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方法文章

Listeria monocytogenes 实验感染作为研究宿主干扰素-γ反应的模型

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DOI：

10.3791/54554

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2016年11月16日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Toronto General Research Institute, University Health Network, 3Women's College Research Institute

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了如何用单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，L. monocytogenes）EGD 菌株感染 C57BL/6J 小鼠，以及在感染后通过自然杀伤（NK）细胞、自然杀伤 T（NKT）细胞和适应性 T 淋巴细胞检测干扰素-γ（IFN-γ）应答的方法。本方案还描述了在使用病原体的改良半数致死剂量（LD50）感染小鼠后，如何开展生存率研究。

摘要

L. monocytogenes 是一种革兰氏阳性细菌，可导致人类食源性疾病。通过该病原体对小鼠进行实验性感染，已深入揭示了先天性和适应性免疫细胞及特定细胞因子在宿主抵御胞内病原体免疫反应中的作用。在亚致死感染过程中，先天性免疫细胞产生干扰素-γ（IFN-γ） 单核细胞增生李斯特菌 对激活巨噬细胞和病原体的早期控制具有重要意义1-3此外，适应性记忆淋巴细胞产生的IFN-γ在再次感染时启动天然免疫细胞的活化过程中具有重要作用4。该 L. monocytogenes 感染模型因此成为研究旨在增强IFN-γ产生的新疗法是否对IFN-γ应答产生影响的重要工具 体内 并产生有益的生物学效应，例如增强细菌清除能力或提高感染小鼠的存活率。本文所述为一种基本操作流程，用于对C57BL/6J小鼠进行EGD菌株腹腔感染。 L. monocytogenes 并通过流式细胞术检测自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞及适应性淋巴细胞产生干扰素-γ的能力。此外，本文还描述了以下实验步骤：（1）培养并制备用于接种的细菌，（2）测定脾脏和肝脏中的细菌载量，（3）监测动物至实验终点的存活情况。同时提供了代表性数据，以说明该感染模型可用于评估特定干预因素对干扰素-γ应答的影响 L. monocytogenes 以及小鼠在此感染中的存活情况。

引言

干扰素-γ（IFN-γ）是一种细胞因子，在介导针对胞内病原体的免疫反应以及控制肿瘤生长中起关键作用5。该细胞因子在抗细菌免疫中的重要性体现在：携带IFN-γ信号通路突变的人类个体对分枝杆菌和沙门氏菌感染高度易感6。类似地，缺乏IFN-γ或IFN-γ受体的小鼠在抵抗分枝杆菌7-9及其他胞内病原体（包括单核细胞增生性李斯特菌（L. monocytogenes）10,11、主要利什曼原虫（Leishmania major）12、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）13以及某些病毒11）方面均表现出防御缺陷。除了抗病原体作用外，IFN-γ在宿主抗肿瘤防御中也发挥着关键作用14。尽管在感染或癌症背景下高水平的IFN-γ产生是有益的，但该细胞因子的持续产生已被证实与系统性自身免疫性疾病的发生15-17以及非肥胖型糖尿病小鼠模型中1型糖尿病的加速进展相关18。

产生干扰素-γ的主要细胞包括NK细胞、NKT细胞、γδ T细胞、辅助性T细胞1（Th1）细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。5,19,20. IFN-γ 通过以下方式增强固有免疫和适应性免疫：（1）上调主要组织相容性复合体（MHC）I 类和 II 类分子的表达，（2）增加抗原呈递细胞上共刺激分子的表达，（3）增强巨噬细胞的吞噬作用以及促炎性细胞因子和杀菌因子的产生例如，一氧化氮和活性氧），（4）促进初始CD4+ 将T细胞分化为Th1效应细胞，（5）促进抗体类别转换为免疫球蛋白（Ig）2a和IgG3（小鼠），（6）诱导趋化因子产生以募集免疫细胞至感染部位，以及（7）增强自然杀伤（NK）细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答5,19鉴于IFN-γ在宿主对抗病原体和肿瘤反应中的关键作用，重组IFN-γ已被用于治疗多种感染和恶性肿瘤（详见综述于19然而，由于全身性给予干扰素-γ（IFN-γ）或促进Th1型免疫反应的细胞因子白细胞介素-12（IL-12）会伴随副作用及剂量相关的毒性19,21，人们正致力于开发替代策略以增强免疫细胞产生干扰素-γ。新型生物制剂和小分子的开发需要 体内 用于检测这些制剂是否在免疫反应过程中增加干扰素-γ（IFN-γ）的产生，以及这种增加是否转化为有意义的生物学效应，例如提高动物存活率的筛选工具。

