通过可调纳米孔中纳米颗粒跨膜迁移速度测定Zeta电位：以DNA修饰颗粒为例

摘要

本文采用一种聚氨酯可调纳米孔，结合电阻脉冲传感技术，通过测量纳米颗粒的穿孔速度来表征其表面化学性质，该速度可用于确定单个纳米颗粒的Zeta电位。

摘要

纳米孔技术，统称为电阻脉冲传感器（RPS），被用于检测、定量和表征蛋白质、分子和纳米颗粒。可调电阻脉冲传感（TRPS）是RPS的一种较新改进技术，其整合了可实时调节的纳米孔。本文中，我们利用TRPS监测DNA修饰的纳米颗粒穿越可调纳米孔膜时的易位时间，研究其随DNA浓度和结构变化的情况即单链DNA到双链DNA

TRPS 基于两个 Ag/AgCl 电极，这两个电极被一种弹性孔膜隔开，在施加电场后可形成稳定的离子电流。与各种基于光学的颗粒表征技术不同，TRPS 能够在样品群体中对单个颗粒进行表征，从而可轻松分析多模态样品。在此，我们通过已知标准颗粒的穿孔速度来演示zeta电位的测量，并将这些标准应用于待测样品颗粒的穿孔时间，从而实现对这些分析物zeta电位的测定。

除了获取平均zeta电位值外，还通过逐颗粒分析的方法对所有样品进行测量，例如通过样品群体分布提供更详细的样品信息。该方法在医学和环境领域的传感应用中展现出潜在价值。

引言

功能化纳米颗粒在医学和环境领域作为生物传感器的应用正日益广泛。通过改变纳米颗粒的表面化学性质，例如引入DNA，已被证明在靶向药物递送系统¹以及监测DNA-蛋白质相互作用^2-4方面具有重要价值。在生物检测和治疗药物递送中，一种日益常用的纳米颗粒特性是超顺磁性⁵。超顺磁性颗粒（SPPs）在从复杂混合物中识别和去除特定分析物方面极为有效，仅需使用一块磁铁即可实现分离。分离后，结合了分析物的颗粒可根据具体应用目的进行表征和分析。

以往用于纳米颗粒检测与表征的方法包括光学技术，例如动态光散射（DLS），也称为光子相关光谱法。尽管DLS是一种高通量技术，但其局限性在于仅能提供基于平均值的测量结果；在分析多模态样品时，若未使用专业软件辅助，较大的颗粒会产生更强的主导信号，导致部分较小的颗粒完全无法被检测到^6,7。因此，逐颗粒表征技术在分析纳米颗粒及功能化纳米颗粒体系时更具优势。

基于电阻脉冲传感（RPS）的技术核心在于对样品施加电场，并监测颗粒物通过合成或生物纳米孔时的传输机制。一种相对较新的基于RPS的纳米颗粒检测与表征技术是可调电阻脉冲传感（tunable resistive pulse sensing, TRPS）。^8-16. TRPS 是一种双电极系统，由弹性、可调孔径的膜将两电极隔开。可调孔径方法能够适用于多种形状的分析物¹⁷ 并通过颗粒穿过纳米孔的传输机制来测量其浓度和大小。可调纳米孔此前已被用于检测小颗粒（直径70-95 nm），其结果与其他技术（如透射电子显微镜，TEM）获得的结果相当。¹⁰当施加电场时，可观察到离子电流；当颗粒/分子通过纳米孔时，会暂时阻塞孔道，导致电流下降，这种现象可定义为“阻塞事件”。每个阻塞事件代表一个单独的颗粒，因此样品中的每个颗粒均可根据其阻塞幅度进行 individually 表征。 Δ, 和半高全宽， FWHM，以及其他阻断特性。当单个粒子通过纳米孔时对其进行分析，有利于多模态样品的检测，因为TRPS能够在单一样品中成功且有效地分辨出不同粒径的粒子。可调电阻脉冲传感可完成粒径测量¹⁰zeta 电位^12,18 浓度¹⁵ 在单次运行中同时进行测量，因此仍可区分相似甚至相同的样本 根据其表面电荷分离大小¹⁹；相较于其他尺寸分析技术具有优势。

