本报告描述了一种 体外 用于测定急性感染细胞胞质提取物中人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）前整合复合物（PIC）相关整合活性的检测方法。通过巢式实时定量聚合酶链式反应策略，定量分析PIC相关HIV-1 DNA整合至异源靶DNA的过程。
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摘要
摘要
HIV-1包膜蛋白与靶细胞表面的特异性受体结合，引发病毒与细胞膜的融合，随后将病毒衣壳（CA）核心释放到细胞质中。随后，病毒逆转录酶（RT）作为同名核蛋白复合物——逆转录复合物（RTC）的一部分，将病毒的单链RNA基因组转化为双链DNA拷贝（vDNA）。这导致形成另一种核蛋白复合物，称为前整合复合物（PIC），由vDNA及其相关的病毒蛋白和宿主因子组成。与PIC相关的病毒整合酶（IN）以时空调控的方式，通过两步过程介导vDNA整合入宿主染色体DNA。第一步，IN在细胞质中加工vDNA的3'端；第二步，在PIC转运至细胞核后，介导加工后的vDNA整合入染色体DNA。从急性感染HIV-1的靶细胞中分离得到的PIC具有功能活性 体外，因为它们能够将相关的病毒DNA整合到外源添加的异源靶DNA中。此类基于前整合复合物的 体外 整合实验已显著推动了对逆转录病毒整合机制的深入解析，并促进了整合酶抑制剂的发现。本文中，我们详细阐述了一种更新的HIV-1前整合复合物（PIC）检测方法，该方法采用基于巢式实时定量聚合酶链式反应（qPCR）的策略，用于测定分离所得天然PIC的体外整合活性。 体外 分离的天然前整合复合物的整合活性
引言
HIV-1 在靶细胞内的复制过程包含多个步骤，总体上可分为两个阶段：早期事件和晚期事件。早期事件始于 HIV-1 依次结合靶细胞表面受体 CD4 以及两种共受体之一（CCR5 或 CXCR4）1。随后，病毒与细胞膜发生融合，病毒衣壳（CA）核心被释放到细胞质中2。CA 核心包含病毒基因组单链 RNA（ssRNA）以及多种病毒来源和宿主来源的蛋白质。与 CA 相关的病毒蛋白包括逆转录酶（RT）和整合酶（IN），这两种酶在病毒复制早期事件中介导关键步骤。RT 和 IN 分别在核蛋白复合物——逆转录复合物（RTC）和前整合复合物（PIC）——的环境中发挥作用3,4,5,6。病毒 ssRNA 基因组末端含有位于独特序列 U5（5'端）和 U3（3'端）旁侧的末端重复（R）元件。RTC 将病毒 ssRNA 基因组转化为双链 DNA（dsDNA）拷贝（vDNA）。该逆转录过程还会复制 U5 和 U3 序列，从而在 vDNA 两端形成长末端重复序列（LTR）7,8。随后，与 PIC 相关的 IN 催化两个连续的生化反应，使 vDNA 整合到宿主染色体 DNA 中9,10,11。第一步，在细胞质中，IN 多聚体结合 vDNA 两端的 LTR12，并从每个 3'末端切除一个二核苷酸，此 3'末端加工过程在 vDNA 每个 3'末端（CAOH）生成一个羟基。接下来，PIC 转运至细胞核，IN 利用 vDNA 的 CAOH 作为亲核基团，以交错方式切割染色体 DNA 的两条链，同时将 vDNA 的两个末端共价连接至染色体 DNA 两条链上形成的磷酸二酯键。在这一链转移步骤之后，宿主细胞机制切除 vDNA 5'末端的两个未配对核苷酸，并修复整合位点连接处出现的单链缺口。因此，早期事件最终完成 HIV-1 基因组整合 DNA 拷贝（前病毒）的建立。前病毒为高效的病毒基因表达提供了适宜环境，从而启动晚期事件，包括病毒编码蛋白的表达、未成熟病毒的组装，以及出芽、释放并成熟为具有感染性的病毒颗粒13。