利用革兰氏阳性菌L. monocytogenes对小鼠进行实验性感染，已成为解析IFN-γ在宿主免疫应答中对抗胞内病原体作用的关键模型1,22。通过静脉或腹腔（i.p.）途径感染小鼠后，病原菌迅速扩散至脾脏和肝脏，并被组织驻留的巨噬细胞和肝细胞吞噬，脾脏中的细菌载量通常在感染后3至4天达到峰值1,3,22。自然杀伤细胞（NK细胞）产生的IFN-γ对于激活巨噬细胞以及早期抵抗病原体具有重要作用3；然而，在高感染剂量下，IFN-γ的产生也可能不利于病原体的清除23。在病原体早期控制阶段，NKT细胞也是脾脏和肝脏中IFN-γ的重要来源2,24，并且已有研究表明，其IFN-γ的产生可增强其他细胞类型（包括NK细胞）的IFN-γ分泌2。另一方面，后期发挥作用的适应性T淋巴细胞，尤其是CD8+ T细胞，在介导病原体清除以及提供再感染保护方面具有关键作用1,4,22。

该感染模型因其多种优势而受到研究人员的广泛关注（详见文献1综述）。首先，病原体感染具有高度可重复性，并能诱导强烈的Th1型和细胞免疫反应。其次，在亚致死性感染过程中，细菌载量主要集中于肝脏和脾脏，便于检测。第三，该病原体可在生物安全二级（BSL2）条件下安全操作。第四，该生物体及其引发的免疫反应已被广泛表征。最后，目前已开发出多种突变株和基因修饰菌株，可供研究使用。

本文描述了一种对C57BL/6J小鼠接种EGD株的常规实验方案 L. monocytogenes25 以及用于测量干扰素（IFN）-γ反应。还描述了如何在亚致死感染后测定脾脏和肝脏中的细菌载量，以及如何在使用改良LD感染后进行生存研究50 病原体剂量。最后，展示了如何利用本方案筛选新治疗方法对IFN-γ反应及小鼠存活率影响的代表性数据。 L. monocytogenes 感染

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方案

安全声明

本方案描述了使用活的L. monocytogenes感染小鼠的操作。该病原体由未免疫缺陷的受过培训的人员在BSL2条件下安全操作。免疫缺陷人群包括孕妇、老年人以及HIV感染者或患有需接受免疫抑制治疗的慢性疾病者。操作感染样本时，工作人员应穿戴防护实验服或隔离衣、手套、口罩和眼部防护装备。本文所述工作均在多伦多大学健康网络（UHN）生物安全办公室颁发的证书（#32876）授权下，于BSL2条件下进行。感染小鼠的尸体或任何未使用的组织均需双层密封包装，并作为生物危害废物处理。感染小鼠所用笼具亦须通过高压灭菌进行去污。

伦理声明

小鼠在UHN动物设施的隔离室内进行饲养和感染，并依照加拿大动物护理委员会制定的指南进行护理。所有对小鼠进行的操作均在UHN动物护理委员会批准的动物使用协议 #3214 指导下进行。出于伦理考虑，在生存研究中未将死亡作为实验终点。本文报道的L. monocytogenes感染的改良半数致死剂量（LD50）定义为导致50%小鼠达到特定实验终点的剂量，这些终点包括体重下降20%或出现以下至少两种临床症状：嗜睡、毛发竖立、蜷缩姿势、呼吸困难、眼神呆滞或眼窝凹陷。当小鼠达到实验终点时，根据UHN设施指南，通过暴露于二氧化碳（CO2）实施安乐死。

1. 长期保存用甘油菌种的制备

注意：本实验方案描述了如何从原始的甘油菌种制备L. monocytogenes EGD菌株的甘油保存菌种。可能产生气溶胶的步骤应在经认证的生物安全柜（BSC）内进行。

  1. 制备脑心浸液（BHI）琼脂平板用于细菌培养。为此，将3.8%（w/v）BHI肉汤和1.5%（w/v）琼脂加入双蒸水中2O (ddH₂O)2O）。液体灭菌。待琼脂冷却至 50 °C °C，将液体分装至细菌培养皿中（每皿25 ml），并在生物安全柜中敞口干燥1小时。
    注意： 将BHI琼脂转移至50 °C水浴中，以防止倒平板前过早凝固。将BHI平板储存在4℃。 °C 倒置（培养基面朝上）直至使用。
  2. 准备液体BHI培养基。为此，将3.8%（w/v）BHI肉汤溶于ddH₂O中。2O. 高压灭菌器。
  3. 移除保存的甘油冻存菌种 单核细胞增生李斯特菌 -80 保存的 EGD 菌株 °C 冻存并解冻至室温。
  4. 将无菌移液器吸头浸入解冻的甘油菌种中，然后立即在BHI平板的一个区域来回划线。此为初次划线。
  5. 将培养皿旋转90度 °C，并使用新的移液器吸头，穿过第一区划线并将其涂抹至下一区域 ¼ 平板的该区域（此为二次划线）。再重复一次，进行三次划线。
  6. 将培养皿倒置，在37℃下培养 °4°C 过夜培养。在最后一次划线区域应获得单个均匀的菌落，菌落可见时间为 16 至 24 小时。
  7. 将10 ml无菌BHI肉汤加入无菌带通气盖的50 ml管中。挑取一个单菌落 单核细胞增生李斯特菌 使用无菌移液器吸头从平板上挑取菌落，接种至液体培养基中。将培养物置于37℃培养 °C 摇床培养过夜或直至 OD600 = 1.0，设置为每分钟225转（rpm）。
    注意： 玻璃或一次性塑料锥形瓶也可用于细菌培养。无论使用何种容器，均需确保其无菌、通气，且培养液体积不超过容器总容积的20%，以保证细菌获得充分的通气。
  8. 通过将无菌的100%甘油与过夜培养的细菌液体培养物按1:1比例混合，制备甘油菌种保存液。将细菌/甘油混合液分装至2 ml冻存管中（每管500 μl），于–80 °C保存。 μl/瓶）并将小瓶转移至 -80 °C 冰箱保存。
    注意： 珠子储存法也可用于替代甘油保存法来储存细菌。该方法是将多孔微珠接种于纯培养的细菌中 单核细胞增生李斯特菌 并储存在 -80 °C. 根据需要，每个珠子均可用于接种新鲜培养物。详见材料列表。

