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方法文章

活体原代人巨噬细胞感染HIV-1后吞噬体的迁移与速度测定

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DOI：

10.3791/54568

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2016年9月5日

 ,  ,  , 
1Inserm U1016, Institut Cochin, CNRS UMR 8104, Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité

本文内容

摘要

我们描述了一种利用旋转盘共聚焦荧光显微镜识别荧光标记的感染细胞，并结合明场显微镜检测吞噬体，以测量在感染或未感染人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的活细胞中向细胞中心移动的吞噬体速度的方法。

摘要

巨噬细胞是一类吞噬性细胞，在先天免疫与特异性免疫的交汇点发挥重要作用。巨噬细胞可被人类免疫缺陷病毒（HIV）-1感染，由于其对病毒的细胞病变效应具有抵抗性，因此可被视为持续存在的病毒储存库。此外，感染HIV的巨噬细胞表现出功能缺陷，这有助于机会性疾病的产生和发展。

HIV-1 损伤巨噬细胞吞噬反应的确切机制此前尚不清楚。我们先前已证明，当巨噬细胞感染 HIV-1 后，其对多种颗粒物质的摄取能力受到抑制。这种抑制仅为部分性，且在 HIV 感染的巨噬细胞中仍可形成吞噬体。因此，我们聚焦于分析这些吞噬体的命运。吞噬体成熟过程伴随着这些区室向细胞中心迁移，并与溶酶体融合，形成负责降解摄入物质的吞噬溶酶体。我们采用 IgG 包被的绵羊红细胞作为吞噬作用的靶标。为了测量单个 HIV 感染巨噬细胞中吞噬体向心运动的速度，我们结合使用了明场和荧光共聚焦显微镜技术。我们建立了一种方法，用于计算吞噬体与细胞核之间的距离，进而计算吞噬体的运动速度。HIV 感染细胞通过表达 GFP 的病毒进行识别，但该方法同样适用于未感染细胞或任何其他类型的感染或处理条件。

引言

巨噬细胞在先天免疫系统和机体稳态中发挥重要作用。它们是专职的吞噬细胞，通过一种称为吞噬作用的过程内化并清除病原体和细胞碎片1,2。在颗粒物质被吞噬后形成的封闭结构称为吞噬体，其会与胞内体区室发生一系列融合和分裂事件，最终形成具有降解功能的吞噬溶酶体。该区室因获得质子泵v-ATPase而呈现酸性pH环境，含有水解酶，并富含溶酶体相关膜蛋白（LAMPs）。吞噬体的成熟过程伴随着其沿微管向细胞中心迁移3,4，最终到达核周区域，此处聚集了大量溶酶体。

已有多种病原体被报道可劫持吞噬体成熟过程，包括一些具有胞内生活方式的细菌，它们会修饰自身所处的囊泡环境5。人类免疫缺陷病毒（HIV）-1除感染T细胞外，还可靶向巨噬细胞。与T细胞不同，巨噬细胞对病毒的细胞病变效应具有抗性，因此可被视为病毒的储存库。此外，感染HIV-1的巨噬细胞表现出吞噬功能缺陷，并促进机会性疾病的出现。特别是，由伤寒沙门菌鼠伤寒血清型ST313（Salmonella Typhimurium ST313）引起的严重侵袭性非伤寒沙门菌病，在过去三十年中在中国台湾撒哈拉以南非洲的HIV感染儿童和成人中广泛流行6。据估计，与未感染HIV的人群相比，HIV感染者患结核病的风险高出20倍以上。

基于上述所有原因，明确HIV感染巨噬细胞中吞噬功能缺陷的分子机制显得尤为重要。我们已证实，在HIV感染的巨噬细胞中，颗粒物质、调理颗粒、细菌或真菌的摄取均受到抑制7。鉴于这种抑制作用是部分性的，我们进一步着手分析HIV感染人巨噬细胞中已内化吞噬体的命运8。由于吞噬体成熟过程与向细胞中心迁移以及与溶酶体融合密切相关，因此感染细胞内吞噬体成熟缺陷可能源于细胞内运输模式的改变。本文所述方法采用IgG调理的绵羊红细胞（IgG-SRBCs）作为模型，以靶向受体介导的吞噬作用，特别是针对免疫球蛋白Fc段的受体（FcR）。与乳胶微球相比，这些颗粒在明场（BF）下更易于成像，因为细胞外和细胞内的SRBCs具有不同的折射特性9。为了测量HIV感染巨噬细胞中向细胞核方向移动的吞噬体的速度，我们使用了一种荧光病毒10，并建立了一种简单的手动追踪方法，本文对此进行了描述。该方法无需高级编程，仅使用ImageJ软件即可完成。该方法适用于贴壁细胞，以及任何可通过明场显微镜或荧光成像观察的颗粒或病原体。

