淋巴细胞是适应性免疫应答中的主要效应细胞。本文介绍一种淋巴细胞纯化方案，用于研究目标分子在淋巴细胞活化过程中的生理功能。 体外 和 体内所述实验步骤适用于比较对照组与基因改造淋巴细胞之间的功能能力。
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本文内容
摘要
摘要
B细胞和T细胞具有极其多样的抗原受体库，能够针对几乎任何入侵的病原体引发特异性免疫应答1,2可以理解的是，这些复杂的免疫能力由大量参与各种细胞过程的分子所调控，以确保免疫反应在时间和空间上的精确调控3在此，我们描述了一种利用磁性细胞分选技术快速分离高纯度小鼠淋巴细胞的实验方法。所获得的高纯度淋巴细胞可进一步用于多种实验分析 体外 或 体内 功能检测，例如通过免疫印迹法检测淋巴细胞受刺激后的信号传导能力4 通过增殖能力的检测 3H-胸苷掺入或羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记5-7除了比较对照组与基因修饰淋巴细胞的功能能力外，我们还可以测定抗原提呈细胞（APCs）的T细胞刺激能力。 体内如我们使用移植的CFSE标记的OT-I T细胞所得的代表性结果所示。
引言
成熟的淋巴细胞在个体无既往感染或炎症的情况下通常处于静息状态。因此，在进行后续实验前，分离过程中保持淋巴细胞的初始状态至关重要。 体外 或 体内 功能检测。确保结果一致且可重复的关键在于尽量减少对细胞的不必要操作。
磁性细胞分选利用抗体和微珠标记细胞，从而富集目标细胞群体。该方法包含两种纯化策略：阳性富集和阴性耗竭。阳性富集使用可结合目标细胞的抗体来富集目标细胞群体；而阴性耗竭则是去除非目标细胞，从而保留目标细胞群体。在我们的实验室中，相比阳性富集，我们更倾向于采用阴性耗竭，因为抗体与目标细胞的结合可能会改变细胞的特性与行为。事实上，许多用于分离特定细胞群体的已确立的细胞表面标志物同时也是具有功能的受体。
磁性细胞分选不仅能获得高纯度的活性目标细胞群体，而且耗时更短，并避免了荧光激活细胞分选（FACS）中高压液流所引起的细胞应激。通过标记不需要的细胞群体并利用磁性分离柱将其去除，我们能够快速分离细胞，同时不损害目标细胞群体的活性。在本实验方案中，我们将演示如何采用阴性去除策略来纯化初始B细胞或T细胞。
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方案
所有小鼠均在特定无病原体条件下饲养和维持，所有小鼠实验方案均依照机构动物护理和使用委员会的指南进行。
1. 缓冲液和试剂的制备
- 配制完全的罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）培养基（含10%热灭活胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、青霉素（100 IU/ml）/链霉素（100 µg/ml）、55 µM 2-巯基乙醇）。
- 分别配制20倍浓度的平衡盐溶液（BSS）储备液1和储备液2。
- 配制20× BSS储备液1（111 mM葡萄糖、8.8 mM磷酸钾、26.7 mM磷酸氢二钠溶于1 L无菌水中），在定容前向其中加入40 ml 0.5%酚红溶液。使用0.2 µm滤膜过滤除菌后，于4 °C保存。
- 配制20× BSS储备液2（25.8 mM二水氯化钙、107 mM氯化钾、2.73 M氯化钠、19.6 mM六水氯化镁、16.6 mM硫酸镁溶于1 L无菌水中）。使用0.2 µm滤膜过滤除菌后，于4 °C保存。
- 为配制实验用1× BSS，分别将50 ml BSS储备液1和50 ml BSS储备液2各自加入400 ml无菌水中稀释。将两种稀释液混合后调节pH至7，加入20 ml FBS（终浓度2%），再用无菌水补至1 L总体积，并使用0.2 µm滤膜过滤除菌。
注意：BSS储备液应分别配制，因为高浓度的BSS储备液直接混合可能导致沉淀产生。
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结果
磁性细胞分选法纯化淋巴细胞可使用户在相对较短的时间内纯化目标细胞群体。采用我们的去除非目标细胞方案，可将重组激活基因-1（RAG-1）缺陷型小鼠中OT-I CD8 T细胞的比例从纯化前的72.8%提升至纯化后的94.2%； 图1A)4,5这些纯化的淋巴细胞随后可用于下游功能检测，以评估淋巴细胞增殖和信号转导。4,5例如，我们可以研究 体内 APC的T细胞刺激能力 通过将CFSE标记的抗原特异性T细胞转移至经适当抗原免疫的野生型（WT）和突变型（MT）小鼠体内5.
在我们的代表性实验中，我们将纯化后用CFSE标记的、针对卵清蛋白（OVA）的OT-I CD8 T细胞转移至对照组（WT）和突变组（MT）小鼠体内，并于一天后用OVA蛋白对这些小鼠进行免疫。免疫后第三天，我们收集了淋巴结（近端和远端）及脾脏，并通过流式细胞术.......
