本方案描述了如何用单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，L. monocytogenes）EGD 菌株感染 C57BL/6J 小鼠，以及在感染后通过自然杀伤（NK）细胞、自然杀伤 T（NKT）细胞和适应性 T 淋巴细胞检测干扰素-γ（IFN-γ）应答的方法。本方案还描述了在使用病原体的改良半数致死剂量（LD50）感染小鼠后，如何开展生存率研究。
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方法文章
Listeria monocytogenes 实验感染作为研究宿主干扰素-γ反应的模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
L. monocytogenes 是一种革兰氏阳性细菌，可导致人类食源性疾病。通过该病原体对小鼠进行实验性感染，已深入揭示了先天性和适应性免疫细胞及特定细胞因子在宿主抵御胞内病原体免疫反应中的作用。在亚致死感染过程中，先天性免疫细胞产生干扰素-γ（IFN-γ） 单核细胞增生李斯特菌 对激活巨噬细胞和病原体的早期控制具有重要意义1-3此外，适应性记忆淋巴细胞产生的IFN-γ在再次感染时启动天然免疫细胞的活化过程中具有重要作用4。该 L. monocytogenes 感染模型因此成为研究旨在增强IFN-γ产生的新疗法是否对IFN-γ应答产生影响的重要工具 体内 并产生有益的生物学效应，例如增强细菌清除能力或提高感染小鼠的存活率。本文所述为一种基本操作流程，用于对C57BL/6J小鼠进行EGD菌株腹腔感染。 L. monocytogenes 并通过流式细胞术检测自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞及适应性淋巴细胞产生干扰素-γ的能力。此外，本文还描述了以下实验步骤：（1）培养并制备用于接种的细菌，（2）测定脾脏和肝脏中的细菌载量，（3）监测动物至实验终点的存活情况。同时提供了代表性数据，以说明该感染模型可用于评估特定干预因素对干扰素-γ应答的影响 L. monocytogenes 以及小鼠在此感染中的存活情况。
引言
干扰素-γ（IFN-γ）是一种细胞因子，在介导针对胞内病原体的免疫反应以及控制肿瘤生长中起关键作用5。该细胞因子在抗细菌免疫中的重要性体现在：携带IFN-γ信号通路突变的人类个体对分枝杆菌和沙门氏菌感染高度易感6。类似地，缺乏IFN-γ或IFN-γ受体的小鼠在抵抗分枝杆菌7-9及其他胞内病原体（包括单核细胞增生性李斯特菌（L. monocytogenes）10,11、主要利什曼原虫（Leishmania major）12、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）13以及某些病毒11）方面均表现出防御缺陷。除了抗病原体作用外，IFN-γ在宿主抗肿瘤防御中也发挥着关键作用14。尽管在感染或癌症背景下高水平的IFN-γ产生是有益的，但该细胞因子的持续产生已被证实与系统性自身免疫性疾病的发生15-17以及非肥胖型糖尿病小鼠模型中1型糖尿病的加速进展相关18。
产生干扰素-γ的主要细胞包括NK细胞、NKT细胞、γδ T细胞、辅助性T细胞1（Th1）细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。5,19,20. IFN-γ 通过以下方式增强固有免疫和适应性免疫：（1）上调主要组织相容性....