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方案

该方案必须严格依照国家和国际法律法规以及当地规定执行。用于实验的健康献血者血液来自与各机构签署协议的血液中心，且献血者已知情同意将其血液用于科研目的。使用人血时必须采取特殊防护措施。根据当地法规，HIV-1相关实验必须在生物安全三级或二级（BSL-3 或 2）实验室中进行。

1. 通过密度梯度离心及贴壁筛选法准备人单核细胞来源的巨噬细胞（hMDMs）

  1. 从健康供体采集新鲜血液（9 ml），将全部体积的新鲜血液用无钙的无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）稀释2+ 和 Mg2+ 以获得终体积70 ml，将稀释后的血液轻柔加入两个50 ml锥形管中（每管35 ml），每管内已预先加入15 ml中性、高度支化、高分子量、亲水性多糖溶液。
  2. 将两管血液在537 × g下离心20分钟，温度为 20 °C 不刹车。然后收集位于界面处浑浊细胞环中的外周血单个核细胞（PBMCs），并将其转移至含有15 ml不含Ca²⁺的1x PBS的新50 ml离心管中2+ 和 Mg2+.
  3. 以 218 x g 离心 5 分钟，温度设为 20 °C 并将沉淀重悬于45 ml不含Ca的1x PBS中2+ 和 Mg2+.
  4. 以 218 x g 离心 5 分钟，温度设为 20 °C，将沉淀重悬于10 ml不含Ca的1x PBS中2+ 和 Mg2+，用台盼蓝稀释至最终稀释比例为1/200后计数细胞。
  5. 以 218 x g 离心 5 分钟，温度设为 20 °C 将沉淀重悬于添加了2 mM L-谷氨酰胺的RPMI（Roswell Park Memorial Institute）1640培养基中，并 100 µg/ml 青霉素-链霉素，使浓度达到 7 x 106 每孔加入2 ml培养基，每孔含PBMCs若干。
  6. 将培养板置于培养箱中孵育 37 °C 含5% CO2 孵育2小时。2小时后，单核细胞将已贴附于塑料表面。
  7. 为使 freshly-isolated 单核细胞分化为 hMDMs，吸除培养基，加入 2 ml hMDM 培养基（RPMI 1640，10% 去补体胎牛血清（FCS），2 mM L-谷氨酰胺和 1% 青霉素-链霉素），并添加重组人巨噬细胞集落刺激因子（rhM-CSF），使其终浓度为 10 ng/ml。
  8. 将细胞置于培养箱中孵育 37 °C 含5% CO2 11天图1).
  9. 第11天，移除培养基，每孔用2 ml冷hMDM培养基洗涤2次。随后每孔用1 ml冷1×PBS洗涤2次。
  10. 为使完全分化的hMDMs脱落，用1 ml含2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的冷1×PBS洗涤每孔1次，并在每孔中加入2 ml含2 mM EDTA的冷1×PBS，于15–60分钟内孵育 4 °C.
    注意：存在其他用于解离细胞的方法（例如， 胰蛋白酶或类胰蛋白酶活性，这些活性可能产生良好的结果 11.
  11. 消化完成后（通过在孔中轻轻吹打使细胞脱落），收集细胞并置于冰上含有10 ml冷hMDM培养基的50 ml离心管中。
  12. 以 218 x g 离心 5 分钟，温度设为 20 °C，将沉淀重悬于10 ml冷hMDM培养基中，用台盼蓝按1/20稀释后计数细胞。
  13. 以 1 x 106 每35 mm玻璃底培养皿中加入hMDMs，并将培养板置于培养箱中孵育 37 °C 含5% CO2 1天。

2. HIV-1 病毒储备液的制备与定量

注意：使用携带R5嗜性包膜的NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP（绿色荧光蛋白），该质粒由M. Schindler惠赠10，用于感染巨噬细胞并实时观察感染细胞。

  1. 使用商品化转染试剂，将相应前病毒DNA（6 µg）转染人胚胎肾293T细胞（100 mm培养皿中接种2 × 106个），制备病毒原液。
  2. 采用指示细胞HeLa TZM-bl（携带由HIV-1 LTR调控的ß-半乳糖苷酶基因）对病毒原液的感染性进行定量：对病毒原液进行系列稀释，作用于指示细胞后进行ß-半乳糖苷酶染色，计数显色的蓝色细胞12。

