本报告描述了一种 体外 用于测定急性感染细胞胞质提取物中人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）前整合复合物（PIC）相关整合活性的检测方法。通过巢式实时定量聚合酶链式反应策略，定量分析PIC相关HIV-1 DNA整合至异源靶DNA的过程。
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本文内容
摘要
摘要
HIV-1包膜蛋白与靶细胞表面的特异性受体结合，引发病毒与细胞膜的融合，随后将病毒衣壳（CA）核心释放到细胞质中。随后，病毒逆转录酶（RT）作为同名核蛋白复合物——逆转录复合物（RTC）的一部分，将病毒的单链RNA基因组转化为双链DNA拷贝（vDNA）。这导致形成另一种核蛋白复合物，称为前整合复合物（PIC），由vDNA及其相关的病毒蛋白和宿主因子组成。与PIC相关的病毒整合酶（IN）以时空调控的方式，通过两步过程介导vDNA整合入宿主染色体DNA。第一步，IN在细胞质中加工vDNA的3'端；第二步，在PIC转运至细胞核后，介导加工后的vDNA整合入染色体DNA。从急性感染HIV-1的靶细胞中分离得到的PIC具有功能活性 体外，因为它们能够将相关的病毒DNA整合到外源添加的异源靶DNA中。此类基于前整合复合物的 体外 整合实验已显著推动了对逆转录病毒整合机制的深入解析，并促进了整合酶抑制剂的发现。本文中，我们详细阐述了一种更新的HIV-1前整合复合物（PIC）检测方法，该方法采用基于巢式实时定量聚合酶链式反应（qPCR）的策略，用于测定分离所得天然PIC的体外整合活性。 体外 分离的天然前整合复合物的整合活性
引言
HIV-1 在靶细胞内的复制过程包含多个步骤，总体上可分为两个阶段：早期事件和晚期事件。早期事件始于 HIV-1 依次结合靶细胞表面受体 CD4 以及两种共受体之一（CCR5 或 CXCR4）1。随后，病毒与细胞膜发生融合，病毒衣壳（CA）核心被释放到细胞质中2。CA 核心包含病毒基因组单链 RNA（ssRNA）以及多种病毒来源和宿主来源的蛋白质。与 CA 相关的病毒蛋白包括逆转录酶（RT）和整合酶（IN），这两种酶在病毒复制早期事件中介导关键步骤。RT 和 IN 分别在核蛋白复合物——逆转录复合物（RTC）和前整合复合物（PIC）——的环境中发挥作用3,4,5,6。病毒 ssRNA 基因组末端含有位于独特序列 U5（5'端）和 U3（3'端）旁侧的末端重复（R）元件。RTC 将病毒 ssRNA 基因组转化为双链 DNA（dsDNA）拷贝（vDNA）。该逆转录过程还会复制 U5 和 U3 序列，从而在 vDNA 两端形成长末端重复序列（LTR）7,8。随后，与 PIC....
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方案
1. 病毒制备
注意：为了产生高滴度的感染性 HIV-1，使用激活的树状聚合物转染试剂将感染性 HIV-1 分子克隆转染至人胚胎肾（HEK）细胞系 293T。据观察，磷酸钙转染法可获得相当的结果。
- 在生物安全二级（BSL2）实验室中，将每10 cm培养皿3 × 106个293T细胞接种于8 mL添加了10%胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中。将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中过夜培养。
- 次日，为转染每个10 cm培养皿中的细胞，将8 µg pNL4-3质粒DNA（见材料表）用不含血清和抗生素的DMEM稀释至终体积300 µL。加入80 µL转染试剂，用移液器充分混匀，在室温 孵育5–10分钟，以形成转染复合物。
- 通过抽吸去除培养皿中的培养基，并向每个培养皿中加入7 mL含血清和抗生素的新鲜DMEM。
- 向转染复合物中加入1 mL含血清和抗生素的DMEM，用移液器混匀，然后将此混合液加入细胞中。轻轻摇动培养皿，以促进转染复合物均匀分布。
- 立即将细胞转移至生物安全三级（BSL3）实验室，置于37 °C、5% CO2的培养箱中继续培养48小时。
- 用移液器收集含有病毒的组织培养上清液，转移至离心管中。以300 ....
