诊断胆汁酸吸收不良及测量胆汁酸转运的工具 体内 有限。本文描述了一种在活体动物中应用的创新方法，该方法结合了质子（1H）加氟（F）19F）磁共振成像；这种新方法在临床实践中具有用于筛查胆汁酸吸收不良的转化潜力。
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摘要
摘要
除了作为促进脂肪吸收的去污剂这一传统作用外，越来越多的研究表明，胆汁酸是影响多个器官的强效信号分子；它们可调节肠道蠕动和激素生成，并改变血管张力、葡萄糖代谢、脂质代谢以及能量利用。粪便中胆汁酸的变化可能改变肠道微生物组，并促进包括胆汁性腹泻和结肠癌在内的结肠病理改变。决定粪便胆汁酸组成的关键调控因子是小肠顶膜钠依赖性胆汁酸转运体（ASBT）和成纤维细胞生长因子-19（FGF19）。ASBT表达和功能降低会减少肠道对胆汁酸的摄取。此外，体外（in vitro）数据表明，一些美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物会抑制ASBT功能。FGF19分泌不足会导致肝脏胆汁酸合成增加并大量释放入肠道，超出ASBT的转运能力。无论是ASBT功能障碍还是FGF19缺乏，都会导致粪便胆汁酸升高，可能引发慢性腹泻并促进结肠肿瘤的发生。遗憾的是，目前可用于在体内（in vivo）测量胆汁酸吸收不良以及药物对胆汁酸转运作用的工具十分有限。为了深入理解胆汁酸复杂的生物学作用，亟需能够同时监测肠道和代谢组织中胆汁酸动态的技术。这促使我们设计出一种创新方法，即结合质子（1H）和氟（19F）磁共振成像（MRI），在活体动物中测量胆汁酸转运。我们研发并测试了适用于氟（19F）磁共振活体成像的新型示踪剂，包括体外（in vitro）和体内（in vivo）实验。该方法的优势在于无需使用电离辐射，且具有向临床研究与实践转化的潜力。
引言
除了作为促进肠道脂肪吸收的表面活性剂这一经典作用外，胆汁酸还被发现是强效的信号分子，可影响多种器官，而不仅限于参与其肠肝循环的器官1,2除了调控自身的代谢外，胆汁酸还调节胃肠道生理学的多个方面（例如，肠道蠕动和肠促胰素激素生成、结肠生理功能以及癌症易感性），并对血管张力、葡萄糖和脂质代谢及能量利用产生全身性影响。这些效应中，部分由肠道局部介导，另一部分则源于餐后全身胆汁酸水平的变化，如在肥胖患者或胃旁路手术后所观察到的情况。为了阐明胆汁酸复杂的代谢作用，需要开发新技术，以实现对胃肠道及代谢组织（肝脏、胰腺、骨骼肌和脂肪组织）中不同解剖区室内的胆汁酸水平进行同步监测。获取此类时空动态信息需要创新的技术手段—— 体内 使用新型胆汁酸示踪剂进行成像是一种如本文所述的全新方法。
解剖区室中胆汁酸的组成和分布受到多种因素调控，这些因素影响胆汁酸的肝脏合成和回肠吸收，包括饮食、手术、抗生素使用以及肠道菌群的变化。肠道胆汁酸吸收以实现肠肝循环3（图1）的一个关键调控因子是回肠顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白（ASBT；SLC10A2）。尽管胆汁酸可在整个肠道中发生被动吸收，但ASBT介导了95%的肠道胆汁酸摄取，因此在正常情况下仅有少量胆汁酸排入粪便。Asbt缺陷型（Slc10a2-/-）小鼠粪便中胆汁酸....
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方案
以下方案遵循马里兰大学医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的指南（IACUC 方案编号 #0415011，2015年6月18日批准）。
1. 通过灌胃法向小鼠给予19F标记的胆汁酸
- 以每公斤体重150 mg的剂量对小鼠进行灌胃给予19F标记的胆汁酸。用1 ml注射器吸取所需体积的19F标记胆汁酸储备液[牛磺胆酸-三氟乙酰赖氨酸（CA-lys-TFA；溶于1:1的聚乙二醇400与杜氏磷酸盐缓冲液）或胆酰基-肌氨酸-三氟-N-甲基乙酰胺（CA-sar-TFMA；溶于60%聚乙二醇400和40%杜氏磷酸盐缓冲液）]，并连接一根20号、1.5英寸长、带球状尖端的弯曲胃灌注针。确保灌胃针足够长，当插入食道至针座处时，可达到小鼠剑突软骨水平
- 用拇指和食指牢牢抓住小鼠颈背部的松弛皮肤，并用其余手指抓住其下背部和尾巴的皮肤
- 将小鼠保持直立，将灌胃针沿口腔侧壁和顶部进入食道，并继续向下插入胃中。若在咽部遇到阻力，应调整针头位置，直至小鼠“吞咽”针头——切勿强行推进
- 若灌胃需要麻醉，将小鼠放入含有5 ml异氟烷的钟形罩内并封闭。当小鼠侧卧时，等待7秒后取出并立即进行灌胃。为保护操作人员免受麻醉蒸气影响，钟形罩仅可在通风橱内使用
- 观察小鼠在数分钟内从异氟烷麻醉中恢复。
注意：由于异氟烷经肝脏代谢，其完整药物或代谢产物经胆道系统和胆囊排泄时可能产生....
