子标记到抗体上20。该微珠的高载量可方便地实现数十至数百微克抗体的标记，其快速的磁响应特性也简化了大量样本的并行操作与处理。通过使用荧光染料作为小分子的替代物，我们证明该方法适用于胺基和巯基标记化学反应，且能够实现标记抗体的高回收率以及极高的纯度。

本方案及配套视频介绍了使用磁性蛋白A和蛋白G微珠对细胞培养基中存在小鼠抗体进行微珠上标记的方法。该方案分为四个部分：第一部分描述了从生物样品中利用微珠捕获抗体的过程；捕获后，第二部分和第三部分分别介绍了通过胺基化学法或巯基化学法将荧光染料标记到抗体上的步骤；最后，第四部分阐述了抗体浓度以及染料-抗体比率的计算方法。

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方案

1. 抗体捕获至高容量磁性蛋白A或磁性蛋白G微珠

  1. 通过轻轻摇动均匀重悬磁珠。分装磁珠时保持悬浮液均匀。
  2. 向一个1.5 ml微量离心管中加入50 µl磁珠悬液。将管子置于磁力架上10秒，小心移除保存缓冲液。
  3. 加入250 µl抗体结合缓冲液。
  4. 混匀后置于磁力架上10秒，小心移除结合缓冲液。
  5. 向磁珠中加入含50–100 µg抗体的1.0 ml样品。样品可以是纯化的抗体，也可以是含抗体的细胞培养上清。
  6. 在室温下使用涡旋振荡器或翻转混合器孵育60分钟，充分混匀样品。
  7. 将管子置于磁力架上10秒，移除上清液。
  8. 加入250 µl抗体结合/洗涤缓冲液并混匀。置于磁力架上10秒后，移除结合/洗涤缓冲液。重复此步骤，共洗涤两次。
  9. 进入第2节，使用胺基化学法标记抗体，或进入第3节，使用巯基化学法标记抗体。

2. 使用胺基化学法进行抗体标记

  1. 抗体偶联
    1. 向磁珠中加入 100 µl 胺偶联缓冲液。
    2. 在 1.0 mg 胺反应性荧光染料（AlexaFluor 532-SE）中加入 100 µl 二甲基亚砜（DMSO），配制成浓度为 10 mg/ml 的溶液。通过涡旋混合。该溶液需现用现配。
    3. 每 100 µg 抗体加入 2.5 µl 胺反应性染料。
      注意：通常建议使用 5–20 倍摩尔过量的反应性染料。然而，实际加入反应体系的染料用量需根据目标染料-抗体比值及抗体本身的固有特性进行经验性优化。
    4. 在室温下使用涡旋振荡器或翻转混合器孵育 60 分钟。确保磁珠始终处于悬浮状态。
    5. 将离心管置于磁力架上 10 秒，吸除上清液。
    6. 加入 250 µl 抗体结合/洗涤缓冲液并混匀。置于磁力架上 10 秒，吸除并弃去结合/洗涤缓冲液。重复此步骤，共洗涤两次。
  2. 抗体回收
    1. 向磁珠中加入 50 µl 洗脱缓冲液。
    2. 在室温下使用涡旋振荡器或翻转混合器孵育 5 分钟。确保磁珠始终处于悬浮状态。
    3. 将离心管置于磁力架上 10 秒，吸出洗脱液并转移至含有 5 µl 中和缓冲液的新微量离心管中。
    4. 重复上述过程一次，并将两次洗脱的样品合并。
    5. 按照第 4 节所述方法测定抗体浓度及染料-抗体比值。