Zeta电位定义为剪切面处的静电势²⁰，可通过颗粒在穿过微孔时的速度计算得出¹⁹。对单个颗粒进行Zeta电位测量，有助于深入了解纳米颗粒体系在溶液中的穿膜机制与行为特征，这对于未来多种应用中纳米颗粒检测方法的设计具有重要价值。此类逐颗粒分析还可揭示样品群体中Zeta电位值的分布与离散情况，从而获得有关反应动力学（例如单链DNA向双链DNA的转变）以及颗粒在溶液中稳定性的更多信息。

本文介绍一种用于检测和表征未经修饰及经DNA修饰的固体颗粒物（SPP）表面的技术。本方案适用于多种无机和生物纳米颗粒，但鉴于DNA修饰表面具有广泛的应用，我们以DNA修饰表面为例进行演示。该技术可根据纳米颗粒通过孔道系统时的易位速度（进而反映其Zeta电位），使用户能够区分纳米颗粒表面的单链与双链DNA靶标。

方案

1. 配制含吐温-20的磷酸盐缓冲液（PBST）

1. 将一个 PBS 片剂（0.01 M 磷酸盐缓冲液，0.0027 M 氯化钾，0.137 M 氯化钠，pH 7.4）溶于 200 ml 去离子水（18.2 MΩ cm）中。
2. 向 200 ml 缓冲液中加入 100 µl 吐温-20（终浓度 0.05 (v/v)%），作为表面活性剂。

2. 准备羧基聚苯乙烯颗粒标准品

1. 在80瓦功率下超声处理2分钟之前，先将校准颗粒涡旋振荡30秒，以确保颗粒的单分散性。
2. 用PBST缓冲液将校准颗粒按1:100比例稀释至浓度为1×10¹⁰ 个颗粒/mL，并涡旋振荡30秒。

3. 准备受包被链霉亲和素的微粒

1. 在80瓦功率下超声处理2分钟之前，先将颗粒涡旋振荡30秒，以确保单分散性。
2. 用PBST缓冲液将包被链霉亲和素的颗粒按1:100稀释，使最终浓度达到1×10⁹ 颗粒/mL，并涡旋振荡30秒。
   注意：通常样品体积为200 µL。例如，若需检测五种不同浓度的DNA，则应准备1 mL稀释后的包被链霉亲和素颗粒。

4. 寡核苷酸的制备

1. 用去离子水将寡核苷酸重新溶解，配制成终浓度为 100 µM 的溶液。

5. 将捕获探针（CP）DNA 添加至链霉亲和素包被的微粒

1. 在进行DNA结合之前，将包被链霉亲和素的微粒（200 µl样品体积）涡旋振荡30秒，随后在80瓦功率下超声处理2分钟。
2. 根据供应商提供的结合能力（4,352 pmol/mg），向微粒中加入适当浓度的DNA，使最终DNA浓度分别为10、20、30、40、47、95、140和210 nM。
3. 将样品涡旋振荡10秒，然后置于旋转轮上，在室温下孵育30分钟，使DNA通过链霉亲和素-生物素相互作用结合到微粒表面。
4. 在捕获DNA加入并与包被链霉亲和素的微粒孵育后，通过磁分离去除溶液中未结合的过量DNA：将样品置于磁力架上静置30分钟。
5. 小心移除上清液，注意不要扰动靠近磁铁一侧新形成的微粒聚集体，并加入等体积的新鲜PBST缓冲液替代。

6. 将互补DNA杂交至CP颗粒

1. 加入所需量的目标 DNA（过量，500 nM），以确保达到最大可能的目标结合量。
2. 将样品涡旋振荡 10 秒，并在室温下置于旋转轮上孵育 30 分钟。
3. 杂交完成后，通过磁性分离去除过量的目标 DNA：将样品置于磁力架上静置 30 分钟。
4. 移除上清液，注意不要扰动靠近磁铁一侧新形成的颗粒聚集体，并加入等体积的新鲜 PBST 缓冲液。
5. 对重复样品重复步骤 6.1 至 6.4，并将这些样品在室温下置于旋转轮上孵育 16 小时，以研究 DNA 杂交时间。