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结果
利用MFBA进行体内 MRI以实时“观察”胆汁酸转运在科研和临床应用中均具有巨大潜力。此外，本文所述通过液相色谱-质谱联用技术对胆囊切除标本及其内容物进行生化分析的方法，可为影像结果提供验证手段。然而，这些方法的有效性依赖于精确的给药剂量、检测时间点的控制，以及胆囊在成像或手术切除过程中的准确定位。对于后者，操作过程中应尽可能减少对小鼠腹腔器官的干扰；即使对胆囊进行轻柔操作，也可能诱发其收缩并排空内容物。因此，为完整保留胆囊内容物，必须尽快在胆总管处放置夹钳。
采用此处建议的手术方法，应在腹部右上象限肝脏右前叶后方清晰辨认胆囊（图3）。将肝脏移开而不触碰胆囊，即可暴露胆总管以便夹闭。一旦夹闭到位，即可顺利进行本方案中所述其他步骤，完整切除胆囊。
数据在 表1
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讨论
CA-lys-TFA 和 CA-sar-TFMA 的合成以及 体外 使用稳定转染的表达ASBT的Madin-Darby犬肾细胞和表达钠/牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）的人胚胎肾细胞进行其转运分析的实验细节见其他文献13,14此处重点介绍通过灌胃法对活体动物进行 MFBA 的口服给药，随后采集胆囊、肝脏和血液样本，用于分析 MFBA 含量，并特别通过活体动物磁共振成像（MRI）对胆囊内的 MFBA 进行成像。关键步骤包括避免使用含氟麻醉剂，因其可能产生竞争性信号干扰 19避免在夹闭胆总管前操作胆囊，以防胆囊收缩并在切除前排空，同时避免将金属物品放置在磁共振成像（MRI）扫描仪附近。
如本文及其他文献所述13,14，MFBA-MRI 在成功分析胆汁酸转运方面具有巨大潜力 体内 在正常与异常生理条件下均可应用。MFBA-MRI 的主要优势在于不涉及电离辐射（无论是使用天然非放射性氟标记的 MFBA，还是 MRI 本身均不产生电离辐射），且 MFBA 可经口服给药，无需静脉穿刺（与小鼠不同.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院下属的糖尿病与消化及肾脏疾病研究所（资助号：R21 DK093406 和 T32 DK067872，授予 J-P.R.）以及美国退伍军人事务部杰出研究奖（资助号：1BX002129，授予 J-P.R.）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 双件式21号全玻璃组织研磨器 | Kimble Chase Life Science, Vineland, NJ | 885351-0022 | |
| Bruker BioSpec 70/30USR Avance III 7T水平孔径磁共振成像仪 | Bruker Biospin MRI GmbH, Germany | 需配合Paravision 5.1版本软件使用（见步骤3.5） | |
| Bruker 40 mm 19F/1H双调谐线性体积线圈 | Bruker Biospin MRI GmbH, Germany | 需配合Paravision 5.1版本软件使用（见步骤3.5） | |
| Waters Acquity UPLC系统，配备四极杆检测器 | Waters Corporation, Milford, MA | ||
| Waters Acquity UPLC 乙烯桥杂化C8色谱柱，1.7 μm，2.1 x 50 mm | Waters Corporation, Milford, MA | ||
| 灌胃针 | Braintree Scientific, INC. | N-010 | 20 G-1.5" 弯头，带2.25 mm球头 |
| 2把不锈钢止血钳 | VWR | 10755-018 | 4英寸和5英寸，直头 |
| 氯胺酮 | MWI Veterinary Supply | 501090 | Ketamin zetamine 100 mg/ml |
| 赛拉嗪 | Akorn, Inc. | 20 mg/ml | |
| 腹腔内导管 | Abbott | AbbocathTM-T.I.V. G720-A01 4535-42 | 24-G x 0.75" |
参考文献
- Thomas, C., Pellicciari, R., Pruzanski, M., Auwerx, J., Schoonjans, K. Targeting bile-acid signalling for metabolic diseases. Nat Rev Drug Discov. 7, 678-693 (2008).
- Vallim, T. Q., Edwards, P. A. Bile acids have the gall to function as hormones. Cell Metab. 10, 162-164 (2009).
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重印与许可
