本文采用一种聚氨酯可调纳米孔，结合电阻脉冲传感技术，通过测量纳米颗粒的穿孔速度来表征其表面化学性质，该速度可用于确定单个纳米颗粒的Zeta电位。
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本文内容
摘要
摘要
纳米孔技术，统称为电阻脉冲传感器（RPS），被用于检测、定量和表征蛋白质、分子和纳米颗粒。可调电阻脉冲传感（TRPS）是RPS的一种较新改进技术，其整合了可实时调节的纳米孔。本文中，我们利用TRPS监测DNA修饰的纳米颗粒穿越可调纳米孔膜时的易位时间，研究其随DNA浓度和结构变化的情况即单链DNA到双链DNA
TRPS 基于两个 Ag/AgCl 电极，这两个电极被一种弹性孔膜隔开，在施加电场后可形成稳定的离子电流。与各种基于光学的颗粒表征技术不同，TRPS 能够在样品群体中对单个颗粒进行表征，从而可轻松分析多模态样品。在此，我们通过已知标准颗粒的穿孔速度来演示zeta电位的测量，并将这些标准应用于待测样品颗粒的穿孔时间，从而实现对这些分析物zeta电位的测定。
除了获取平均zeta电位值外，还通过逐颗粒分析的方法对所有样品进行测量，例如通过样品群体分布提供更详细的样品信息。该方法在医学和环境领域的传感应用中展现出潜在价值。
引言
功能化纳米颗粒在医学和环境领域作为生物传感器正变得越来越受欢迎。通过改变纳米颗粒的表面化学性质（例如使用DNA），在靶向药物递送系统1以及监测DNA-蛋白质相互作用2-4方面已显示出重要价值。在生物检测和治疗剂递送中，一种日益常用到的纳米颗粒特性是超顺磁性5。超顺磁性颗粒（SPPs）在从复杂混合物中识别和去除特定分析物方面极为有用，仅需使用一块磁铁即可实现。一旦被分离，结合了分析物的颗粒便可根据具体用途进行表征和分析。
以往用于检测和表征纳米颗粒的方法包括动态光散射（DLS），也称为光子相关光谱等光学技术。尽管DLS是一种高通量技术，但其局限性在于仅能提供基于平均值的测量结果；在分析多模态样品时，若未使用专业软件，较大颗粒会产生更强的主导信号，导致部分较小颗粒完全无法被检测到6,7。因此，逐颗粒表征技术在分析纳米颗粒及功能化纳米颗粒体系时更具优势。
基于电阻脉冲传感（RPS）的技术核心在于对样品施加电场，并监测颗粒通过合成或生物纳米孔时的传输机制。一种相对较新的基于RPS的纳米颗粒检测与表征技术是可调电阻脉冲传感（tunable resistive pulse sensing, TRPS）8-16。TRPS采用双电极系统，中间由一种弹性、可调孔径的膜隔开。可调孔径方法可通过分析物在孔道中传输的机制，实现对不同形状....
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方案
1. 配制含吐温-20的磷酸盐缓冲液（PBST）
- 将一个 PBS 片剂（0.01 M 磷酸盐缓冲液，0.0027 M 氯化钾，0.137 M 氯化钠，pH 7.4）溶于 200 ml 去离子水（18.2 MΩ cm）中。
- 向 200 ml 缓冲液中加入 100 µl 吐温-20（终浓度 0.05 (v/v)%），作为表面活性剂。
2. 准备羧基聚苯乙烯颗粒标准品
- 在80瓦功率下超声处理2分钟之前，先将校准颗粒涡旋振荡30秒，以确保颗粒的单分散性。
- 用PBST缓冲液将校准颗粒按1:100比例稀释至浓度为1×1010 个颗粒/mL，并涡旋振荡30秒。
3. 准备受包被链霉亲和素的微粒
- 在80瓦功率下超声处理2分钟之前，先将颗粒涡旋振荡30秒，以确保单分散性。
- 用PBST缓冲液将包被链霉亲和素的颗粒按1:100稀释，使最终浓度达到1×109 颗粒/mL，并涡旋振荡30秒。
注意：通常样品体积为200 µL。例如，若需检测五种不同浓度的DNA，则应准备1 mL稀释后的包被链霉亲和素颗粒。
4. 寡核苷酸的制备
- 用去离子水将....