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结果
分离HIV-1前整合复合物（PICs）
从急性感染的 Sup-T1 细胞中分离 HIV-1 前整合复合物（PIC）所用方案的示意图如图所示 图1该方案源自Engelman所述方法。 等.19,20HIV-1 前病毒整合复合物（PICs）是在感染细胞内组装的核蛋白复合物，由逆转录生成的病毒DNA（vDNA）、病毒蛋白和宿主细胞因子组成。19,20本报告所述方法采用 HIV-1 感染细胞的胞质提取物作为与前整合复合物（PIC）相关的整合活性来源。
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讨论
对逆转录病毒前整合复合物（PIC）的生化分析为理解逆转录病毒DNA整合机制提供了关键见解。逆转录病毒PIC整合活性的检测可通过噬斑形成实验、Southern印迹分析以及巢式qPCR实现。噬斑实验的操作流程较为繁琐，且采用间接方法检测整合事件6,7,18。基于Southern印迹的检测方法虽可直接测量整合，但需要相对大量的PIC样品6,7,18。
本报告详细阐述了一种用于检测HIV-1前整合复合物（PIC）相关整合活性的巢式qPCR策略 体外该方法的主要优势和意义在于每反应所需PIC制备物的量相对较少4,
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务和非财务利益。
致谢
本工作部分由美国国家药物滥用研究所/国立卫生研究院（NIDA/NIH）授予 CD 的资助 DA024558、DA30896、DA033892 和 DA021471 支持。我们还感谢由国家研究资源中心/国立卫生研究院（NCRR/NIH）资助的 RCMI 项目 G12MD007586、范德堡临床与转化科学奖（CTSA）项目 UL1RR024975、梅哈里转化研究中心（MeTRC）CTSA 项目 U54 RR026140、国家少数族裔健康与健康差距研究所/国立卫生研究院（NIMHD/NIH）资助的 U54 项目 MD007593，以及田纳西临床艾滋病研究中心（CFAR）项目 P30 AI110527 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
胎牛血清（FBS） | GIBCO/Invitrogen | 10437-028 | |
热灭活胎牛血清（Hi-FBS） | GIBCO/Invitrogen | 10438-026 | |
| 杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 培养基（DMEM） | GIBCO/Invitrogen | 11995-065 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 培养基 | GIBCO/Invitrogen | 11875-093 | |
磷酸盐缓冲液（PBS）（1×） | GIBCO/Invitrogen | 20012-027 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%） | GIBCO/Invitrogen | 25200-056 | |
| 青霉素-链霉素溶液（100倍浓缩） | Cellgro/Mediatech | 30-002-CI | |
| HEK293T 细胞（293T） | 美国典型培养物保藏中心 (ATCC) | CRL-3216 | |
| HIV-1 前病毒分子克隆 pNL4-3 | 美国国立卫生研究院艾滋病研究与参考试剂项目 | 114 | |
| PolyFect 转染试剂 | Qiagen | 301107 | |
DNase 1 | Calbiochem/Merckmillipore | 260913 | |
Sup-T1 细胞 | 美国典型培养物保藏中心 (ATCC) | CRL-1942 | |
HEPES pH 7.2 - 7.5 （即用型溶液） | GIBCO/Invitrogen | 15630-080 | |
| 氯化钾（KCl）溶液 | Sigma-Aldrich | 60142 | |
| 氯化镁（MgCl₂）2）溶液 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 抑肽酶 | Sigma-Aldrich | A6106 | |
| 皂苷元 | Sigma-Aldrich | D141 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091-021 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| phiX174 复制型 1 DNA | 普洛麦格 | D1531 | |
| PhiX174-F 引物： 5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’ PhiX174-R 引物： 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’ | Invitrogen 和/或 IDT-DNA | ||
| dNTP混合物 | 普洛麦格 | U1515 | |
| Go Taq DNA聚合酶 | Promega | M3005 | |
| Qiaquick 凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28706 | |
| 超纯蒸馏水 | Invitrogen | 10977-015 | |
Tris-EDTA（TE）缓冲液（100倍浓缩） | Sigma-Aldrich | T9285 | |
十二烷基硫酸钠（SDS） | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| 乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）溶液，0.5 M，pH 8.0 | Sigma-Aldrich | E7889 | |
蛋白酶K（20 mg/mL即用型溶液） | Qiagen | 19131 | |
| 苯酚（用10平衡） 毫摩尔 Tris HCl，pH 8.0 和 1 mM EDTA | Sigma-Aldrich | P4557 | |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | 288306 | |
糖原（5 mg/mL 溶液） | Ambion/Invitrogen | AM9510 | |
乙酸钠（3 M，pH 5.2） | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023 | |
第一轮LTR引物: 5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’ 第一轮 phiX174 引物: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’ | Invitrogen 和/或 IDT-DNA | --- | |
第二轮 LTR-R 引物: 5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’ 第二轮LTR-U引物: 5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’ 第二轮Taqman探针: 5’-6- FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/6-TAMRA/-3’ | Invitrogen 和/或 IDT-DNA | --- | |
| iQ Supermix | 伯乐（Bio-Rad） | 170-8862 |
参考文献
- Sattentau, Q. J., Weiss, R. A. The CD4 antigen: physiological ligand and HIV receptor. Cell. 52 (5), 631-633 (1988).
- Wilen, C. B., Tilton, J. C., Doms, R. W. Molecular mechanisms of HIV entry. Adv Exp Med Biol. 726, 223-242 (2012).
- Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E.
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