纯化的重组逆转录病毒整合酶具有执行 体外，对体外提供的类似长末端重复序列（LTR）的底物DNA同时具有3'端加工和链转移活性。利用此类纯化的重组IN进行的生化研究表明了vDNA整合的关键机制特征14,15,16,17。然而，与自然感染不同的是，这一 体外 生化反应不支持底物DNA两端同时整合到靶DNA中。相反，从急性感染细胞中分离出的逆转录病毒前整合复合物（PIC）能够将内源性vDNA的两端同时整合到异源靶DNA中。这促使该方法被广泛采用，并随之不断改进 I体外 使用分离的天然前整合复合物进行的体外整合（IVI）实验。
在首次报道的逆转录病毒体外整合（IVI）检测中，感染携带E. coli supF基因（位于其长末端重复序列LTR中）的重组小鼠白血病病毒（MLV）的细胞所提取的胞质成分被用作整合酶（IN）活性来源，而一种在裂解生长方面存在缺陷的突变型λ噬菌体DNA则作为外源提供的靶DNA。重组MLV的DNA拷贝成功整合至噬菌体DNA后，伴随的supF基因表达恢复了重组噬菌体形成噬菌斑的能力。然而，该实验策略操作繁琐，且以间接方式测量整合事件。为克服这些局限，研究人员开发了一种基于Southern印迹的间接末端标记检测法，通过定量内源性病毒DNA整合到外源线性化的噬菌体phiX174 DNA中的水平，来评估前整合复合物（PIC）相关的IVI活性6,7,18。尽管该方法可直接测量整合事件，但仍需相对大量的PIC制备物，这在技术上仍具挑战性。为规避此问题，后续开发了仅需少量PIC的巢式PCR检测法4,5,19。
在本报告中，我们描述了一种更新的基于巢式PCR的体外方法，旨在重现自然感染过程中由HIV-1前整合复合物（PIC）介导的整合活性。该方法采用HIV-1感染靶细胞的胞质提取物作为内源性PIC活性的来源，并通过实时定量 聚合酶链式反应（qPCR）进行检测。分离PIC及其整合活性检测的操作流程借鉴了Engelman实验室先前发表的方案20，并进行了修改。在该方法中，通过提供外源性线性靶DNA21启动与PIC相关的整合活性，整合反应产生的DNA产物经纯化后作为后续基于PCR定量分析的起始材料。在第一轮常规PCR中，使用特异性引物扩增病毒-靶DNA连接区域；在第二轮qPCR中，使用LTR特异性引物从第一轮PCR产物中特异性富集病毒DNA（vDNA）群体。有关该方法的详细描述，请参见实验方案部分。
体外 对逆转录病毒前整合复合物（PIC）的研究显著推动了我们对逆转录病毒DNA整合机制的理解，并促进了整合酶（IN）抑制剂的开发。鉴于近期对绘制HIV-1整合位点、确定病毒与宿主因子在HIV-1整合中的作用以及研发应对耐药性的新型抗病毒药物的关注日益增加，我们预计类似本报告所述的体外整合（IVI）检测方法将受到更广泛的关注和应用。这将进一步推动该方法的持续优化，从而拓展其应用范围。
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方案
1. 病毒制备
注意：为了产生高滴度的感染性 HIV-1，使用激活的树状聚合物转染试剂将感染性 HIV-1 分子克隆转染至人胚胎肾（HEK）细胞系 293T。据观察，磷酸钙转染法可获得相当的结果。
- 在生物安全二级（BSL2）实验室中，将每10 cm培养皿3 × 106个293T细胞接种于8 mL添加了10%胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中。将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中过夜培养。
- 次日，为转染每个10 cm培养皿中的细胞，将8 µg pNL4-3质粒DNA（见材料表）用不含血清和抗生素的DMEM稀释至终体积300 µL。加入80 µL转染试剂，用移液器充分混匀，在室温 孵育5–10分钟，以形成转染复合物。
- 通过抽吸去除培养皿中的培养基，并向每个培养皿中加入7 mL含血清和抗生素的新鲜DMEM。
- 向转染复合物中加入1 mL含血清和抗生素的DMEM，用移液器混匀，然后将此混合液加入细胞中。轻轻摇动培养皿，以促进转染复合物均匀分布。
