一个 体外 利用阻抗谱技术构建血脑屏障模型：聚焦T细胞与内皮细胞的相互作用

摘要

此处，我们描述了一种 体外 利用阻抗细胞谱技术研究活化T细胞与内皮细胞相互作用对血脑屏障完整性及通透性影响的小鼠模型

摘要

血脑屏障（BBB）的破坏是多发性硬化症（MS）及其动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）等自身免疫性疾病发展过程中的关键步骤。该过程的特征是活化的T细胞穿过构成血脑屏障主要成分的脑内皮细胞（ECs）。然而，此类T细胞与脑EC相互作用后对EC功能的影响在很大程度上仍不清楚。本文介绍了一种可用于随时间评估原代小鼠脑微血管内皮细胞（MBMEC）功能及屏障完整性的检测方法。该方法利用阻抗细胞谱技术——一种研究内皮细胞单层完整性和通透性的有力工具，通过测量跨内皮电阻（TEER）和细胞层电容（Ccl）的变化来实现。实验结果显示，与EC直接接触时，经刺激的T细胞而非初始T细胞可诱导EC单层功能障碍，表现为TEER下降和Ccl升高。该检测方法能够连续、自动地记录EC单层完整性的变化，其灵敏度足以区分不同强度的刺激以及T细胞活化的不同水平，并可用于研究多种物质（如抗体、药理学试剂和细胞因子）对T细胞-EC相互作用进行靶向调控后的生物学效应。该技术也可用于内皮细胞屏障完整性 体外 T细胞跨内皮迁移实验。这些应用使其成为研究生理和病理生理条件下血脑屏障特性的多功能工具。

引言

血脑屏障将体循环与中枢神经系统（CNS）分隔开来^1-3。它构成一种物理屏障，可抑制细胞的自由移动以及水溶性分子的扩散，从而保护大脑免受病原体和潜在有害物质的侵害。除了屏障功能外，血脑屏障还能向脑实质输送氧气和营养物质，以维持神经组织的正常功能。血脑屏障的功能特性由其细胞和非细胞成分高度调控，其中高度特化的内皮细胞（ECs）是其主要结构组分。血脑屏障的内皮细胞具有紧密连接（TJ）复合体、无窗孔结构、极低的胞饮活性以及持续活跃的转运机制等特征。血脑屏障的其他组分，包括内皮基底膜、包绕内皮的周细胞、星形胶质细胞终足及其相关的实质基底膜，也参与血脑屏障的发育、维持和功能^2,4-6，并与神经元和小胶质细胞共同构成神经血管单元（NVU），从而保障中枢神经系统的正常运作^7-9。

在多种神经系统疾病（如神经退行性、炎症性或感染性疾病）中，血脑屏障的功能会受到损害^2,5,10紧密连接复合物和分子转运机制的失调会导致血脑屏障通透性增加、白细胞外渗、炎症反应及神经元损伤。为了在这些病理生理条件下研究血脑屏障的特性，已有多种 体外 已建立血脑屏障模型^9,11,12它们共同为屏障完整性、通透性以及转运机制的变化提供了宝贵的见解。这些模型采用人、小....

方案

所有实验均按照德国动物护理指南，在明斯特大学中心动物实验设施的无特定病原体条件下进行小鼠的繁育和饲养。所有实验均遵循动物实验伦理委员会的指导原则，并经德国北莱茵-威斯特法伦州当地主管部门（LANUV，批准号：84-02.05.20.12.217）批准。