2. 单日培养中单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）生长曲线的测定

注意：本实验方案描述了如何生成用于估算感染研究中菌落形成单位（CFU）的 L. monocytogenes 生长曲线。所有可能产生气溶胶的操作步骤均须在经认证的生物安全柜（BSC）内进行。

  1. 取100 µ将步骤1.7中制备的过夜培养物1 ml加入通气的50 ml管中的10 ml BHI培养基中，在37℃下培养 °在摇床培养箱中（225 rpm，倾斜45°）° 角度）。使用未接种的试管作为对照。
  2. 每小时间隔（1、2、3、4、5、6 小时）取 0.5 ml 培养液样本， 等等）。在塑料比色皿中，用BHI培养基将每份样品按1:1（v/v）稀释，用移液器吹打混匀。测定600 nm处的光密度（OD600）使用分光光度计。继续培养细菌直至OD600=1.
  3. 同时，取一个100 μl 样品并用 900 微升 μl BHI 培养基加入无菌的 1.5 ml 微量离心管中（此为 10-1 稀释）。在6,000 × g离心5分钟，吸除上清液。
  4. 将菌体沉淀重悬于1 ml BHI培养基中，洗涤两次：每次重悬后于6,000 × g离心5分钟，吸弃上清。将最终沉淀重悬于1 ml BHI培养基中。用BHI培养基对该样品进行10倍系列稀释（10-2 至 10-9。涂布100 μ每种稀释液各取 l，分别涂布于 BHI 琼脂平板。37℃过夜培养。 °在培养箱中。
  5. 第二天，挑选菌落数量在30至300之间的平板，其余丢弃。计数这些平板上的菌落。 表1 显示了在 OD 测定时取样 aliquot 所获得计数的一个示例600 = 0.84。在此示例中，其中一个培养皿（即， 10-6 稀释度）的菌落数在30 - 300之间，用于CFU/ml的计算。
    注意： 菌落数超过300的平板不予使用，因为菌落过度密集会抑制细菌生长，并难以区分和计数单个菌落。菌落数量在 < 30 也不使用，因为稀释技术中的微小误差或污染物的存在会对低浓度范围内的计数精度产生较大影响。
  6. 将菌落数除以涂布体积，再乘以稀释倍数，得到特定稀释度下的CFU/ml值。在以下示例中 表1，10 的计数-6 稀释倍数为70。将该值除以0.1 ml，得到稀释后培养物的CFU/ml值。然后将此值乘以稀释倍数（106) 以获得未稀释培养物的CFU/ml值（7.0 × 108).
  7. 绘制 OD 值曲线600 （y轴）与时间（小时，x轴）的关系，以确定细菌的对数生长期26.
    注意： 该生长曲线可用于估算单日培养物在达到特定OD读数时的CFU/ml。选择一个OD600 处于对数生长期、可作为目标 OD 的读数600 用于培养日培养物。这些数据现在可用于估算培养物中的CFU，以制备接种物（步骤3）。