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讨论
在本实验方案中，我们展示了一种从淋巴器官中纯化淋巴细胞的步骤。利用磁珠分选技术进行细胞纯化是一种快速且简便的方法，可获得具有活性且高度纯化的目标细胞。
方案中的关键步骤
细胞活力和细胞得率
维持造血系细胞的活性 体外 对于确保实验的成功性和可重复性至关重要。化学与生物试剂、次优的实验条件或离体器官的不当保存条件均可能影响细胞活力。从小鼠体内取出淋巴器官后，应立即置于冰上保存，并尽快制备单细胞悬液。应避免对细胞悬液进行高速离心。此外，在移除上清液后，应通过手指轻弹管壁使细胞沉淀松散。不建议直接使用大量培养基并通过移液器强行重悬细胞沉淀。
一只8至10周龄的野生型小鼠可分离出约2-4 × 107个脾脏B细胞以及来自所有主要淋巴结的2 × 107个T细胞。如前所述，若纯化的B细胞和T细胞数量减少（低于预期值），则表明分离条件不理想。.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由新加坡教育部（AcRF Tier1-RG40/13 和 Tier2-MOE2013-T2-2-038）资助。稿件由 Obrizus Communications 的 Amy Sullivan 编辑。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料 | |||
| RPMI 1640（不含L-谷氨酰胺） | Gibco | 31870025 | |
| 胎牛血清 | 使用前需热灭活 | ||
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030024 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140114 | |
| 2-巯基乙醇 | Gibco | 21985023 | |
| 抗CD43磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-049-801 | 使用前充分混匀 |
| 链霉亲和素磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | 使用前充分混匀 |
| 抗Annexin V磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-090-201 | 使用前充分混匀 |
| MACS LD | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| 96孔U型底无菌培养板 | Greiner Bio-one | 650180 | |
| 96孔F型底无菌培养板 | Greiner Bio-one | 655180 | |
| 100 μm 细胞筛网 | 使用前需用紫外光灭菌 | ||
| 0.2 μm 无菌一次性滤器 | Nalgene | 567-0020 | 可用任何无菌滤膜装置替代 |
| CellTrace Violet | Invitrogen | C34557 | 简称CTV；CFSE的替代染料 |
| CellTrace Yellow | Invitrogen | C34567 | 简称CTY；CFSE的替代染料 |
| CellTrace Far Red | Invitrogen | C34564 | 简称CTFR；CFSE的替代染料 |
| Cell Proliferation Dye eFluor 670 | eBioscience | 65-0840 | 简称CPD670；CFSE的替代染料 |
| PKH26 | Sigma Aldrich | PKH26GL | PKH26，CFSE的替代染料 |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 化学试剂 | |||
| 葡萄糖 | Sigma Aldrich | G7021 | |
| 磷酸二氢钾 | Sigma Aldrich | P5655 | |
| 磷酸氢二钠 | Sigma Aldrich | S5136 | |
| 酚红 | Sigma Aldrich | P0290 | |
| 二水合氯化钙 | Sigma Aldrich | C7902 | |
| 氯化钾 | Sigma Aldrich | P5405 | |
| 氯化钠 | Merck Millipore | S7653 | 可使用其他来源产品 |
| 六水合氯化镁 | Sigma Aldrich | M2393 | |
| 硫酸镁 | Sigma Aldrich | M2643 | |
| 氯化铵 | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Tris碱 | |||
| 二甲基亚砜 | Sigma Aldrich | D8418 | |
| 5-(和6-)羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE） | Molecular Probes | C-1157 | 用DMSO溶解重悬 |
| 佛波醇12,13-二丁酸酯（PBDU，佛波酯） | Sigma Aldrich | P1269 | |
| A23187（钙离子载体） | Sigma Aldrich | C7522 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 抗体与重组蛋白 | |||
| CD11b生物素标记抗体（克隆号m1/70） | Biolegend | 101204 | T细胞去除混合液组分 |
| CD11c生物素标记抗体（克隆号N418） | Biolegend | 117304 | T细胞去除混合液组分 |
| Gr-1生物素标记抗体（克隆号RB6-8C5） | Biolegend | 108404 | T细胞去除混合液组分 |
| Ter119生物素标记抗体（克隆号Ter119） | Biolegend | 116204 | T细胞去除混合液组分 |
| TCR-γδ生物素标记抗体（克隆号GL-3） | Biolegend | 118103 | T细胞去除混合液组分 |
| CD19生物素标记抗体（克隆号6D5） | Biolegend | 115504 | T细胞去除混合液组分 |
| B220生物素标记抗体（克隆号RA3-6B2） | Biolegend | 103204 | T细胞去除混合液组分 |
| CD49b生物素标记抗体（克隆号DX5） | Biolegend | 108904 | T细胞去除混合液组分 |
| CD4生物素标记抗体（克隆号GK1.5） | Biolegend | 100404 | T细胞去除混合液组分 |
| CD8生物素标记抗体（克隆号53-6.7） | Biolegend | 100704 | T细胞去除混合液组分 |
| F(ab’)2山羊抗小鼠IgM抗体（包被用） | Jackson ImmunoResearch | 115-006-075 | 包被时每孔50 µl（96孔板） |
| 抗小鼠CD40单克隆抗体（包被用） | Pharmingen | 553722 | 包被时每孔50 µl（96孔板） |
| 重组IL-4 | ProSpec | Cyt-282 | |
| 大肠杆菌血清型055:B5来源的LPS | Sigma Aldrich | L-4005 | |
| 抗CD3抗体（克隆号OKT3）（包被用） | eBioscience | 16-0037-85 | 包被时每孔50 µl（96孔板） |
| 抗CD28抗体（克隆号37.51）（包被用） | eBioscience | 16-0281-85 | 包被时每孔50 µl（96孔板） |
| 重组IL-2 | ProSpec | Cyt-370 | |
| 鸡卵清白蛋白（Ovalbumin） | Sigma Aldrich | A7641 |
参考文献
- Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. The many important facets of T-cell repertoire diversity. Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).
- LeBien, T. W., Tedder, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Brownlie, R., Zamoy....
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