- 立即将细胞转移至生物安全三级（BSL3）实验室，置于37 °C、5% CO2的培养箱中继续培养48小时。
- 用移液器收集含有病毒的组织培养上清液，转移至离心管中。以300 × g离心5分钟，沉淀细胞和碎片，随后通过0.45 µm孔径的一次性注射器滤器过滤上清液。
- 为消除该无细胞病毒制备物中可能残留的质粒DNA，使用DNase 1（20 µg/mL）在37 °C处理1小时。
- 为定量HIV-1滴度，可采用p24特异性的酶联免疫吸附测定法（ELISA），因其是一种适用于常规使用的快速且便捷的方法22。
注意：需注意p24 ELISA测定的是物理滴度（病毒颗粒数量）。 alternatively，测定病毒相关逆转录酶活性（外源性RT测定）或病毒感染性（基于TZM-bl指示细胞系的感染性测定）可特异性反映具有感染能力的病毒颗粒数量。
2. Sup-T1 细胞的病毒感染（BSL3 实验室）
- 在BSL2实验室中，将Sup-T1细胞维持在1.0 x 106 和 2.0 × 106 以每毫升细胞数计，在添加了10%热灭活胎牛血清、青霉素和链霉素的RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基中培养，每2至3天按1:2的传代比例进行传代。收集培养瓶中的Sup-T1细胞，用移液器轻轻吹打混匀，使用血细胞计数板结合台盼蓝排斥染色法测定活细胞数量。
- 准备所需数量的80 x 106 细胞（每病毒侵染）于50 mL 圆锥形离心管
- 在摆动桶转子中离心细胞 在 500 × g 和 25 ℃ 下 °C 下 5 分钟。不移除细胞培养基，将含有细胞沉淀的管子转移至 BSL3 实验室进行后续处理。小心吸除管中的细胞培养基，避免扰动细胞沉淀。
- 向管中的细胞加入适量经DNase I处理的病毒接种物，轻轻吹打混匀。对于80 x 106 细胞，请使用 30 mL 经 DNase I 处理的病毒（50 µp24等量病毒的g数
注意：分离具有功能的前整合复合物（PIC）需要以非常高的感染复数（MOI）感染靶细胞。 - 将混合物均匀分配至两个6孔组织培养板中（即 12 份 2.5 mL 分装；每项感染使用 2 块培养板。
- 对于自旋接种，将培养板放入板架中，使用摆动桶转子在480 × g和25℃下离心 °C，2 小时。
- 将接种后的细胞在37℃孵育 °C 和 5% CO2 5小时。
3. 感染细胞的收获与裂解（BSL3 实验室）
- 将每个感染样本对应的细胞从培养板中收集至一个50 mL的锥形离心管中（总体积约30 mL）。
- 在300 × g、25 °C条件下离心10分钟收集细胞，小心吸除上清液（也可使用移液器）。
- 为去除任何残留的病毒颗粒，向每份细胞沉淀中加入2 mL缓冲液K-/-（150 mM KCl、20 mM HEPES，pH 7.6、5 mM MgCl2），在300 × g、25 °C条件下离心10分钟进行洗涤。随后，在不扰动沉淀的前提下，通过抽吸或移液器小心去除上清液。
- 重复步骤3.3。
- 使用微量移液器彻底去除残留缓冲液。将每份细胞沉淀重悬于2 mL预冷的裂解缓冲液K+/+ 中（即在缓冲液K-/-中添加0.025%的皂苷、1 mM DTT和20 µg/mL抑蛋白酶肽），轻轻吹打混匀内容物，然后转移至2 mL微量离心管中。
4. 细胞质前整合复合物的制备（BSL3 实验室）
- 在室温下于旋转摇床中轻轻摇动样品 10 分钟。
- 将样品离心，转子预冷至4 °C，于1,500 × g、4℃离心 °C，4 分钟。
- 在不扰动沉淀的前提下，小心地将上清液转移至新的微量离心管中，在 16,000 x g 和 4 °C 条件下离心 °C，1 分钟。
- 小心地将上清液转移至新的微量离心管中。加入RNase A（20 mg/mL），使其终浓度为20 µg/mL (2 µL，用于2 mL PIC），室温孵育30分钟（无需摇动）。