1. MBMEC 的分离与培养

注意：按照先前详细描述的方法分离 MBMEC，但需进行以下修改¹⁴：

1. 通过吸入 CO₂ 处死 20 只成年 C57BL/6 小鼠（6-8 周龄），并通过确认心脏和呼吸停止来验证其死亡。
2. 用 70% 乙醇冲洗小鼠，使用剪刀剪去头部；用镊子和剪刀去除头皮。从枕骨大孔开始，在颅骨左右两侧做切口。从颅骨尾侧抬起颅骨，并用镊子取出脑组织。
3. 在超净工作台内，使用无菌镊子将脑组织放入培养皿中，去除脑干、小脑和丘脑，仅保留大脑皮层。
   注意：上述任何步骤均无需使用显微镜。
4. 将大脑皮层置于一片无菌 Western 印迹纸之上，用镊子轻轻滚动，直至不再可见脑膜。
5. 经过机械和酶消化处理（参照方案¹⁴）后，使用无菌长针头和 5 ml 推注器从密度梯度中收集内皮细胞。内皮细胞表现为红细胞环上方的一层浑浊层。将该层液体 20-25 ml 转移至新的 50 ml 离心管中，并用 DMEM 培养基补足体积。
6. 经过两轮洗涤¹⁴后，将细胞....

结果

图1 提供了对...的总体概述 体外 用于研究T细胞与内皮细胞相互作用的血脑屏障模型。该实验包括三个主要步骤。第一步是从脑皮层中分离原代小鼠脑微血管内皮细胞（MBMECs），并在培养板中培养五天。当细胞在培养板中达到融合状态后，用胰蛋白酶消化并重新接种到可渗透性插件上，然后将插件置于跨内皮电阻（TEER）测量仪中。连续三至五天持续测量和监测MBMECs的TEER值和细胞旁通透性（Ccl）。在此期间，分离T细胞并进行刺激（第二步），随后培养两至五天，具体时间取决于刺激的类型和强度。第三步是在Ccl处于稳定低水平且TEER达到最大值时，将T细胞加入MBMECs中进行共培养。选择TEER仍处于平台期的时间点进行共培养，对整个实验的成功至关重要。因此，必须谨慎选择T细胞的分离与刺激时间，以确保在将其加入内皮细胞时，T细胞已达到所需的活化水平。加入T细胞后，继续测量一天，随后分析结果。

经过最初的五天培养后，M.......

