高效实现Saccharomyces cerevisiae在96孔板中的孢子形成

摘要

此处以96孔板形式进行酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的孢子形成实验。

摘要

在营养胁迫条件下，Saccharomyces cerevisiae 会经历一种称为孢子形成的配子发生过程。当二倍体酵母细胞缺乏氮和碳源时，便会启动孢子形成过程。该过程包括减数分裂以及随后的孢子形成，其中单倍体细胞核被包裹成具有环境抗性的孢子。我们已建立了在96孔板中高效进行芽殖酵母孢子形成的方法，以提高筛选酵母孢子形成表型的通量。这些方法可与含有需要营养筛选质粒的酵母筛选兼容，前提是使用适当的最低培养基；也可与基因组发生改变的酵母筛选兼容，前提是采用富集性预孢子形成培养条件。我们发现，在本方法中，孢子形成期间的通气至关重要，因此设计了确保充分通气的技术，且该技术适用于96孔板的格式。尽管这些方法无法达到传统大体积摇瓶实验中典型的约80%的孢子形成率，但在小体积多孔板中可稳定实现约50–60%的孢子形成率。

引言

芽殖酵母的孢子形成研究有助于深入了解生物学的多个方面，包括减数分裂过程中染色体分离的调控¹、遗传重组的机制²、细胞信号传导对发育的调控³、营养对发育的调控⁴、发育过程中的转录调控⁵，以及孢子形成的分析⁶。孢子形成包含一种新型的细胞分裂事件，涉及在母细胞内形成新的膜区室，随后沉积保护性的孢子壁⁶。这些针对孢子形成细胞的研究通常利用快速孢子形成的酵母菌株SK1，该菌株可在约24小时内以相对高效的方式完成孢子形成过程^7,8。尽管已有文献描述了芽殖酵母孢子形成条件的优化方法^9-13，但这些实验多是在固体培养基或较大规模的液体培养（使用试管或烧瓶）中进行的。

本文介绍了一种在96孔板中进行酵母孢子形成的实验方法。我们发现，该方法中通气对于实现同步且高效的孢子形成至关重要，因此设计了相应的技术以确保在小体积多孔板格式下获得充分的孢子形成效果。采用96孔板进行孢子形成实验，可利用适用于多孔板格式的高通量技术及试剂对细胞进行筛选，例如使用分段文库筛选高拷贝抑制子^14-16。

方案

1. 孢子形成前的准备

注意：本实验方案中所述培养基采用标准配方和方法制备^13,17。表1列出了本实验方案中所用各种培养基每升的配制成分。

	胰蛋白胨	酵母提取物	琼脂粉	葡萄糖	乙酸钾	甘油	ddH2O
YPG 平板	20 g	10 g	20 g	-	-	30 ml	970 ml
YPD 平板	20 g	10 g	20 g	20 g	-	-	1,000 ml
YPD 液体培养基	20 g	10 g	-	20 g	-	-	1,000 ml
YPA 液体培养基	20 g	10 g	-	-	20 g	-	1,000 ml
产孢培养基	-	-	-	-	10 g	-	1,000 ml