- 加入蔗糖（60% w/v，溶于缓冲液 K 中）-/-) 至终浓度为7%，并用移液器轻轻吹打混匀。分装成等份（例如， 200 µL）于微量离心管中，液氮速冻后置于-80 °-80°C 超低温冰箱用于长期保存。
5. 体外 使用HIV-1前整合复合物（PIC）的体外整合（IVI）实验
- 通过使用定制引物 phiX174-F 和 phiX174-R 对 phiX174 质粒 DNA 进行 PCR 扩增，制备在体外整合（IVI）实验中使用的目标 DNA，获得一段 2.0 kb 的片段。
- 按照 表 1 中所述配制 PCR 反应体系。在热循环仪中进行 PCR，采用 表 2 推荐的热循环条件。使用凝胶纯化试剂盒（遵循制造商推荐的操作步骤）对 PCR 产物进行凝胶纯化，并将纯化后的目标 DNA 分装后于 -80 °C 保存，直至使用。
- 向 200 µL 的前整合复合物（PICs）分装液中加入 600 ng 目标 DNA，充分混匀，于 37 °C 孵育 45 分钟。
注意：建议设置不添加目标 DNA 或添加整合酶抑制剂（例如，拉替拉韦）的 IVI 反应作为对照反应。 - 通过加入 SDS、EDTA 和蛋白酶 K，使其终浓度分别为 0.5%、8 mM 和 0.5 mg/mL，以终止 IVI 反应。充分混匀反应体系，并于 56 °C 过夜孵育。
- 次日，采用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀法从 IVI 反应体系中纯化总 DNA。所有离心步骤均在 16,000 × g 和室温（RT）下进行。
- 向去蛋白化样品中加入等体积的酚，剧烈涡旋混匀，离心 2 分钟。小心移除上层水相，并转移至新管中。
- 重复步骤 5.5。将上层水相转移至新管中。
- 加入等体积的 1:1 酚:氯仿混合液，剧烈涡旋混匀，离心 2 分钟。将上层水相转移至新管中。
- 加入等体积氯仿，剧烈涡旋混匀，离心 2 分钟。将上层水相转移至新管中。
- 为沉淀 DNA，加入终浓度为 0.1 µg/µL 的糖原、终浓度为 0.3 M 的 3 M 醋酸钠，以及 2.5 倍体积的预冷 100% 乙醇。涡旋混匀，短暂离心收集液体，将管置于 -80 °C 过夜（O/N）。
- 次日，在 16,000 × g 和 4 °C 条件下离心 30 分钟。小心移除上清液，避免扰动沉淀。
- 向沉淀中加入 500 µL 预冷的 80% 乙醇，在 16,000 × g 和 4 °C 条件下离心 10 分钟。在室温下将 DNA 沉淀空气干燥，并完全重悬于 50 µL 无核酸酶水中。将 DNA 样品于 -20 °C 保存。
6. 用于定量PIC活性的PCR检测
注意：通过采用两组引物和两轮连续PCR的巢式PCR策略，对整合到靶DNA中的HIV-1 DNA拷贝数进行定量。
- 使用靶向病毒LTR和phiX174 DNA的引物（分别为LTR引物和phiX174引物）进行第一轮常规PCR，以扩增整合的HIV-1 DNA连接区域。
- 按照所述方法配制第一轮PCR反应体系 表3. 将除模板DNA外的所有组分配制成主混合液，分装45-µ将等量样品分装至不同的PCR管中，并加入5 µL 模板 DNA 或无核酸酶水（对照）。
- 使用推荐的热循环条件，在热循环仪中进行PCR 表 4.
- 使用跨越病毒LTR短区域的引物（LTR-R和LTR-U引物）进行第二轮qPCR，选择性扩增第一轮PCR产物中的整合vDNA序列。为确定整合vDNA拷贝数，采用已知拷贝数的10倍系列稀释液生成标准曲线例如， 100 - 108HIV-1 分子克隆的）
- 按照所述方法配制第二轮qPCR反应体系 表5. 除模板DNA外，将所有组分配制成主混合液，小心分装25 µ将 L 分装至 96 孔 PCR 反应板中适当数量的孔内，然后加入 5 µ未纯化的第一轮PCR产物或无核酸酶水（对照）各取L。所有qPCR反应均设三个重复。
- 将PCR板放入实时PCR仪中，并按照推荐的循环条件进行qPCR扩增 表6.