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方案
安全声明
本方案描述了使用活的L. monocytogenes感染小鼠的操作。该病原体由未免疫缺陷的受过培训的人员在BSL2条件下安全操作。免疫缺陷人群包括孕妇、老年人以及HIV感染者或患有需接受免疫抑制治疗的慢性疾病者。操作感染样本时，工作人员应穿戴防护实验服或隔离衣、手套、口罩和眼部防护装备。本文所述工作均在多伦多大学健康网络（UHN）生物安全办公室颁发的证书（#32876）授权下，于BSL2条件下进行。感染小鼠的尸体或任何未使用的组织均需双层密封包装，并作为生物危害废物处理。感染小鼠所用笼具亦须通过高压灭菌进行去污。
伦理声明
小鼠在UHN动物设施的隔离室内进行饲养和感染，并依照加拿大动物护理委员会制定的指南进行护理。所有对小鼠进行的操作均在UHN动物护理委员会批准的动物使用协议 #3214 指导下进行。出于伦理考虑，在生存研究中未将死亡作为实验终点。本文报道的L. monocytogenes感染的改良半数致死剂量（LD50）定义为导致50%小鼠达到特定实验终点的剂量，这些终点包括体重下降20%或出现以下至少两种临床症状：嗜睡、毛发竖立、蜷缩姿势、呼吸困难、眼神呆滞或眼窝凹陷。当小鼠达到实验终点时，根据UHN设施指南，通过暴露于二氧化碳（CO2）实施安乐死。
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结果
图3 展示感染后24小时脾脏NK细胞和NKT细胞中IFN-γ的典型流式细胞术染色结果，感染剂量为105 病原体的菌落形成单位（CFU）。该图还展示了前述染色 panel 的设门策略 表 2. 图4 展示了一项实验中获得的代表性数据，其中雄性小鼠经 PPARα 拮抗剂 IS001 或溶剂对照处理，并感染了 105 CFU L. monocytogenes 然后在感染病原体24小时后分析NK细胞和NKT细胞中的IFN-γ。该图显示，经IS001处理后，NKT细胞的IFN-γ反应增强，而NK细胞则无此反应。 图5 显示脾脏 CD4 细胞中 IFN-γ 的代表性染色结果+ 和 CD8+ 感染后7天经再刺激的T细胞 离体 使用热灭活病原体。该图还展示了前述染色方案的设门策略 表3.
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讨论
在此，我们描述了一种使用EGD菌株进行基础实验性感染的实验方案 单核细胞增生李斯特菌25 在雄性或雌性 C57BL/6J 小鼠中。本方案旨在研究新型小分子 IS001 对天然免疫和适应性淋巴细胞产生 IFN-γ 的影响 在体31通过监测感染后的细菌清除情况和宿主存活率，研究人员深入了解了IFN-γ的这些变化如何影响宿主控制感染的能力。
实验方案中的关键注意事项
在设计此类研究时，一个重要考虑因素是每个实验都应具备足够的检验效能，并设置适当的对照。由于机体对感染的免疫反应存在生物学变异（见图4和图6），建议在初步免疫学研究中每组使用 N = 4 - 5 只小鼠。如果在这些研究后数据呈现出趋势，但组间差异尚不显著，可进行功效分析，以确定后续研究中达到统计学显著性所需的最少动物数量。关于对照设置，应包括未感染对照，以确定免疫学研究中IFN-γ反应的基础水平；同时应设置载体对照，以帮助区分治疗本身的作用与给药操作所引起的应激效.......
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披露
无利益冲突需要披露。
致谢
本方案的开发得到了加拿大卫生研究院（CIHR，项目号MOP97807）向SED提供的运营资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 改良脑心浸液肉汤 | BD | 299070 | 任何品牌均可适用 |
| 琼脂 | BD | 214010 | 任何品牌均可适用 |
| 曲拉通 X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | 任何品牌均可适用 |
| 1x PBS | Sigma | D8537 | 任何品牌均可适用 |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | 任何品牌均可适用 |
| 氯化铵 (NH3Cl) | 任何品牌均可适用 | ||
| KHCO3 | 任何品牌均可适用 | ||
| Na2EDTA | 任何品牌均可适用 | ||
| RPMI 1640 | Gibco | 22400089 | 任何品牌均可适用 |
| 胎牛血清 | Gibco | 12483 | 使用前于 56 °C 水浴 30 分钟以灭活 |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030 | 任何品牌均可适用 |
| 非必需氨基酸 | Gibco | 11140 | 任何品牌均可适用 |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140 | 任何品牌均可适用 |