3. 实验性感染单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）的接种物制备

注意：本步骤描述了如何从过夜培养物（按步骤2制备）接种的当日培养物中制备感染性接种液。除非另有说明，所有这些步骤均应在生物安全柜中进行。

  1. 根据小鼠数量和实验设计，计算感染所需的菌落形成单位（CFU）数量。向无菌通气锥形瓶或培养管中加入适量体积的BHI培养基。
    注意： 所制备细菌的CFU数量取决于实验类型。若研究感染期间自然杀伤（NK）细胞和自然杀伤T（NKT）细胞的反应，每只小鼠接种105 CFU细菌（见步骤6）。若研究适应性T细胞对感染的反应或测定细菌载量，每只小鼠接种2 × 104 CFU细菌（见步骤8）。若研究终点存活率，每只小鼠接种病原体的半数致死剂量（LD50），雄性为105 CFU，雌性为1.5 × 105 CFU（见步骤9）。
  2. 向含有BHI培养基的培养管中接种100 μl过夜培养物。将培养物置于37 °C振荡培养箱（225 rpm）中培养，直至达到目标OD600。将培养物转移至无菌离心管中。
  3. 使用离心机在6,000 × g条件下离心5分钟，使细菌沉淀。通过连接含漂白剂的捕集瓶的真空装置吸除上清液。
  4. 用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤沉淀物两次，每次洗涤之间以6,000 × g离心5分钟。
  5. 吸除第二次洗涤液，并用1× PBS将细菌稀释至适当浓度，使每只小鼠接种体积为200 µl，对应所需CFU数。
    注意： 建议使用市售的无菌1× PBS进行细菌洗涤和接种液制备，因为实验室玻璃器皿可能引入脂多糖等免疫污染物。

4. 小鼠实验性感染 单核细胞增生李斯特菌

注意：本步骤描述了如何使用步骤3中制备的接种物感染小鼠，以及如何验证接种物中递送的菌落形成单位（CFU）。小鼠的操作和注射均在生物安全柜（BSC）中进行。

  1. 为实验订购足够数量的雄性或雌性 C57BL/6J 小鼠，并另订购用于未感染对照组的小鼠。
  2. 在细菌接种前，让小鼠适应环境 1 周。
    注意：这是因为运输动物所引起的应激可导致应激激素短暂升高以及淋巴细胞减少27,28。
  3. 在接种当天，测量每只小鼠的基础体重，并记录在实验记录本中。
  4. 在生物安全柜中，使用无菌移液器反复吹打细菌悬液，以确保细菌均匀分布，然后用配有 25 G 针头的 1 ml 安全型注射器吸取 200 µl 接种物。
  5. 通过腹腔注射方式向小鼠注射 200 μl 制备好的接种物（例如，NK 细胞感染使用 105 CFU，见步骤 6）。操作时，用非优势手抓住小鼠肩部附近的松弛皮肤固定小鼠。确认小鼠被充分固定后，在腹部下象限、靠近腹中线外侧的位置进行注射，以避免损伤膀胱。
  6. 将针头和注射器丢弃至生物危害锐器容器中。
  7. 重复步骤 4.3 至 4.6，直至所有小鼠完成注射。对对照组小鼠以相同方式注射 1x PBS（未感染对照组）。
    注意：由于 CFU 是基于生长曲线的估算值，因此最好检测接种物中的实际 CFU。为此，将制备好的接种物进行 3–4 个不同梯度的稀释（采用 10 倍系列稀释），选择预期能产生可计数菌落的稀释度。取每种稀释液 100 μl 涂布于 BHI 琼脂平板，37 °C 过夜培养。计数菌落后，按照步骤 2 所述方法计算实际的 CFU/ml。

5. 为免疫学研究制备灭活的 L. monocytogenes

注意： 所有可能产生气溶胶的步骤均在生物安全柜内进行。

  1. 将培养物培养至 OD600 值达到对数生长期范围，然后分装至 1.5 ml 微量离心管中。
  2. 将离心管置于 70 °C 水浴中孵育 1 小时，以灭活细菌。
  3. 用 1× PBS 按第 3.3 和 3.4 步的方法洗涤细菌两次，然后重悬于含胎牛血清（FCS）的无菌完全 RPMI 培养基中（配方见补充文件 1），浓度为 4 × 106/ml。将灭活的细菌分装至 2 ml 无菌冻存管中，于 -80 °C 保存。
  4. 取 100 μl 热灭活细菌接种于 BHI 琼脂平板，37 °C 过夜培养，以确认细菌已完全死亡。
    注意：这些热灭活细菌可用于第 8 步骤中体外刺激淋巴细胞。若 BHI 琼脂平板上出现菌落生长，则需重复热灭活步骤。

6. 感染期间自然杀伤细胞和自然杀伤T细胞产生干扰素-γ反应的检测

注意：本实验方案描述了如何在用 105 CFU 的 L. monocytogenes 感染小鼠后 24 小时，检测自然杀伤（NK）细胞和自然杀伤 T（NKT）细胞产生的 IFN-γ 反应。选择该剂量的原因在于其可在脾脏中诱导出强烈的 NK 和 NKT 细胞 IFN-γ 反应24。所有操作均需在生物安全柜（BSC）中进行。为维持细胞活性，应尽可能将细胞置于冰上，并使用预冷的缓冲液。