表1：培养基配方。 数量按每升培养基给出。培养基成分的具体信息见材料表。

1. 若所有孢子形成细胞的基因型相同，请遵循以下步骤：
   1. 将待用的酵母菌株解冻并划线接种至YPG（YPGlycerol）平板上，在30 °C条件下培养12–16小时。需要注意的是，SK1细胞已处于易于孢子形成的生理状态，因此SK1菌株不应在YPG平板上放置过久，否则可能在平板上直接发生孢子形成。
      注意：建议使用在YPG平板上新鲜复苏的菌株，因为利用甘油作为碳源需要氧化磷酸化，从而筛选出具有功能性线粒体DNA的细胞。SK1细胞容易丢失功能性线粒体DNA而成为“小菌落”（petites）。功能性线粒体DNA是孢子形成所必需的。
   2. 从YPG平板上挑取酵母菌落划线接种至YPD（YPDextrose）平板，以获得单菌落。在30 °C条件下于YPD平板上培养24–28小时。
   3. 在YPD固体培养基上培养约36–48小时后，从YPD平板上挑取单菌落接种至25 ml YPD液体培养基中。将培养物培养至细胞OD₆₀₀约为4.0至7.0。该步骤在30 °C摇床培养箱中过夜进行，振荡速度为220 rpm。
   4. 从YPD培养物中取适量细胞，接种至YPA（YPAcetate）液体培养基中，每份用于第2节的96孔板需准备1,000 ml YPA培养物，初始OD₆₀₀ = 0.1。将酵母在30 °C摇床培养箱中（220 rpm振荡）培养，直至培养物OD₆₀₀达到1.3至1.5之间。
      注意：每块需在第2节中筛选的96孔板应接种100 ml YPA培养物。例如，若需筛选四块96孔板，则需要400 ml YPA培养物。YPA培养物起始体积应多准备10%，以补偿蒸发导致的体积损失。通常细胞达到目标OD₆₀₀需要12–16小时，具体时间可能因酵母菌株基因型不同而有所差异。YPA为孢子形成前培养基，乙酸盐预培养有助于诱导高效且同步孢子形成所需基因（如IME1）的表达⁶。
   5. 将YPA培养物在台式离心机中以1,800 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。用相当于培养物体积一半的无菌去离子水洗涤细胞一次。再次离心后弃去上清液，将细胞重悬于等体积的孢子形成培养基中。继续进行第2节操作。
2. 若用于孢子形成的细胞具有不同基因型（即，转化了不同质粒或携带不同突变，通常以冷冻保存菌种形式获得和储存），需先将不同基因型的细胞排列至96孔板格式，然后遵循以下步骤：
   1. 使用无菌的96针接种器（frogger），将解冻后的冷冻菌种从96孔板转移至YPG固体培养基上，在30 °C条件下过夜培养。
   2. 使用无菌的96针接种器，将YPG固体培养基上的细胞转移至YPD固体培养基或选择性固体培养基上（即，若细胞含有需要筛选的质粒，则使用缺乏特定氨基酸的合成基本培养基）。在30 °C条件下培养，直至各菌株形成菌落，通常YPD培养基上需1天，若使用选择性培养基则通常需2天。
   3. 向96深孔2 ml板的每孔中加入1.2 ml YPD液体培养基或选择性液体培养基。使用接种器将固体培养基上的细胞转移至液体培养基中，用塑料盖密封（用胶带固定），在30 °C摇床中以220 rpm振荡过夜培养。
      注意：为尽量减少污染，可使用矩形培养皿的塑料盖覆盖培养板，并用胶带固定，以保证最小程度限制空气流通。
   4. 使用配备可适配96孔板转子的水平转子离心机，在1,800 × g条件下离心5分钟。倾去上清液，向每孔加入500 µl YPA培养基，并将细胞沉淀重悬于YPA中。用塑料盖（用胶带固定）密封。
   5. 将细胞在30 °C摇床培养箱中以220 rpm振荡培养15小时。继续进行第2节操作。

2. 96 孔板格式中的产孢细胞

1. 在每孔容量为 1.3 ml 的 96 孔板的每个孔中加入一个 3 mm 无菌实心玻璃珠或一根无菌 5 mm × 2 mm 磁力搅拌子。（关于使用玻璃珠还是磁力搅拌子的讨论，请参见下方的代表性结果。）
2. 如果所有待筛选细胞具有相同基因型，则进入步骤 2.2.1；如果待筛选细胞具有不同基因型，则进入步骤 2.2.2。
   1. 取步骤 1.1.5 中的细胞，将 500 µl 细胞悬液连同培养基分装至 96 孔板的各个孔中。用胶带固定塑料盖盖住孔板。进入步骤 2.3。
   2. 将来自 1.2.4 步骤中 YPA 培养基中的细胞，使用可适配 96 孔板的摆动转子离心机在 1,800 × g 条件下离心 5 分钟。倾去培养基。向每个孔中加入 500 µl 孢子形成培养基，并将沉淀的细胞重新悬浮于该培养基中。用胶带固定塑料盖盖住孔板。进入步骤 2.3。
3. 若使用玻璃珠，将样品置于 30 °C 摇床培养箱中，以 220 rpm 振荡进行孢子形成；若使用磁力搅拌子，则将样品置于 30 °C 培养箱内的搅拌台上进行孢子形成。
   注意：只要所有搅拌子均能充分运动且培养液得到良好通气，磁力搅拌的具体转速并不关键。
4. 为监测孢子形成过程的进展，从正在形成孢子的培养物中取样进行观察。取 6 µl 孢子形成培养物中的细胞加入到 96 孔盖玻片板中含 24 µl 孢子形成培养基的孔中（1:5 稀释）。静置 5 分钟使细胞沉降，随后使用倒置显微镜观察细胞。
   注意：在野生型 SK1 细胞中，致密成熟的孢子通常在转入孢子形成培养基后 36 小时形成。可通过荧光标记物（例如核标记物 i.e., Htb2-mCherry¹⁸）观察减数分裂进程，或使用前孢子膜标记物（例如 i.e., G20¹⁹）观察孢子形态发生过程，以显微镜监测孢子形成进程。此外，大约在转入孢子形成培养基 12 小时后，可通过 Nomarski DIC 显微镜观察到折光性强的孢子。