| 高尔基体阻断蛋白转运抑制剂（含莫能菌素） | BD | 554724 | 在 6 ml 细胞培养液中加入 4 μl |
| 16% 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 用 ddH2O 或 1x PBS 稀释至 4% |
| 10x 穿透/洗涤缓冲液 | BD | 554723 | 用 ddH2O 稀释至 1x |
| Fc 封闭剂，抗小鼠 CD16/CD32 纯化抗体 | eBioscience | 14-0161 | 按 1:50 稀释 |
| 可固定活力染料 eFluor 506 | eBioscience | 65-0866 | 按 1:1,000 稀释（我们也曾使用 Molecular Probes 公司的活力染料） |
| 抗小鼠 CD4-PE-Cy5（GK1.5） | eBioscience | 15-0041 | 厂家推荐特定检测用量；但使用前应进行滴定。 |
| 抗小鼠 CD8-FITC（53-6.7） | eBioscience | 11-0081 | 厂家推荐特定检测用量；但使用前应进行滴定。 |
| PBS57/mCD1d 四聚体-APC | NIH 四聚体核心设施 | N/A | 由该设施馈赠获得 |
| 抗小鼠 TCRβ-PE-Cy7（H56-597） | eBioscience | 25-5961 | 厂家推荐特定检测用量；但使用前应进行滴定。 |
| 抗小鼠 NKp46-APC-eFluor780（29A1.4） | eBioscience | 47-3351 | 厂家推荐特定检测用量；但使用前应进行滴定。 |
| 抗小鼠 CD45 PE-Cyanine7（30-F11） | eBioscience | 25-0451 | 厂家推荐特定检测用量；但使用前应进行滴定。 |
| 抗小鼠 IFN γ-PE（XMG1.2） | eBioscience | 12-7311 | 厂家推荐特定检测用量；但使用前应进行滴定。 |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 | 每次染色使用一滴 |
| 小鼠 IFN γ ELISA 试剂盒 | eBioscience | 88-7314 | 用于检测培养上清液中的干扰素 γ |
| 50 ml 通气培养管 | 用于细菌培养，任何品牌均可适用 | ||
| 1.5 ml 微量离心管 | 任何品牌均可适用 | ||
| 细菌培养皿 | 任何品牌均可适用 | ||
| 2 ml 冻存管 | 任何品牌均可适用 | ||
| 紫外分光光度计 | 任何品牌均可适用 | ||
| 安全型针头 | 任何品牌均可适用 | ||
| C57BL/6J | Jackson 实验室 | Stock#000664 | 订购时要求 7 周龄到达 |
| 漂白剂 | 用于去污染 | ||
| 70% 乙醇 | 用于去污染 | ||
| 玻璃珠 | 任何品牌均可适用 | ||
| 离心机 | 需配备转子、吊篮及吊篮盖。 | ||
| 微量离心机 | 任何品牌均可适用 | ||
| 无菌甘油 | 任何品牌均可适用 | ||
| 移液器吸头 | 任何品牌均可适用 | ||
| 移液器 | 任何品牌均可适用 | ||
| 手术器械 | 任何品牌均可适用 | ||
| 70 微米细胞筛 | 任何品牌均可适用 | ||
| 3 ml 注射器 | 任何品牌均可适用 | ||
| 移液枪 | 任何品牌均可适用 | ||
| 过滤装置 | 任何品牌均可适用 | ||
| 台盼蓝 | 用 ddH2O 按 1:9 稀释，任何品牌均可适用 | ||
| 血细胞计数板 | 任何品牌均可适用 | ||
| 圆底培养板 | 任何品牌均可适用 | ||
| FACs 管 | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| BD LSR II | BD | 任何具备合适激光配置和滤光片组以区分所用荧光染料的流式细胞仪均可用于数据采集 | |
| FlowJo 软件 | Treestar | 用于数据分析。其他类型的数据分析软件也可适用 | |
| 多通道移液器（0 - 300 µl） | Eppendorf | 用于流式细胞术染色过程中的细胞洗涤及抗体添加 | |
| 乙酸 | 用于清洗玻璃珠，任何品牌均可适用 | ||
| Microbank 细菌保存系统 | Pro-lab Diagnostics | 作为甘油保种的替代方法，用于细菌的长期保存 |
参考文献
- Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
- Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol.
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重印与许可