  1. 按照第4步所述方法，用105 CFU的 单核细胞增生李斯特菌同时，向未感染的对照小鼠腹腔注射等体积的1×PBS。
  2. 在接种后24小时，通过CO对小鼠实施安乐死2 根据机构指南进行吸入操作。
  3. 将每只小鼠置于右侧卧位，使用挤压瓶以70%乙醇润湿皮肤。
  4. 使用无菌镊子和耐切割剪刀，在肋骨下缘稍下方切开皮肤。
  5. 用70%乙醇喷洒暴露的肌肉层。脾脏应可见于肌肉层下方（图中开放箭头所示） 图1).
  6. 使用无菌镊子和精细剪刀切开肌肉层以暴露脾脏。用镊子轻轻夹住脾脏，并用精细剪刀将脾脏从周围结缔组织上剪下。
  7. 将脾脏置于含有无菌1×PBS的15 ml锥形管中。
  8. 用无菌的 1× PBS 半充满无菌培养皿。通过 70 μm 细胞滤网将脾脏组织解离 μ使用无菌3 ml注射器的平端，将细胞悬液通过40 μm尼龙细胞滤网过滤至培养皿中。
  9. 使用无菌的10 ml移液管将脾细胞悬液转移至洁净无菌的15 ml圆锥形离心管中。
  10. 在 4 ℃ 条件下，以 335 × g 离心 10 分钟 °C.
  11. 将上清液吸入含有漂白剂的废液收集瓶中。通过用手指轻弹管壁，或在波纹表面上前后拖动管底，使细胞沉淀松散。例如， 生物安全柜中的气流通风口
  12. 通过向每个脾脏样本中加入1.5 ml氯化铵钾（ACK）裂解缓冲液（配方见补充文件1）裂解红细胞。精确作用1分15秒后，用1×PBS加满离心管以终止细胞裂解反应。
  13. 按照步骤6.10所述离心细胞。吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于10 ml荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液（含2% FCS的无菌1×PBS）中。
  14. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。为此，取两份细胞悬液 aliquot 进行计数。加入 15 µ每种细胞悬液取 l 与等体积的台盼蓝（0.04%，由 0.4% 台盼蓝溶液用 ddH₂O 稀释制成）混合2O). 加载15 µ将每种细胞/台盼蓝悬浮液各 1 μl 加入血细胞计数板的计数室中即，一个在上室，一个在下室。
  15. 使用显微镜，在每个计数室中央网格的五个大方格中计数所有非蓝色细胞图2）。取此数值除以 10，得到每 106/毫升。在上述示例中 图2，5个方格中的细胞数为215个；因此，细胞浓度为21.5 × 106/ml。取两个样本测得的细胞浓度的平均值。
  16. 接种 1 x 106 每孔/染色在96孔圆底板中加入细胞，用于流式细胞术染色。务必同时接种未染色对照和荧光减一（FMO）对照所需的细胞。推荐的流式细胞术染色方案见 表2.
    注意： 在进行以下步骤时，建议将细胞置于冰上或4℃环境中。 °C，并在存在荧光染料时用铝箔保护细胞避光。可使用多通道移液器将液体加入96孔染色板，以加快处理速度。从离心后的板中吸除上清液时，注意不要扰动细胞沉淀。如果离心机未配备板适配器，也可在FACS管中进行染色。自此步骤之后的所有离心步骤均在456 × g下离心5 min，温度为4 °C。 °C.
  17. 离心板，然后用 FACS 缓冲液洗涤细胞两次。每次洗涤加入 200 μ加入 1 mL FACS 缓冲液至各孔，离心平板，然后吸除上清液。
  18. 加入50 μL封闭液进行封闭步骤 μ每孔加入含抗小鼠 CD16/CD32（纯化的 Fc 封闭抗体）（0.5 µg). 4℃孵育细胞 °15 分钟。按上述方法用 1×PBS 洗涤细胞一次。
  19. 加入100 μl 活性染料（可固定活性染料用 1x PBS 稀释至 1:1,000）加入细胞中。在 4℃ 下对细胞进行染色 °在暗处（冰箱中）孵育30分钟。按上述方法用FACS缓冲液洗涤细胞两次。
  20. 第二次洗涤后，加入100 μ根据所述染色方案，将细胞表面抗体或四聚体各1微升加入相应的孔中 表2. 4℃下染色细胞 °在暗处（冰箱中）孵育30分钟。此时，同时加入用于染色单阳性和FMO对照的抗体。
    注意： 关于单阳对照，建议使用经不同荧光染料标记的CD4抗体染色的脾细胞，或使用本抗体组合中所用抗体染色的商业补偿微球。在进行染色操作前，所有流式细胞术抗体均应通过预实验进行滴定，以确定染色的最佳浓度。
  21. 用上述方法用FACS缓冲液洗涤细胞两次，然后通过将细胞重悬于50 μl 的 4% 多聚甲醛（将 16% 多聚甲醛储备液用 ddH₂O 稀释）2O）并在室温下孵育10分钟。 注意： 多聚甲醛具有毒性，只能在通风橱中操作。
  22. 用FACS缓冲液洗涤细胞两次，每次洗涤之间进行离心。将细胞重悬于FACS缓冲液中。继续下一步操作，或在避光条件下将细胞置于冰箱中保存，最多可保存三天。
  23. 离心细胞，弃上清液，并用150 mL缓冲液将细胞洗涤两次。 μ1× 破膜/洗涤缓冲液（Perm/Wash 缓冲液），每次加入后均需离心。Perm/Wash 缓冲液由 10× 储存液按 1:9（v/v）比例用 ddH₂O 稀释制备。2O.
  24. 第二次洗涤后，将细胞重悬于150 μL中 μ1 mL 透膜/洗涤缓冲液，4 ℃孵育 15 分钟 °在暗处。
  25. 再次离心细胞，然后吸除上清液。将细胞重悬于 50 μ含抗IFN-γ抗体的1×破膜/洗涤缓冲液lγ 并在 4 ℃ 孵育 1 小时 °在暗处
  26. 用 1× 破膜/洗涤缓冲液洗涤细胞两次，每次间隔离心。将细胞重悬于 250 µ加入 FACS 缓冲液，然后将细胞转移至 FACS 管中。
  27. 使用具有适当激光配置和滤光片组的流式细胞仪，进行流式细胞术数据采集，以区分本方案所述染色面板中所用的荧光染料 表229每份样本至少采集 200,000 个事件，补偿对照采集 10,000 个事件。
  28. 应用补偿矩阵，并使用流式细胞术分析软件分析数据30.