3. 用HIV-1感染hMDM

  1. 在1 ml hMDM培养基中，以0.02–0.03的感染复数（MOI）将病毒加入hMDM细胞（细胞接种于1.13步骤中）。对照孔中仅加入1 ml hMDM培养基，并将培养皿置于37 °C、5% CO2条件下培养2天（图1）。
  2. 第2天，用hMDM培养基洗涤细胞3次，每皿加入1 ml新鲜hMDM培养基。将细胞在37 °C、5% CO2条件下继续培养6天（图1）。

4. 绵羊红细胞的调理作用

  1. 每培养皿准备 7 × 106 个 SRBC，将 SRBC 用含 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的 1× PBS 溶液洗涤两次，每次 100 µl，600 × g 离心 4 分钟。
  2. 将洗涤后的 SRBC 重悬于 500 µl 含 0.1% BSA 的 1× PBS 中，每 5 µl SRBC 加入亚凝集浓度的兔抗 SRBC IgG，并在室温下旋转孵育 30 分钟。
    注意：为确定抗 SRBC IgG 的亚凝集浓度，将 IgG（储存浓度为 13.1 mg/ml）在 96 孔板中用 20 µl 体积进行系列稀释，稀释倍数从 1/50 至 1/25,600。每孔加入 2 × 106 个 SRBC（20 µl），将板置于暗处数小时。亚凝集浓度即为出现凝集（IgG 与 SRBC 形成网状结构）前一个孔的稀释度。
  3. 旋转孵育后，将 IgG 调理的 SRBC 在 600 × g 离心 4 分钟，用 100 µl 含 0.1% BSA 的 1× PBS 洗涤一次，再次于 600 × g 离心 4 分钟。
  4. 将 IgG 调理的 SRBC 重悬于预热的不含酚红的 RPMI 培养基中，培养基中添加 2 mM L-谷氨酰胺和 1% 青霉素-链霉素（每培养皿 1 ml）。

5. 活细胞视频显微镜吞噬作用检测

  1. 使用配备加热培养室的共聚焦成像系统，例如转盘式系统 37°C 与 CO2 通过装有水的瓶子进行加湿。
  2. 实验前打开加热腔，使显微镜载物台达到所需温度 37 °C 在吞噬作用检测开始之前，打开显微镜和计算机，并启动成像软件。
  3. 优化成像设置，例如扫描速度、放大倍数、分辨率 等等。 每视野至少包含一个细胞，并在60至120分钟期间每分钟拍摄一帧图像。
    注意：此处使用63倍物镜，对样品每分钟成像一次，持续60分钟。
  4. 将成像培养皿置于显微镜载物台上。调节焦距和位置，使视野中仅包含一个完整的HIV-1感染巨噬细胞。根据所使用的成像系统和探针，设置适当的激发/发射参数。添加明场（BF）通道以观察吞噬体图1ii). 通过调整透射光百分比和曝光时间，优化各通道图像的显示效果。
    注意：此处使用491 nm激光激发NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP，激光功率为20%，曝光时间为50毫秒图1i).
  5. 移除成像培养皿，加入1 ml浓度为7 x 10⁸/ml的SRBC悬液6 SRBCs/ml 加入培养皿中（图1).
  6. 在室温下以 500 x g 离心 2 分钟以同步吞噬作用，记录此次离心结束的时间，并将培养皿放回显微镜载物台。
  7. 优化焦距，并以一定步进距离（贯穿细胞厚度）进行Z轴层扫，采集GFP和明场图像 0.3 µm 每分钟采集约20个层面，持续至少1小时。将延时视频以所用成像系统的原生文件格式保存。
    注意：此处，延时电影以原始格式保存，即 *.stk 文件。