- 使用合适的软件分析数据。
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结果
分离HIV-1前整合复合物（PICs）
从急性感染的 Sup-T1 细胞中分离 HIV-1 PIC 的实验方案示意图如图所示 图1. 本方案源自 Engelman 所述方法 等.19,20HIV-1 PIC是由感染细胞中组装的核蛋白复合物，包含逆转录的病毒DNA（vDNA）、病毒蛋白和细胞因子19,20本报告所述方法采用 HIV-1 感染细胞的胞质提取物作为与前整合复合物（PIC）相关的整合活性来源。
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讨论
对逆转录病毒前整合复合物（PIC）的生化分析为理解逆转录病毒DNA整合机制提供了关键见解。逆转录病毒PIC整合活性的检测可通过噬斑形成实验、Southern印迹分析以及巢式qPCR实现。噬斑实验的操作流程较为繁琐，且采用间接方法检测整合事件6,7,18。基于Southern印迹的检测方法虽可直接测量整合，但需要相对大量的PIC样品6,7,18。
本报告详细阐述了一种用于检测HIV-1前整合复合物（PIC）相关整合活性的巢式qPCR策略 体外该方法的主要优势和意义在于每反应所需PIC制备物的量相对较少4,
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务和非财务利益。
致谢
本工作部分由美国国家药物滥用研究所/国立卫生研究院（NIDA/NIH）授予 CD 的资助 DA024558、DA30896、DA033892 和 DA021471 支持。我们还感谢由国家研究资源中心/国立卫生研究院（NCRR/NIH）资助的 RCMI 项目 G12MD007586、范德堡临床与转化科学奖（CTSA）项目 UL1RR024975、梅哈里转化研究中心（MeTRC）CTSA 项目 U54 RR026140、国家少数族裔健康与健康差距研究所/国立卫生研究院（NIMHD/NIH）资助的 U54 项目 MD007593，以及田纳西临床艾滋病研究中心（CFAR）项目 P30 AI110527 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
胎牛血清（FBS） | GIBCO/Invitrogen | 10437-028 | |
热灭活胎牛血清（Hi-FBS） | GIBCO/Invitrogen | 10438-026 | |
| 杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 培养基（DMEM） | GIBCO/Invitrogen | 11995-065 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 培养基 | GIBCO/Invitrogen | 11875-093 | |
磷酸盐缓冲液（PBS）（1×） | GIBCO/Invitrogen | 20012-027 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%） | GIBCO/Invitrogen | 25200-056 | |
| 青霉素-链霉素溶液（100倍浓缩） | Cellgro/Mediatech | 30-002-CI | |
| HEK293T 细胞（293T） | 美国典型培养物保藏中心 (ATCC) | CRL-3216 | |
| HIV-1 前病毒分子克隆 pNL4-3 | 美国国立卫生研究院艾滋病研究与参考试剂项目 | 114 | |
| PolyFect 转染试剂 | Qiagen | 301107 | |
DNase 1 | Calbiochem/Merckmillipore | 260913 | |
Sup-T1 细胞 | 美国典型培养物保藏中心 (ATCC) | CRL-1942 | |
HEPES pH 7.2 - 7.5 （即用型溶液） | GIBCO/Invitrogen | 15630-080 | |
| 氯化钾（KCl）溶液 | Sigma-Aldrich | 60142 | |
| 氯化镁（MgCl₂）2）溶液 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 抑肽酶 | Sigma-Aldrich | A6106 | |
| 皂苷元 | Sigma-Aldrich | D141 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091-021 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| phiX174 复制型 1 DNA | 普洛麦格 | D1531 | |
| PhiX174-F 引物： 5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’ PhiX174-R 引物： 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’ | Invitrogen 和/或 IDT-DNA | ||
| dNTP混合物 | 普洛麦格 | U1515 | |
| Go Taq DNA聚合酶 | Promega | M3005 | |
| Qiaquick 凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28706 | |
| 超纯蒸馏水 | Invitrogen | 10977-015 | |
Tris-EDTA（TE）缓冲液（100倍浓缩） | Sigma-Aldrich | T9285 | |
十二烷基硫酸钠（SDS） | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| 乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）溶液，0.5 M，pH 8.0 | Sigma-Aldrich | E7889 | |
蛋白酶K（20 mg/mL即用型溶液） | Qiagen | 19131 | |
| 苯酚（用10平衡） 毫摩尔 Tris HCl，pH 8.0 和 1 mM EDTA | Sigma-Aldrich | P4557 | |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | 288306 | |
糖原（5 mg/mL 溶液） | Ambion/Invitrogen | AM9510 | |
乙酸钠（3 M，pH 5.2） | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023 | |
第一轮LTR引物: 5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’ 第一轮 phiX174 引物: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’ | Invitrogen 和/或 IDT-DNA | --- | |
第二轮 LTR-R 引物: 5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’ 第二轮LTR-U引物: 5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’ 第二轮Taqman探针: 5’-6- FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/6-TAMRA/-3’ | Invitrogen 和/或 IDT-DNA | --- | |
| iQ Supermix | 伯乐（Bio-Rad） | 170-8862 |
参考文献
- Sattentau, Q. J., Weiss, R. A. The CD4 antigen: physiological ligand and HIV receptor. Cell. 52 (5), 631-633 (1988).