7. 感染高峰期脾脏和肝脏中细菌载量的测定

注意：所有步骤均须在生物安全柜内进行，除非另有说明。

  1. 使用第4步中所述的操作程序，通过腹腔注射（i.p.）将 2 × 104 CFU 的病原体接种至小鼠体内。
  2. 感染后第3天，准备无菌的1.5 ml微量离心管，每管加入500 μl 冰上预冷的无菌0.1% Triton X-100（溶于1×PBS），以及0.2–0.3 g 酸洗无菌玻璃珠（直径1.5–2 mm）。称量每根离心管的重量。
    注意： 玻璃珠的酸洗方法为：将玻璃珠置于烧杯中，加入10%乙酸，在磁力搅拌器上孵育1小时。随后用ddH2O充分冲洗以去除残留酸液，风干后高压灭菌，备用。
  3. 通过CO2暴露法处死小鼠。
  4. 进行器官解剖时，将动物仰卧于解剖板上，使用25 G针头固定四肢。用70%乙醇润湿皮肤进行消毒。
  5. 使用无菌耐切割剪刀，从腹股沟至胸部中线做一纵向切口，再从腹股沟中点分别向两侧膝盖、从胸部中点分别向两侧肘部剪开。钝性分离并翻折皮肤，用25 G针头固定切口。
  6. 用70%乙醇润湿肌肉层进行消毒，然后使用无菌精细剪刀沿腹膜壁正中线剪开。用镊子夹住剑突，再用同一把精细剪刀从剑突处向两侧沿肋骨边缘、紧贴膈肌下方剪开腹膜壁，以暴露肝脏。
  7. 使用无菌剪刀切取约100 mg的肝组织（所有小鼠均使用同一肝叶），放入已预先称重的1.5 ml微量离心管中。
  8. 用镊子轻轻拨开腹腔左侧器官以暴露脾脏。用镊子轻夹脾脏，剪除周围结缔组织，将其从腹腔中取出。
  9. 将脾脏放入已预先称重、含有玻璃珠的1.5 ml微量离心管中。将组织样本置于含冰的防漏容器中运送至实验室。重新称量含组织的离心管，以确定组织重量（单位：mg）。
  10. 使用珠磨匀浆器以30赫兹频率振荡3分钟，对组织进行匀浆处理。
    注意： 珠磨法是首选的匀浆方法，因其适用于高通量样本处理，且操作更清洁、可降低病原体暴露风险。但也可选用自动匀浆器或经高压灭菌的2 ml手动玻璃匀浆器作为替代方案。
  11. 将匀浆液用含0.1% Triton-X-100的1×PBS进行10倍系列稀释（从原液至10-7）。
  12. 使用无菌涂布棒将每种稀释度的匀浆液各100 μl涂布于BHI琼脂平板（每个稀释度设两个重复）。将平板转移至37 °C培养箱中，过夜培养。
  13. 保留每个平板上菌落数在30–300之间的平板，其余弃去。计数每个平板上的菌落数，并计算重复样本的平均菌落数。
  14. 根据以下公式计算每毫克组织的CFU数：
    CFU/mg = 匀浆液中的CFU/ml × 制备的匀浆液体积（ml） ÷ 被匀浆组织的重量（mg）。
    注意： 例如，若将一块120 mg肝组织在0.5 ml中匀浆，取其10-2稀释液100 μl涂板，平均计数为30个菌落，则计算如下：
    CFU/ml = 30个菌落 × 100（稀释倍数） / 0.1 ml（涂布体积） = 30,000 CFU/ml。
    CFU/mg = 30,000 CFU/ml × 0.5 ml匀浆液体积 / 120 mg组织重量 = 125 CFU/mg。