结果

为评估本方案，将多孔板中孢子形成细胞的效率（如上所述）与在烧瓶中使用较大体积进行孢子形成的细胞效率进行了比较（表2）。使用多孔板未能达到在烧瓶中孢子形成所观察到的高效率，后者通常可达到约80%的效率。在多孔板中进行孢子形成时，若提供充分通气（通过玻璃珠或搅拌子实现），可获得超过50%的足够孢子形成效率，其中使用5 mm × 2 mm搅拌子时效果最佳，效率达66%。此处展示了两种不同菌株（野生型和smk1Δ）的代表性孢子形成结果（图1）。这些细胞在孢子形成培养基中培养36小时后进行观察，并使用96孔玻璃底板进行可视化。

讨论

本文介绍了一种在96孔板中进行SK1酵母孢子形成的实验方案。充分通气是实现高效孢子形成的关键，因此每个孔中必须使用搅拌子或玻璃珠。若在摇床培养箱中使用96孔板进行孢子形成，但未在孔中加入玻璃珠或搅拌子，则细胞无法高效形成孢子。与在30 °C静置条件下相比，未使用玻璃珠或搅拌子的摇床培养仅表现出孢子形成效率的轻微提升（表1；摇床中为17%，静置于搅拌板上为10%）。同样，使用7 mm搅拌子时孢子形成效率也较低（28%），可能是因为相邻孔中的搅拌子相互干扰，导致培养物通气不充分。本方案所描述的条件适用于常用于研究孢子形成的、能够同步且高效孢子形成的SK1酵母菌株^7,8；若采用其他酵母菌株并使用本方案，应在开展大规模筛选前先评估其孢子形成效率。

尽管使用5 mm × 2 mm搅拌子比使用玻璃珠可获得略高的产孢效率（使用5 mm × 2 mm搅拌子为66%，使用玻璃珠为56%），但为每个孔配备搅拌子所需的成本可能过高。使用玻璃珠所达到的产孢效率提供了一种低成本方案，可在96孔多孔板格式中实现高通量筛选所需的足够通气效果^16<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Nunc 1.3 ml 深孔板	ThermoScientific	260251	用于孢子形成
Nunc 2.0 ml 深孔板	ThermoScientific	278743	用于孢子形成前培养，步骤 1.2.3
3 mm 玻璃珠	Fisher	11-312A	用于孢子形成
5 mm × 2 mm 搅拌子，每包 12 个	Fisher	14-511-82	用于孢子形成
96 孔蛙跳式移液器	V&P Scientific	VP407	步骤 1.2 所需
文库复制器	V&P Scientific	VP381	步骤 1.2 所需；需与蛙跳式移液器配合使用
矩形培养皿	ThermoScientific	264728	步骤 1.2 所需
胰蛋白胨	BD	211677	培养基所需
酵母提取物	BD	212750	培养基所需
琼脂粉	BD	212750	培养基所需
葡萄糖	Fisher	D16-3	培养基所需
乙酸钾	Fisher	P171-500	培养基所需
甘油	Fisher	G33-500	培养基所需
黑色 96 孔玻璃底板	MatTek	PBK96G-1.5.5-F	步骤 2.4 所需