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结果
图 1. 磁性纯化过程与 TRPS 测量的示意图。A) 磁性纯化样品的示例，起始样品中含有过量未结合的捕获探针 DNA。B) TRPS 测量示例：i) 颗粒通过纳米孔；ii) 颗粒暂时阻塞孔道中的离子，引起电流瞬时下降而产生的阻断事件；由此获取的信息用于计算颗粒的穿孔速度。请点击此处查看该图的放大版本。
在进行TRPS分析之前，去除样品中未结合到颗粒表.......
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讨论
Zeta电位的计算采用了一种基于校准的方法，该方法与Arjmandi et al.21 的研究相关。通过测量粒子在穿越纳米孔时的阻断持续时间随外加电压的变化，结合整个规则锥形孔道中的平均电场和粒子速度，来确定相关参数。电泳迁移率等于1/T（其中T为阻断持续时间）对电压的导数，再乘以传感区域长度l的平方。通过测量传感区域内多个参考点的平均速度，可最大限度地减少使用该方法计算Zeta电位时的误差。
孔径校准基于1/T与电压之间的线性关系， V在传感区域的每个参考点处，校准颗粒与样品颗粒的电动粒子速度， 
和
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披露
E.L.C.J.B. 由 Izon Science Ltd. 提供支持。
致谢
作者感谢Izon Science Ltd提供的支持。本工作由欧洲研究委员会（PCIG11-GA-2012-321836 Nano4Bio）资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma Aldrich, UK | P4417 | 1片溶于200 ml去离子水中，配制成缓冲液。 |
| Tween-20 | Sigma Aldrich, UK | P1379 | 在PBS缓冲液中作为表面活性剂，终浓度为0.05%（v/v） |
| 羧基化聚苯乙烯纳米颗粒 | Bangs Laboratories, US | CPC200 | 标称直径为220 nm，原始浓度为1 × 1012 粒子/mL，比表面电荷为86 µeq/g（相当于表面电荷密度为3.2 × 1019 C/nm2）。 |
| 链霉亲和素包被的纳米颗粒 | Ademtech, France | 3121 | 批次结合能力为4,352 pmol/mg（理论DNA结合能力为188 nM），原始浓度为1.1 × 1011 粒子/mL。 |
| 生物素化寡核苷酸 | Sigma Aldrich, UK | VC00001 | 供应商说明：反相1级纯化（0.05 Scale）；3'端修饰生物素；冻干粉末用去离子水重悬至100 µM，并按需稀释。序列：CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC GCGTGGC[Btn]3' |
| 标准寡核苷酸 | Sigma Aldrich, UK | VC00001 | 供应商说明：反相1级纯化（0.05 Scale）；冻干粉末用去离子水重悬至100 µM，并按需稀释。DNA靶标序列：完全互补序列 - 5'GCCACGCGTAGTGA GGTTTAACCAT3'，中间结合序列 - 5'GTAGTGAGGT3'，末端结合序列 - 5'GTTTAACCAT3'，部分互补悬垂序列 - 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'。 |
| Izon qNano | Izon Science, NZ | 系统固有压力为47 Pa | |
| Izon 可变压力模块（VPM） | Izon Science, NZ | 每“cm”压力约等于100 Pa。 | |
| 聚氨酯纳米孔膜 | Izon Science, NZ | NP150 | 分析物尺寸范围为60–480 nm，在45 mm拉伸下计算孔径为799 nm。 |
| Magrack 6 | GE Healthcare, UK | 28-9489-64 | |
| 超声水浴 | Fisher Scientific, UK | 10692353 | 80 瓦 |
| 涡旋振荡器 | IKA, Germany | 0003365000 | |
| 旋转滚轴混合器 | Labnet International, US | H5500-230 V |
参考文献
- Alexander, C. M., Maye, M. M., Dabrowiak, J. C. DNA-capped nanoparticles designed for doxorubicin drug delivery. Chem Commun. 47 (12), 3418-3420 (2011).
- Billinge, E. R., Platt, M. Aptamer based dispersion assay using tunable resistive pulse sensing (TRPS). Anal Method....
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重印与许可