8. 影响因素 单核细胞增生李斯特菌 关于IFN-γ CD4应答+ 和 CD8+ 细胞

注意：本实验方案描述了如何通过两种方法检测在适应性免疫反应高峰期（感染后约 7 天）获取的小鼠脾脏 CD4+ 和 CD8+ 效应 T 细胞中 IFN-γ 的产生水平：(1) 采用细胞内细胞因子染色结合流式细胞术检测 CD4+ 和 CD8+ 细胞中的 IFN-γ；(2) 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测脾细胞产生的总 IFN-γ 水平（包括所有 T 细胞）。所有操作均在生物安全柜内进行。

  1. 按照步骤4中所述方法，通过腹腔注射 2 × 104 CFU 病原体感染小鼠。
  2. 感染后第7天，根据机构指南，通过吸入 CO2 处死小鼠。
  3. 解剖脾脏（如上所述），放入含有无菌1×PBS的15 ml锥形管中。将管子置于含冰的防漏容器中运送至实验室。
  4. 将脾脏处理成单细胞悬液，按第6节所述方法裂解红细胞，然后将细胞重悬于含10% FCS的完全RPMI培养基中。使用血细胞计数板计数细胞。
  5. 建立用于检测IFN-γ应答的细胞培养体系。将细胞（4 × 106 个/1 ml/孔）加入24孔板中，并加入等量（4 × 106 个或1 ml/孔）解冻的热灭活L. monocytogenes（按步骤5制备）。 将细胞转移至37 °C培养箱中孵育。
  6. 孵育20小时后，向各孔中加入0.66 μl/ml蛋白转运抑制剂，继续孵育。
  7. 4小时后，将培养板转移至生物安全柜，收集500 µl培养上清液，于-80 °C冻存，用于后续使用商用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒31检测IFN-γ水平。然后将细胞收集至无菌15 ml离心管中。用1×PBS洗涤各孔，并将洗涤液与收集的细胞合并。
  8. 按照步骤6所述方法，对CD4+和CD8+细胞进行细胞表面染色及IFN-γ胞内染色，但使用表3中所述的染色组合。随后进行流式细胞仪检测（每样本采集200,000个事件），并使用流式细胞分析软件2930进行数据分析。

9. 检测小鼠感染后的生存终点 单核细胞增生李斯特菌 感染

注意：本方案描述了某种试剂对小鼠感染病原体后在改良 LD50 剂量下存活至实验终点的影响。所有这些操作均在动物设施的生物安全柜（BSC）中进行。

  1. 按照步骤4所述，对小鼠进行腹腔注射改良的L. monocytogenes半数致死剂量（LD50）。该剂量确定为105 CFU（雄性）或1.5 × 105 CFU（雌性）31。
  2. 每天两次观察小鼠的临床症状，并在实验记录本中记录这些症状及动物体重。若小鼠体重减轻达20%，或出现两种李斯特菌病的临床症状（精神萎靡、毛发竖立、蜷缩姿势、呼吸困难、眼神呆滞或眼窝凹陷），则实施安乐死。
  3. 感染后第14天，通过吸入CO2对存活小鼠实施安乐死。
  4. 通过绘制每组小鼠的存活率随时间变化的曲线，制作Kaplan-Meier生存曲线32。
    注意：若小鼠死于感染（达到伦理声明中所述终点），通常发生在感染后第5天（图7）。

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结果

图3 展示感染后24小时脾脏NK细胞和NKT细胞中IFN-γ的典型流式细胞术染色结果，感染剂量为105 病原体的菌落形成单位（CFU）。该图还展示了前述染色 panel 的设门策略 表 2. 图4 展示了一项实验中获得的代表性数据，其中雄性小鼠经 PPARα 拮抗剂 IS001 或溶剂对照处理，并感染了 105 CFU L. monocytogenes 然后在感染病原体24小时后分析NK细胞和NKT细胞中的IFN-γ。该图显示，经IS001处理后，NKT细胞的IFN-γ反应增强，而NK细胞则无此反应。 图5 显示脾脏 CD4 细胞中 IFN-γ 的代表性染色结果+ 和 CD8+ 感染后7天经再刺激的T细胞 离体 使用热灭活病原体。该图还展示了前述染色方案的设门策略 表3.

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讨论

在此，我们描述了一种使用EGD菌株进行基础实验性感染的实验方案 单核细胞增生李斯特菌25 在雄性或雌性 C57BL/6J 小鼠中。本方案旨在研究新型小分子 IS001 对天然免疫和适应性淋巴细胞产生 IFN-γ 的影响 在体31通过监测感染后的细菌清除情况和宿主存活率，研究人员深入了解了IFN-γ的这些变化如何影响宿主控制感染的能力。

实验方案中的关键注意事项

在设计此类研究时，一个重要考虑因素是每个实验都应具备足够的检验效能，并设置适当的对照。由于机体对感染的免疫反应存在生物学变异（见图4和图6），建议在初步免疫学研究中每组使用 N = 4 - 5 只小鼠。如果在这些研究后数据呈现出趋势，但组间差异尚不显著，可进行功效分析，以确定后续研究中达到统计学显著性所需的最少动物数量。关于对照设置，应包括未感染对照，以确定免疫学研究中IFN-γ反应的基础水平；同时应设置载体对照，以帮助区分治疗本身的作用与给药操作所引起的应激效...