讨论

所述实验方案中的多个步骤对于实验成功至关重要。在初始的脑微血管内皮细胞（MBMEC）分离与培养过程中，应尽可能在无菌条件下操作，以防止真菌孢子或细菌污染细胞培养物。为了获得纯化的内皮细胞（EC）培养体系，建议在培养的前3天使用含有嘌呤霉素（Puromycin）的培养基，该条件可使内皮细胞存活，而其他细胞类型（尤其是周细胞）无法存活^41,42。另一个需要特别关注的关键步骤是确定加入预激活T细胞的正确时间点。在跨内皮电阻（TEER）测量的前48小时内，MBMEC在可渗透性插入膜上增殖并逐渐闭合彼此之间的间隙。因此，电容（Ccl）持续下降，直至达到稳定且较低的水平（约0.6 µF/cm²）。这是内皮细胞单层融合的第一个标志，但尚不能代表形成了紧密的屏障。只有当Ccl达到稳定水平后，TEER才开始上升。当紧密连接（TJ）复合体完全形成且内皮屏障完全封闭时，TEER达到最大值。这一平台期通常在内皮细胞重新接种后3至5天内出现，并持续维持24至36小时。加入T细胞的最佳时间点是在平台期的起始阶段，这可确保内皮细胞仍具有足够的活力，能够与T细胞进行共培养。由于T细胞的激活需在共培养的最佳时间点到来之前启动，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
cellZscope	nanoAnalytics GmbH	www.nanoanalytics.com	包含：24孔细胞模块、控制器、安装有cellZscope软件v2.2.2的PC
超速离心机	Thermo Scientific	www.thermoscientific.com	SORVALL RC 6+；转子F21S-8x50y；用于MBMEC分离
流式细胞仪	Beckman Coulter	www.beckmancoulter.com	用于T细胞跨膜迁移分析
FlowJo7.6.5软件	Tree Star	www.flowjo.com	用于T细胞跨膜迁移分析
Oak Ridge离心管，PC材质	Thermo Fisher Scientific	3118-0050	50 ml；用于MBMEC分离
Transwell膜插件 - 孔径0.4 µm	Corning	3470	用于TEER测量作为主要读数指标
Transwell膜插件 - 孔径3 µm	Corning	3472	用于T细胞跨膜迁移实验前的质量控制TEER测量
24孔细胞培养板	Greiner	650 180	平底；用于MBMEC培养
96孔细胞培养板	Costar	3526	圆底；用于免疫细胞培养
QuadroMACS分离器	Miltenyi Biotec	130-090-976	用于T细胞和B细胞分离；适配MACS LS柱
OctoMACS分离器	Miltenyi Biotec	130-042-109	用于树突状细胞分离；适配MACS MS柱
Neubauer计数板	Marienfeld	MF-0640010	用于细胞计数
细胞筛网，70 µm	Corning	352350	用于免疫细胞分离
细胞筛网，40 µm	Corning	352340	用于免疫细胞分离
MACS MultiStand支架	Miltenyi Biotec	130-042-303	用于免疫细胞分离
MACS LS分离柱	Miltenyi Biotec	130-042-401	用于T细胞和B细胞分离
MACS MS分离柱	Miltenyi Biotec	130-042-201	用于树突状细胞分离
小鼠CD4 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-049-201	用于CD4+ T细胞分离
小鼠CD19 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-052-201	用于B细胞分离
小鼠CD11c MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-052-001	用于树突状细胞分离
人胎盘来源IV型胶原蛋白	Sigma	C5533	用于MBMEC包被溶液
牛血浆来源纤连蛋白	Sigma	F1141-5MG	用于MBMEC包被溶液
胶原酶2（CSL2）	Worthington	LS004176	用于MBMEC分离
胶原酶/分散酶（C/D）	Roche	11097113001	用于MBMEC分离
DNase I	Sigma	DN25	用于MBMEC分离
胎牛血清（FBS）	Sigma	F7524	用于MBMEC分离
牛血清白蛋白（BSA）	Amresco	0332-100G	用于MBMEC分离
Percoll	Sigma	P1644-1L	用于MBMEC分离
DMEM（含GlutaMAX）	Gibco	31966-021	用于MBMEC分离及MBMEC培养基
青霉素/链霉素	Sigma	P4333	用于MBMEC分离及MBMEC培养基
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma	D8537	用于MBMEC和免疫细胞分离
肝素	Sigma	H3393	用于MBMEC培养基
人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）	PeproTech	100-18B	用于MBMEC培养基
嘌呤霉素	Sigma	P8833	用于MBMEC培养基；仅前3天使用
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300-054	用于收获MBMEC
IA型胶原酶	Sigma	C9891	用于树突状细胞分离
台盼蓝溶液，0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	用于细胞计数
EDTA	Sigma	E5134	用于免疫细胞分离
IMDM + 1% L-谷氨酰胺	Gibco	21980-032	用于T细胞培养基
X-VIVO 15	Lonza	BE04-418Q	避光保存；用于B细胞培养基
β-巯基乙醇	Gibco	31350-010	用于B细胞培养基
L-谷氨酰胺（100x Glutamax）	Gibco	35050-061	用于B细胞培养基
小鼠MOG35—55 肽	Biotrend	BP0328	用于抗原特异性T细胞活化
纯化抗小鼠CD3抗体	BioLegend	100302	克隆号145-2C11；用于多克隆T细胞活化
纯化NA/LE抗小鼠CD28抗体	BD Pharmingen	553294	克隆号37.51；用于多克隆T细胞活化
重组小鼠IFN-γ	PeproTech	315-05	用于T细胞跨膜迁移实验
重组小鼠TNF-α	PeproTech	315-01A	用于T细胞跨膜迁移实验
NA/LE纯化抗小鼠IFN-γ抗体	BD Biosciences	554408	克隆号XMG1.2；推荐终浓度：20 µg/ml
颗粒酶B抑制剂II	Calbiochem	368055	推荐终浓度：10 µM
PE标记抗小鼠CD4抗体	Biolegend	116005	克隆号RM4-4；用于T细胞跨膜迁移分析