此处以96孔板形式进行酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的孢子形成实验。
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本文内容
摘要
摘要
在营养胁迫条件下，Saccharomyces cerevisiae 会经历一种称为孢子形成的配子发生过程。当二倍体酵母细胞缺乏氮和碳源时，便会启动孢子形成过程。该过程包括减数分裂以及随后的孢子形成，其中单倍体细胞核被包裹成具有环境抗性的孢子。我们已建立了在96孔板中高效进行芽殖酵母孢子形成的方法，以提高筛选酵母孢子形成表型的通量。这些方法可与含有需要营养筛选质粒的酵母筛选兼容，前提是使用适当的最低培养基；也可与基因组发生改变的酵母筛选兼容，前提是采用富集性预孢子形成培养条件。我们发现，在本方法中，孢子形成期间的通气至关重要，因此设计了确保充分通气的技术，且该技术适用于96孔板的格式。尽管这些方法无法达到传统大体积摇瓶实验中典型的约80%的孢子形成率，但在小体积多孔板中可稳定实现约50–60%的孢子形成率。
引言
芽殖酵母的孢子形成研究有助于深入了解生物学的多个方面，包括减数分裂过程中染色体分离的调控1、遗传重组的机制2、细胞信号传导对发育的调控3、营养对发育的调控4、发育过程中的转录调控5，以及孢子形成的分析6。孢子形成包含一种新型的细胞分裂事件，涉及在母细胞内形成新的膜区室，随后沉积保护性的孢子壁6。这些针对孢子形成细胞的研究通常利用快速孢子形成的酵母菌株SK1，该菌株可在约24小时内以相对高效的方式完成孢子形成过程7,8。尽管已有文献描述了芽殖酵母孢子形成条件的优化方法9-13，但这些实验多是在固体培养基或较大规模的液体培养（使用试管或烧瓶）中进行的。
本文介绍了一种在96孔板中进行酵母孢子形成的实验方法。我们发现，该方法中通气对于实现同步且高效的孢子形成至关重要，因此设计了相应的技术以确保在小体积多孔板格式下获得充分的孢子形成效果。采用96孔板进行孢子形成实验，可利用适用于多孔板格式的高通量技术及试剂对细胞进行筛选，例如使用分段文库筛选高拷贝抑制子14-16。
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方案
1. 孢子形成前的准备
注意：本实验方案中所述培养基采用标准配方和方法制备13,17。表1列出了本实验方案中所用各种培养基每升的配制成分。
<....| 胰蛋白胨 | 酵母提取物 | 琼脂粉 | 葡萄糖 | 乙酸钾 | 甘油 | ddH2O | |
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结果
为评估本方案，将多孔板中孢子形成的效率（如上所述）与在锥形瓶中使用较大体积培养物进行孢子形成的结果进行了比较（表2）。使用多孔板的孢子形成效率未达到在锥形瓶中培养时所观察到的高水平，后者通常可实现约80%的效率。然而，在多孔板中通过适当通气（使用玻璃珠或搅拌子）进行孢子形成，可达到超过50%的足够效率，其中使用5 mm × 2 mm搅拌子时效果最佳，效率达66%。此处展示了两种不同菌株（野生型和smk1Δ）的代表性孢子形成结果（图1）。这些细胞在孢子形成培养基中培养36小时后进行观察，并采用96孔玻璃底板进行成像。
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讨论
本文介绍了一种在96孔板中进行SK1酵母孢子形成的实验方案。充分通气是实现高效孢子形成的关键，因此每个孔中必须使用搅拌子或玻璃珠。若在摇床培养箱中使用96孔板进行孢子形成，但未在孔中加入玻璃珠或搅拌子，则细胞无法高效形成孢子。与在30 °C静置条件下相比，未使用玻璃珠或搅拌子的摇床培养仅表现出孢子形成效率的轻微提升（表1；摇床中为17%，静置于搅拌板上为10%）。同样，使用7 mm搅拌子时孢子形成效率也较低（28%），可能是因为相邻孔中的搅拌子相互干扰，导致培养物通气不充分。本方案所描述的条件适用于常用于研究孢子形成的、能够同步且高效孢子形成的SK1酵母菌株7,8；若采用其他酵母菌株并使用本方案，应在开展大规模筛选前先评估其孢子形成效率。
尽管使用5 mm × 2 mm搅拌子比使用玻璃珠可获得略高的产孢效率（使用5 mm × 2 mm搅拌子为66%，使用玻璃珠为56%），但为每个孔配备搅拌子所需的成本可能过高。使用玻璃珠所达到的产孢效率提供了一种低成本方案，可在96孔多孔板格式中实现高通量筛选所需的足够通气效果16<.......
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披露
作者无竞争性财务利益。
致谢
本研究工作获得了马萨诸塞大学波士顿分校Joseph P. Healey基金（L.S.H.）以及美国国立卫生研究院（NIH）R15 GM86805项目（L.S.H.）的资助。S.M.P. 部分受马萨诸塞大学波士顿分校赛诺菲-健赞奖学金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Nunc 1.3 ml 深孔板 | ThermoScientific | 260251 | 用于孢子形成 |
| Nunc 2.0 ml 深孔板 | ThermoScientific | 278743 | 用于孢子形成前培养，步骤 1.2.3 |
| 3 mm 玻璃珠 | Fisher | 11-312A | 用于孢子形成 |
| 5 mm × 2 mm 搅拌子，每包 12 个 | Fisher | 14-511-82 | 用于孢子形成 |
| 96 孔蛙跳式移液器 | V&P Scientific | VP407 | 步骤 1.2 所需 |
| 文库复制器 | V&P Scientific | VP381 | 步骤 1.2 所需；需与蛙跳式移液器配合使用 |
| 矩形培养皿 | ThermoScientific | 264728 | 步骤 1.2 所需 |
| 胰蛋白胨 | BD | 211677 | 培养基所需 |
| 酵母提取物 | BD | 212750 | 培养基所需 |
| 琼脂粉 | BD | 212750 | 培养基所需 |
| 葡萄糖 | Fisher | D16-3 | 培养基所需 |
| 乙酸钾 | Fisher | P171-500 | 培养基所需 |
| 甘油 | Fisher | G33-500 | 培养基所需 |
| 黑色 96 孔玻璃底板 | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | 步骤 2.4 所需 |
参考文献
- Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
- Keeney, S., Lange, J., Mohibullah, N. Self-organization of meiotic recombination initiati....
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重印与许可