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披露

无利益冲突需要披露。

致谢

本方案的开发得到了加拿大卫生研究院（CIHR，项目号MOP97807）向SED提供的运营资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
改良脑心浸液肉汤BD299070任何品牌均可适用
琼脂BD214010任何品牌均可适用
曲拉通 X-100Sigma-AldrichX100任何品牌均可适用
1x PBSSigmaD8537任何品牌均可适用
TissueLyser IIQiagen85300任何品牌均可适用
氯化铵 (NH3Cl)任何品牌均可适用
KHCO3任何品牌均可适用
Na2EDTA任何品牌均可适用
RPMI 1640Gibco22400089任何品牌均可适用
胎牛血清 Gibco12483使用前于 56 °C 水浴 30 分钟以灭活
L-谷氨酰胺Gibco25030任何品牌均可适用
非必需氨基酸Gibco11140任何品牌均可适用
青霉素/链霉素Gibco15140任何品牌均可适用
高尔基体阻断蛋白转运抑制剂（含莫能菌素）BD554724在 6 ml 细胞培养液中加入 4 μl
16% 多聚甲醛Electron Microscopy Sciences15710用 ddH2O 或 1x PBS 稀释至 4%
10x 穿透/洗涤缓冲液BD554723用 ddH2O 稀释至 1x
Fc 封闭剂，抗小鼠 CD16/CD32 纯化抗体eBioscience14-0161按 1:50 稀释
可固定活力染料 eFluor 506eBioscience65-0866按 1:1,000 稀释（我们也曾使用 Molecular Probes 公司的活力染料）
抗小鼠 CD4-PE-Cy5（GK1.5）eBioscience15-0041厂家推荐特定检测用量；但使用前应进行滴定。
抗小鼠 CD8-FITC（53-6.7）eBioscience11-0081厂家推荐特定检测用量；但使用前应进行滴定。
PBS57/mCD1d 四聚体-APCNIH 四聚体核心设施N/A由该设施馈赠获得
抗小鼠 TCRβ-PE-Cy7（H56-597）eBioscience25-5961厂家推荐特定检测用量；但使用前应进行滴定。
抗小鼠 NKp46-APC-eFluor780（29A1.4）eBioscience47-3351厂家推荐特定检测用量；但使用前应进行滴定。
抗小鼠 CD45 PE-Cyanine7（30-F11）eBioscience25-0451厂家推荐特定检测用量；但使用前应进行滴定。
抗小鼠 IFN γ-PE（XMG1.2）eBioscience12-7311厂家推荐特定检测用量；但使用前应进行滴定。
OneComp eBeadseBioscience01-1111每次染色使用一滴
小鼠 IFN γ ELISA 试剂盒eBioscience88-7314用于检测培养上清液中的干扰素 γ
50 ml 通气培养管用于细菌培养，任何品牌均可适用
1.5 ml 微量离心管任何品牌均可适用
细菌培养皿任何品牌均可适用
2 ml 冻存管任何品牌均可适用
紫外分光光度计任何品牌均可适用
安全型针头任何品牌均可适用
C57BL/6JJackson 实验室Stock#000664订购时要求 7 周龄到达
漂白剂用于去污染
70% 乙醇用于去污染
玻璃珠任何品牌均可适用
离心机需配备转子、吊篮及吊篮盖。
微量离心机任何品牌均可适用
无菌甘油任何品牌均可适用
移液器吸头任何品牌均可适用
移液器任何品牌均可适用
手术器械任何品牌均可适用
70 微米细胞筛任何品牌均可适用
3 ml 注射器任何品牌均可适用
移液枪任何品牌均可适用
过滤装置任何品牌均可适用
台盼蓝用 ddH2O 按 1:9 稀释，任何品牌均可适用
血细胞计数板任何品牌均可适用
圆底培养板任何品牌均可适用
FACs 管Fisher Scientific14-959-5
BD LSR IIBD任何具备合适激光配置和滤光片组以区分所用荧光染料的流式细胞仪均可用于数据采集
FlowJo 软件Treestar用于数据分析。其他类型的数据分析软件也可适用
多通道移液器（0 - 300 µl）Eppendorf用于流式细胞术染色过程中的细胞洗涤及抗体添加
乙酸用于清洗玻璃珠，任何品牌均可适用
Microbank 细菌保存系统Pro-lab Diagnostics作为甘油保种的替代方法，用于细菌的长期保存

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干扰素γ小鼠感染流式细胞术细菌载量脾脏肝脏IFN-γ应答胞内病原体宿主免疫存活实验
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