7. TRPS 设置

1. 将仪器连接至已安装软件的计算机系统。
2. 使用卡尺校准初始拉伸长度。
   1. 测量两个平行夹具外侧之间的距离。
   2. 在软件的“仪器设置”选项卡中，将测得的拉伸值输入“拉伸”字段，然后点击该选项卡下方的“校准拉伸”按钮。
3. 将适当尺寸的聚氨酯纳米孔膜横向安装到夹具上，确保纳米孔的ID编号朝上。然后使用仪器侧面的拉伸调节手柄将夹具拉伸至分析所需长度，拉伸距离应介于43至48 mm之间。
   注意：拉伸的确切数值需结合施加的电压确定，以确保校准颗粒产生的阻塞信号至少为0.3 nA。该拉伸值已在步骤7.2中输入软件，当夹具被拉伸时，软件将自动进行调整。
4. 在纳米孔下方的下部液池中加入80 µl PBST缓冲液，确保无气泡存在，以免影响测量结果。若发现气泡，应移除并更换缓冲液。
5. 将上部液池卡入到位，并向其中加入40 µl缓冲液，同样确保无气泡。若上部液池中出现气泡，可通过更换液体将其去除。
6. 当更换上部液池缓冲液后获得稳定且可重复的基线电流时，向上部液池中加入40 µl样品，并在软件界面的“数据采集”选项卡中点击“开始”进行测量。
   注意：数据采集频率为50 kHz，阻塞信号幅值下限设为0.05 nA，但可通过软件中的“分析数据”选项卡（位于“分析设置”下的“电阻性阻塞”）进行调整。
7. 将法拉第笼罩在液池系统上方，以降低测量过程中的电背景噪声。
8. 使用可变压力模块（VPM）对样品施加压力或真空。
   1. 如需施加外部压力，先将喷嘴连接至上部液池，然后旋转压力臂并卡入到位（根据需要施加正压（PRE）或负压（VAC）选择相应位置）。
   2. 通过VPM顶部的压力调节旋钮，以“cm”或“mm”刻度施加压力。按下旋钮以在“cm”刻度下施加压力，向上拉起旋钮则在“mm”刻度下施加压力。

8. 准备用于TRPS分析的样品

1. 在进行 TRPS 分析之前，将样品涡旋振荡 30 秒，并在 80 瓦功率下超声处理 2 分钟。

9. 用于Zeta分析的纳米孔校准

1. 将40 µl校准颗粒（1×10¹⁰ 颗粒/ml）加入上部液池后，在3个不同施加电压下完成一次TRPS测量（设置同第7节）。通过软件中“仪器设置”选项卡的电压标尺上的“+”和“-”按钮调节电压。
2. 确认这三个电压下获得的背景电流值分别约为140、110和80 nA。确保在中等电压下，校准颗粒产生的平均阻断幅度至少为0.3 nA。
3. 施加压力，使校准颗粒的平均半高全宽（FWHM）持续时间至少达到0.15毫秒。通过连接至可变压力模块的压力臂手动调节：根据第7.8.2步的设置说明，旋转压力臂至所需位置（压力“PRE”或真空“VAC”），直至其卡入到位，然后相应施加压力或真空。达到上述条件后，在“数据采集”选项卡中点击软件上的“开始”按钮启动运行。
4. 当检测到的颗粒数量至少达到500个（测量过程中可查看软件屏幕底部的“颗粒计数”）且运行时间超过30秒（参见屏幕底部附近的“运行时间”）时，在“数据采集”选项卡中点击“停止”以结束运行。
5. 每次使用新的纳米孔或每天开始分析前，均需按照步骤9.1–9.4所述完成一次校准运行，以对系统进行校准。

10. 运行样品

1. 以最高或第二高电压运行样品，使校准样品的基线电流尽可能接近（±10 nA）或完全相同。
   1. 当达到合适的基线电流后，将上部液池中的电解液替换为 40 µl 样品。引入样品后，信号轨迹上将出现阻断事件。点击“数据采集”选项卡中的“开始”以启动样品运行，记录至少 500 个粒子（查看信号轨迹下方的“粒子计数”），并确保运行时间不少于 30 秒（参见信号轨迹下方的“运行时间”）。
   2. 测量完成后，点击“数据采集”选项卡中的“停止”，并保存数据文件。
2. 保存文件时，按以下格式输入文件信息：“研究”指文件将保存的文件夹，“纳米孔 ID”为所用纳米孔的序列号，“部件编号”为纳米孔类型（i.e., NP150/NP200），“样品 ID”为样品名称，“校准或样品”用于标明是校准还是样品测量，“稀释倍数”用于记录样品是否经过稀释（若样品稀释了 100 倍，则输入 100），“压力”为施加于样品的压力（单位：cm — 见第 7.8 节），“电解液 ID”为样品所用缓冲液的名称，“备注”为关于样品或运行的任何个人记录。
3. 每次样品运行之间，需用 PBST 缓冲液清洗系统：多次向上部液池中加入 40 µl PBST 缓冲液，并施加不同压力（通常为 -10、-5 cm（真空）以及 5 和 10 cm（正压）），直至信号中不再出现阻断事件，以确保系统中无残留粒子，从而避免样品间的交叉污染。每个样品需进行三次重复测量，每次重复之间以及不同样品之间均需完成上述清洗步骤。