3. 使用巯基化学法进行抗体标记

  1. 抗体还原
    1. 加入 250 µl 巯基偶联缓冲液并混匀。将离心管置于磁力架上 10 秒，吸除并弃去缓冲液。重复此步骤两次。
    2. 加入 100 µl 巯基偶联缓冲液。
    3. 加入二硫苏糖醇（DTT），使其终浓度为 2.5 mM。
    4. 使用涡旋振荡器或翻转混合器在室温下混匀样品 60 分钟。确保磁珠保持悬浮状态。
    5. 将离心管置于磁力架上 10 秒，弃去上清液。
    6. 加入 250 µl 巯基偶联缓冲液并混匀。将离心管置于磁力架上 10 秒，吸除并弃去缓冲液。重复此步骤，共洗涤两次。
    7. 加入 100 µl 巯基偶联缓冲液。
  2. 抗体偶联
    1. 向 1.0 mg 染料中加入 100 µl DMSO，配制成浓度为 10 mg/ml 的巯基反应性染料溶液。通过涡旋混匀。该溶液需现用现配。
    2. 每 100 µg 抗体加入 2.5 µl 巯基反应性染料。
      注意：通常建议使用 5–20 倍摩尔过量的反应性染料。然而，实际加入反应体系的染料用量需根据目标染料-抗体比值及抗体本身的固有特性进行经验性优化。
    3. 使用涡旋振荡器或翻转混合器在室温下混匀样品 60 分钟。确保磁珠保持悬浮状态。
    4. 将离心管置于磁力架上 10 秒，移除上清液。
    5. 加入 250 µl 巯基偶联缓冲液并混匀。置于磁力架上 10 秒，吸除缓冲液。重复此步骤，共洗涤两次。
  3. 抗体洗脱
    1. 向磁珠中加入 50 µl 洗脱缓冲液。
    2. 使用涡旋振荡器或翻转混合器在室温下混匀 5 分钟。确保磁珠保持悬浮状态。
    3. 将离心管置于磁力架上 10 秒，收集洗脱液并转移至含有 5 µl 中和缓冲液的新微量离心管中。
    4. 重复上述过程一次，合并两次洗脱的样品。
    5. 按照第 4 节所述方法测定抗体浓度及染料-抗体比值。

4. 计算染料-抗体比率

  1. 测定抗体-染料偶联物在 280 nm（A280）以及染料最大吸收波长（λmax）处的吸光度（Amax）。
  2. 计算抗体浓度：
    抗体浓度（mg/ml）= [A280 - (Amax × CF)] / 1.4
    其中，CF = 染料的校正因子（由生产商提供）。
  3. 计算染料-抗体比率：
    染料-抗体比率（DAR）= (Amax × 150,000) / [抗体浓度（mg/ml）× εdye]
    其中，εdye = 染料在其最大吸收波长处的摩尔消光系数，抗体的分子量为 150,000 Da。

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结果

使用高容量磁性 Protein A 和 Protein G 磁珠标记抗体与小分子的示意图见图1。捕获在磁性 Protein G 磁珠上的抗体可通过胺化学法或巯基化学法与小分子（例如荧光染料）进行标记：胺化学法标记赖氨酸氨基酸的伯胺基团，而巯基化学法则标记抗体铰链区还原后的巯基。抗体与 Protein G 之间的亲和力强21，在标记反应过程中抗体损失极少。这一点在三种不同小鼠抗体亚型经荧光染料标记后的高效回收率（50–90%）中得以体现（与简单纯化方法相比，见表1）。高效的回收率（与此前报道结果相似19）也在考马斯亮蓝凝胶图谱中得到证实（图2），其中纯化抗体与标记抗体的重链和轻链条带强度与表1中报告的结果一致。磁性 Protein G 磁珠具有较低的非特异性结合特性，因此可获得高度纯化的抗体，如考马斯亮蓝凝胶（图2）所示，且重链与轻链均实现了荧光标记（

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讨论

本研究的目的是开发一种方法，用于对细胞培养基中低浓度存在的抗体进行多种小分子标记。该方法可在抗体发现的早期阶段，对大量抗体进行小分子标记，并利用具有生物学相关性的检测方法进行筛选。其中一种检测方法是受体介导的抗体内化检测，即使抗体具有相似的结合亲和力，其内化能力也可能存在差异。因此，除了传统的基于酶联免疫吸附试验（ELISA）的筛选外，针对抗体的内化特性进行特异性筛选尤为重要。在抗体早期研发阶段，对抗体进行标记的方法需满足以下关键要求：a）能够直接从细胞培养基中对抗体进行标记；b）能够对标记浓度较低的抗体进行标记，例如当细胞培养基中抗体浓度为50 µg/ml时；c）标记后抗体的纯度和浓度应适用于后续应用；d）该方法应兼容基于胺基和巯基的偶联化学反应；e）该方法应支持多个样本的同步处理。

基于这些要求，我们开发了一种基于高载量磁性 Protein A 和 Protein G 微球的微球上抗体标记与纯化方法。这些微球采用具有低非特异性结合特性的亲水性纤维素制成，可获得高纯度的抗体，如图2所示。微球的高载量意味着仅需少量微球即可高效地从培养基中捕获抗体，...

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披露

作者为普洛麦格公司（Promega Corporation）的雇员。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
磁性蛋白A微珠Promega Corporation G8781
磁性蛋白G微珠Promega Corporation  G7471
AlexaFluor 532-SE（琥珀酰亚胺酯）Life TechnologiesA20001
AlexaFluor 532-ME（马来酰亚胺）Life TechnologiesA10255
AlexaFluor 647-ME（马来酰亚胺）Life TechnologiesA20347
荧光素-ME（马来酰亚胺）Life TechnologiesF-150
磁力架PromegaZ5332

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