6. 时间序列影片的分析

  1. 进行视频编辑时，在视频编辑软件中点击下拉菜单“Apps”，然后点击“Review Multi Dimensional Data”标签页。
    1. 要打开文件，请点击“Select Base File”，然后点击“Select Directory”。在“Data sets”框中选择要分析的采集数据（.nd 格式），然后点击“View”。数据将以表格形式显示，时间位于列，Z 平面位于行。
    2. 为了以 Z 投影方式展示感染情况（图 2，左侧面板），在“Wavelengths”框中选择 491 nm 波长，然后点击“Z projection”标签页并选择“all planes”。
    3. 为了分析时间序列，在“Wavelengths”框中选择 BF 波长，并在 Z 轴上选择最佳平面，以区分外部 SRBCs（图 2，红色箭头）、内部 SRBCs（图 2，红色圆圈）和细胞核（图 2，蓝色圆圈）。
    4. 要保存视频拼接图，点击“Selection [X's]”标签页，然后点击“Load Image(s)”。最后，将加载的图像保存为 .tif 格式，并在 ImageJ 软件中打开。
  2. 在 ImageJ 软件中使用“Manual Tracking”插件，测量在 BF 通道中观察到的细胞核和不同吞噬体的位置（图 3）。
    1. 从 ImageJ 网站下载“Manual Tracking”插件。在 ImageJ 中打开该插件和待分析的图像序列（图 3，步骤 1 和 2）。
    2. 输入设置参数，例如“Time Interval”（表示相邻帧之间的时间间隔）和“x/y calibration”（表示每个像素对应的实际距离）（图 3，步骤 3）。
      注：此处，图像序列的帧间时间间隔为 1 分钟，x/y 标定值为 0.205 µm，因为使用了 63X 放大倍数和像素尺寸为 6.45 × 6.45 µm2 的相机。
    3. 开始追踪时，点击“Add track”（图 3，步骤 4），并在 SRBC 被内吞的第一个时间点点击其中心。下一帧将自动显示。
    4. 在所有帧中持续点击 SRBC 中心，以获得其随时间变化的位置（图 3，红色框内步骤 6）。
      1. 首先追踪细胞核，通过点击其中心获取其在所有帧中的位置。然后依次追踪各个吞噬体（通过点击其中心），追踪起始时间（帧）为其被内吞的时间，不同 SRBC 的内吞时间可能不同。为便于在 BF 通道中观察 SRBC，可在追踪过程中使用“Brightness & contrast”窗口进行调节（图 3，步骤 5）。
    5. 每次完成一个 SRBC 的追踪后，点击“Add track”（图 3，步骤 4）以创建新的追踪轨迹。追踪编号将在结果表格的第二列“Track n°”中更新（图 3，步骤 6）。
    6. 将数据保存至电子表格中，以便进行下一步分析。
  3. 使用电子表格软件计算含有 SRBC 的吞噬体向细胞核移动的距离，以及 SRBC 被内吞后前 5 分钟内的吞噬体运动速度（图 4）。
    1. 打开电子表格数据和一个新的电子表格文件。仅将以下参数转移至新文件：时间、细胞核及所有 SRBC 的 x 和 y 坐标（图 4A）。
    2. 仅根据坐标计算 SRBC 与细胞核之间的距离时，可将细胞核和一个 SRBC 视为 XY 坐标平面上的两个点（图 4B）。
      注：两点之间的距离即连接它们的路径长度。在平面上，SRBC 与细胞核之间的距离由勾股定理给出。
      1. 若 c（细胞核与 SRBC 之间的距离）表示斜边长度，a 和 b 表示另外两边的长度，则勾股定理可表示为以下勾股方程：
        勾股定理，公式 \(c^2 = a^2 + b^2\)，数学概念，几何学。
        注：同时，在直角坐标系中，水平距离 a 为 (xnucleus-xSRBC)，垂直距离 b 为 (ynucleus-ySRBC)。
      2. 因此，通过以下公式计算细胞核与 SRBC 之间的距离（图 4A，紫色框）：
        距离公式的方程；涉及 (x, y) 坐标；对几何分析至关重要。
        注：将计算得到的距离值（单位为像素）乘以 x/y 标定值，即可转换为 µm。此处 x/y 标定值为 0.205 µm。
      3. 在每个时间点，用初始距离减去当前细胞核与 SRBC 之间的距离（图 4C）。
      4. 将前 5 分钟内的测量值对时间作图。为图表添加线性趋势线（图 5A），并确定该线性趋势线的斜率，该斜率代表 SRBC 内吞后前 5 分钟内吞噬体向细胞核移动的速度。
      5. 汇总数据，计算速度值的平均值和统计误差，并使用适当的软件以合适的形式绘图（图 5B）。

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结果

本文描述了利用IgG包被的绵羊红细胞（SRBCs）作为模型靶标，检测HIV-1感染与未感染人单核细胞来源巨噬细胞（hMDMs）中Fc受体介导的吞噬作用的方法（图1）。该实验方案的关键步骤包括hMDMs的制备以及HIV-1感染。事实上，不同供体来源的巨噬细胞分化产量和质量存在差异，且HIV-1感染效率通常在10–40%之间。此外，IgG包被SRBCs的制备也至关重要，需避免损伤红细胞，否则可能导致红细胞被识别为细胞碎片而被非特异性摄取，而非通过Fc受体介导的吞噬作用被摄取。充分的包被可确保高效的吞噬作用。

在生物安全三级实验室中，使用旋转盘共聚焦显微镜的明场通道对活体HIV感染巨噬细胞内吞噬体的运动进行实时分析。明场通道的设置对于观察细胞核（图2，蓝色圆圈）以及区分外部红细胞（图2，红色箭头）与已内化的SRBCs（图2，...