结果

图 1. 磁性纯化与 TRPS 测量过程的示意图。A) 以含有过量未结合捕获探针 DNA 的样本起始，进行磁性纯化的示例。B) TRPS 测量示例：i) 粒子通过纳米孔；ii) 粒子暂时阻塞孔道中的离子，引起电流瞬时下降，产生阻塞事件；该信号信息用于计算粒子的易位速度。请点击此处查看该图的放大版本。

在进行TRPS分析之前，从样品中去除未结合到颗粒表面的过量DNA非常重要，以避免产生“假阳性”结果。利用磁铁提取和洗涤SPPs的能力对TRPS具有显著优势。图1A). <...

讨论

Zeta电位的计算采用了一种基于校准的方法，该方法与Arjmandi et al.²¹的研究相关。通过测量粒子在穿越纳米孔时的阻塞持续时间随外加电压的变化，结合整个规则锥形孔道中的平均电场和粒子速度，来确定相关参数。 电泳迁移率是1/T（其中T为阻塞持续时间）对电压的导数，再乘以 检测区域长度l的平方。通过测量检测区域内多个参考点的平均速度，可最大限度地减小利用该方法计算Zeta电位时的误差。

孔径的校准基于在传感区域每个参考点处 1/T 与电压 V 之间的线性关系。校准粒子和样品粒子的电动力学粒子速度（分别为 和 ）与其各自的ζ电位  

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma Aldrich, UK	P4417	1片溶于200 ml去离子水中，配制成缓冲液。
Tween-20	Sigma Aldrich, UK	P1379	在PBS缓冲液中作为表面活性剂，终浓度为0.05%（v/v）
羧基化聚苯乙烯纳米颗粒	Bangs Laboratories, US	CPC200	标称直径为220 nm，原始浓度为1 × 1012 粒子/mL，比表面电荷为86 µeq/g（相当于表面电荷密度为3.2 × 1019 C/nm2）。
链霉亲和素包被的纳米颗粒	Ademtech, France	3121	批次结合能力为4,352 pmol/mg（理论DNA结合能力为188 nM），原始浓度为1.1 × 1011 粒子/mL。
生物素化寡核苷酸	Sigma Aldrich, UK	VC00001	供应商说明：反相1级纯化（0.05 Scale）；3'端修饰生物素；冻干粉末用去离子水重悬至100 µM，并按需稀释。序列：CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC GCGTGGC[Btn]3'
标准寡核苷酸	Sigma Aldrich, UK	VC00001	供应商说明：反相1级纯化（0.05 Scale）；冻干粉末用去离子水重悬至100 µM，并按需稀释。DNA靶标序列：完全互补序列 - 5'GCCACGCGTAGTGA GGTTTAACCAT3'，中间结合序列 - 5'GTAGTGAGGT3'，末端结合序列 - 5'GTTTAACCAT3'，部分互补悬垂序列 - 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'。
Izon qNano	Izon Science, NZ		系统固有压力为47 Pa
Izon 可变压力模块（VPM）	Izon Science, NZ		每“cm”压力约等于100 Pa。
聚氨酯纳米孔膜	Izon Science, NZ	NP150	分析物尺寸范围为60–480 nm，在45 mm拉伸下计算孔径为799 nm。
Magrack 6	GE Healthcare, UK	28-9489-64
超声水浴	Fisher Scientific, UK	10692353	80 瓦
涡旋振荡器	IKA, Germany	0003365000
旋转滚轴混合器	Labnet International, US	H5500-230 V