- Wilen, C. B., Tilton, J. C., Doms, R. W. Molecular mechanisms of HIV entry. Adv Exp Med Biol. 726, 223-242 (2012).
- Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E. A nucleoprotein complex mediates the integration of retroviral DNA. Genes Dev. 3 (4), 469-478 (1989).
- Bukrinsky, M. I., Sharova, N., Dempsey, M. P., et al. Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. Proc Natl Acad Sci. 9 (14), 6580-6584 (1992).
- Hansen, M. S., Smith, G. J. 3rd, Kafri, T., Molteni, V., Siegel, J. S., Bushman, F. D. Integration complexes derived from HIV vectors for rapid assays in vitro. Nature biotechnol. 17 (6), 578-582 (1999).
- Farnet, C. M., Haseltine, W. A. Integration of human immunodeficiency virus type 1 DNA in vitro. Proc Natl Acad Sci. 87 (11), 4164-4168 (1990).
- Fujiwara, T., Mizuuchi, K. Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate. Cell. 54 (4), 497-504 (1988).
- Brown, P. O., Bowerman, B., Varmus, H. E., Bishop, J. M. Correct integration of retroviral DNA in vitro. Cell. 49 (3), 347-356 (1987).
- Lewinski, M. K., Bushman, F. D. Retroviral DNA integration--mechanism and consequences. Adv Genet. 55, 147-181 (2005).
- Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
- Goff, S. P. Genetics of retroviral integration. Ann rev gen. 26, 527-544 (1992).
- Panganiban, A. T., Temin, H. M. The terminal nucleotides of retrovirus DNA are required for integration but not virus production. Nature. 306 (5939), 155-160 (1983).
- Bieniasz, P. D. The cell biology of HIV-1 virion genesis. Cell host microbe. 5 (6), 550-558 (2009).
- Sherman, P. A., Fyfe, J. A. Human immunodeficiency virus integration protein expressed in Escherichia coli possesses selective DNA cleaving activity. Proc Natl Acad Sci. 87 (13), 5119-5123 (1990).
- Katzman, M., Katz, R. A., Skalka, A. M., Leis, J. The avian retroviral integration protein cleaves the terminal sequences of linear viral DNA at the in vivo sites of integration. J Virol. 63 (12), 5319-5327 (1989).
- Craigie, R., Mizuuchi, K., Bushman, F. D., Engelman, A. A rapid in vitro assay for HIV DNA integration. Nucl acid res. 19 (10), 2729-2734 (1991).
- Bushman, F. D., Craigie, R. Activities of human immunodeficiency virus (HIV) integration protein in vitro: specific cleavage and integration of HIV DNA. Proc Natl Acad Sci. 88 (4), 1339-1343 (1991).
- Pauza, C. D. Two bases are deleted from the termini of HIV-1 linear DNA during integrative recombination. Virology. 179 (2), 886-889 (1990).
- Engelman, A. Isolation and analysis of HIV-1 preintegration complexes. Meth Mol Biol. 485, 135-149 (2009).
- Engelman, A., Oztop, I., Vandegraaff, N., Raghavendra, N. K. Quantitative analysis of HIV-1 preintegration complexes. Methods. 47 (4), 283-290 (2009).
- Addai, A. B., Pandhare, J., Paromov, V., Mantri, C. K., Pratap, S., Dash, C. Cocaine modulates HIV-1 integration in primary CD4+ T cells: implications in HIV-1 pathogenesis in drug-abusing patients. J Leuk Biol. 97 (4), 779-790 (2015).
- Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12 (4), 288-293 (1997).
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