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讨论

该技术包含若干关键步骤。首先，人源单核细胞来源的巨噬细胞（hMDMs）的制备及其感染HIV-1的过程至关重要，因为感染率依赖于供体差异。值得注意的是，我们选择使用未极化的巨噬细胞 体外 感染前，因为病毒可能遇到的巨噬细胞状态 体内 迄今为止尚未得到充分表征。我们检测了多种表面标志物的表达，结果表明这些巨噬细胞既不属于M1型也不属于M2型，并验证了CD4和CCR5的表达。感染率存在差异，范围在10%至40%之间，有时更低。这种可变的感染率导致在显微镜下难以找到HIV-1感染的荧光标记hMDM细胞。此外，在离心步骤后立即寻找HIV-1感染细胞所需的时间也可能导致成像采集的启动延迟。吞噬作用可在不依赖离心所引起的结合与内吞同步化的情况下启动。然而，该方案不适用于在到达细胞前会漂浮的SRBCs，但对于微珠则可能是一个可行的选择。为了最大限度缩短寻找感染细胞所需时间，可在进行吞噬实验前使用带网格的玻璃底培养皿来定位HIV-1感染的hMDM细胞。所选定的HIV感染细胞具有 "合理的" 其周围的SRBC数量将被迅速选定以开始采集。 "适量SRBC" 意味着每个细胞至少含有10个SRB...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Jamil Jubrail 博士审阅本文手稿。本研究得到了法国国家科学研究中心（CNRS）、法国国家健康与医学研究院（Inserm）、巴黎笛卡尔大学、法国国家科研署（Agence Nationale de la Recherche，项目编号：2011 BSV3 025 02）、法国医学研究基金会（Fondation pour la Recherche Médicale，FRM DEQ20130326518，包括对 GLB 的博士奖学金资助）以及法国艾滋病与病毒性肝炎研究署（Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales，ANRS，包括对 CD 的博士后奖学金资助）向 FN 提供的资助。A. Dumas 获得了巴黎笛卡尔大学和 Sidaction 提供的博士奖学金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Falcon 100 mm 细胞培养皿（经TC处理）康宁353003用于病毒制备
35 mm 未包被玻璃底培养皿 1.5MatTek 公司P35G-1.5-14-C 型外壳用于采集
Falcon 细胞培养板 6 孔赛默飞世尔科技Corning. Inc. 353934人单核细胞来源的巨噬细胞
Ficoll-Plaque PLUSDominique Dutscher17-1440-03一种中性的、高度分支的、高分子量的亲水性多糖溶液，用于密度梯度离心
不含钙、镁的DPBS赛默飞世尔科技14190-094RT
Dulbecco改良型Eagle培养基（DMEM）1×，液体（高葡萄糖）GIBCO，Molecular Probes31966-0214℃ 保存 °C；用于HEK细胞培养
RPMI 1640 培养基 GLUTAMAX  补充材料Life technologies61870-0104℃下保存 °C；用于hMDMs培养
Fœ胎牛血清（FCS） EurobioCVFSVF0001-20℃保存 °C ；去补体
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）赛默飞世尔科技15140-122-20℃保存 °C；用于hMDMs培养
RPMI 1640 培养基，无酚红（10×500 ml）Life technologies11835-10537℃预热 °使用前将水浴预热至37°C；用于吞噬作用检测
FuGENE6 转染试剂PromegaE26924℃下保存 °C；用于病毒生产
绵羊红细胞（SRBCs）EurobioDSGMTN00-0Q在4℃的Alsever缓冲液中保存 °使用前置于 C
抗绵羊红细胞IgGMP Biomedicals558064℃下保存 °C
牛血清白蛋白热激组分，pH 7 ≥98% SigmaA7906-20℃保存 °C
倒置显微镜 DMI600Leica
共聚焦旋转盘装置  CSU-X1M1横河
491 nm 50 mW 激光器COBOLT CALYPSO
HCX PL APO CS 物镜Leica物镜；放大倍数 100X；数值孔径 1.40；浸油
CoolSnap HQ2（FireWire）相机光度测量像素大小 6.45 µm × 6.45 µ米；定义 1,392 x 1,040；以14位对图像进行编码
Metamorph 7.7.5 软件Molecular Devices显微镜的控制
GraphPad Prism 软件用于统计分析

参考文献

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