本文介绍了一种利用自由区带毛细管电泳法检测和定量植物材料中有机酸的方法。文中提供了一个该方法潜在应用的示例，即测定二次发酵对咖啡种子中有机酸含量的影响。
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本文内容
摘要
摘要
羧酸是一类含有一个或多个末端羧基（COOH）官能团的有机酸。短链羧酸（SCCAs；含三至六个碳原子的羧酸），如苹果酸和柠檬酸，在许多生物系统的正常功能中起着关键作用，参与细胞呼吸过程，并可作为细胞健康状况的指标。在食品中，有机酸含量对风味具有显著影响，SCCA水平升高会导致酸味或"酸性"口感。因此，快速分析有机酸含量的方法在食品和饮料工业中备受关注。然而，目前大多数用于SCCA定量的方法依赖于耗时的实验流程，需要使用有害试剂对样品进行衍生化处理，随后进行昂贵的色谱和/或质谱分析。本文介绍了一种替代方法，用于从植物材料和食品样品中检测和定量有机酸，该方法基于自由区带毛细管电泳（CZE），有时简称为毛细管电泳（CE）。CZE是一种成本较低且检测限低（0.005 mg/mL）的SCCA测定方法。本文详细描述了从植物样品中提取和定量SCCA的操作步骤。尽管本方法以咖啡豆中的SCCA测定为重点，但也可适用于多种植物性食品材料。
引言
羧酸是一类含有一个或多个末端羧基官能团的有机化合物，每个羧基连接在一个含有一个或多个碳原子的R基团上（R-C[O]OH）。含有1至6个碳原子的短链、低分子量羧酸（短链羧酸，SCCA）是细胞呼吸的重要组成部分，在细胞生长和发育所必需的多种生化途径中发挥功能。SCCA在细胞代谢1、细胞信号传导2以及生物体对环境的响应（如抗生作用3）中起着关键作用。因此，SCCA可作为细胞代谢紊乱、植物胁迫响应4,5和果实品质6,7的有用指示物。迄今为止，SCCA的定量主要依赖色谱技术，如高效液相色谱（HPLC）或气相色谱-质谱联用（GC-MS）。尽管这些方法能够实现极低的检测限，但其成本较高，通常需要使用腐蚀性或有毒试剂对目标SCCA进行衍生化处理，并且在GC或HPLC上进行耗时较长的分离过程。正因如此，近年来人们对采用自由区带毛细管电泳（CZE）技术定量有机酸的兴趣持续增加，该方法无需样品衍生化步骤8。
自由区带毛细管电泳（CZE）是一种色谱分离方法，由于其理论塔板数高、分析速度快且操作相对简便，正逐渐取代气相色谱-质谱联用（GC-MS）和高压液相色谱，成为阴离子、阳离子、氨基酸、碳水化合物以及短链羧酸（SCCAs）定量分析（特别是用于质量控制）的常用分析手段8,9,10。基于CZE的小分子分离（包括SCCAs）主要依据两个原理：一是带电离子....
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方案
1. 样品制备
- 组装短链羧酸（SCCA）提取样品。每次处理1.0 g咖啡种子，以确保加工后仍有足量样品留存。
- 若样本在研磨前已被冷冻，则在整个处理过程中应保持组织处于冷冻状态，以防止冻融损伤和样本氧化。仅在研磨所需时，方可将样本从冰箱或超低温储存环境中取出。
- 在研磨样品前，立即将新鲜样品置于液氮中速冻。为尽量减少样品操作，可将样品放入预先装有液氮的研钵中进行速冻。
- 生成液体样品后应立即进行分析，或在液氮中速冻后于 -20 ºC 或 -80 ºC 保存直至分析。分析前，将冷冻样品从储存温度取出，使其充分解冻。液体样品直接进入步骤（3.5）进行处理。
- 操作液氮前应穿戴适当的个人防护装备（包括护目镜、手套和实验服）。
- 将组织样本研磨三次，直至形成均匀的细粉（即， 在液氮中使用陶瓷研钵和研杵将样品研磨成均匀粒径的粉末。
注意：获得均匀的颗粒尺寸对于最大化SCCA提取效率至关重要。- 在加入样品前，先用液氮预冷研钵和研杵。加入样品时，保持研钵内盛有少量液氮。
- 使用勺子向研钵中加入足量液氮，直至完全浸没样品。
- 将易于研磨的样品（如叶片或烘焙咖啡豆）加入液氮中，用环形研磨动作进行粉碎。当液氮液面下降至刚好浸没样品时，开始研磨。
- 将难以研磨....
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结果
本方案已成功用于测定种子处理对绿色咖啡种子中SCCA含量的影响。本实验设置了六种处理：在培养基中含Leuconostoc pseudomesenteroides菌株GCP674的饱和微生物悬液（1）、将GCP674微生物悬浮于水中形成的水悬液（2）、含乙酸和乳酸的水溶液（浓度分别为0.15和0.4 mg/mL）（3）、使用过的M1培养基处理（4）、去离子水（dH2O）处理（5）以及未处理对照组（种子中不添加任何物质）（6）。对种子进行处理后，使其发酵24小时。每种处理设置四个独立重复。采用己二酸作为内标，测定柠檬酸（C）、苹果酸（M）、乙酸（A）和乳酸（L）的含量。
针对每种短链羧酸（SCCA）和内标物，均建立了标准曲线，浓度范围覆盖预计咖啡样品中的浓度（5、10、20、40、60 和 80 ng/µl）。如预期所示，每种酸在此浓度范围内均呈现线性响应，柠檬酸、苹果酸、乙酸和乳酸的决定系数（R²）分别为 0.98.......
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讨论
与任何分析技术一样，有多个关键因素会显著影响所生成数据的质量和可靠性。首先，应高效地处理样品，并尽量减少冻融循环次数。反复冻融可能在样品处理或分析前就破坏其化学组成。其次，必须一致且均匀地将本实验方案的各个步骤应用于所有样品。由于样品制备和操作不一致所导致的技术误差，可能显著影响数据质量，并导致结果的变异性增加 "噪声" 在SCCA检测中，样品研磨后的粒径将影响SCCA提取的速度和效率。因此，确保样品被研磨至均一的粒径至关重要，这有助于维持各样品间提取效率的一致性，并降低样品间的变异性。同样，在标准溶液配制过程中的准确称量与移液、样品质量的精确测量，以及对提取时间的仔细监控（和归一化）将有助于生成更为均一的数据。花时间仔细对上述各项参数进行归一化、测量和记录，可确保数据的可靠性，并允许在运行后对可能出现的处理误差进行准确校正。第三，选择并使用合适的内标物至关重要。最终分析物浓度的计算高度依赖于各样品中内标物峰面积的准确校正。因此，内标物的测量必须准确且精确；理想情况下，内标物不应天然存在于样品中，也不应与其他化合物共洗脱。正确选择并在所有样品中使用内标物，不仅可使研究者有效控制因提取效率差异所导致的代谢物水平变化，还能显.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢J.M. Smucker公司对本项目提供的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 陶瓷研钵和研杵 | Coorstek | 60310 | |
| Beckman Coulter P/ACE MDQ 毛细管电泳系统 | Beckman Coulter | Various | |
| 玻璃样品瓶 | Fisher Inc. | 033917D | |
| 1.5 ml 微量离心管 | Fisher Inc. | 02-681-5 | |
| LC/MS 级水 | Fisher Inc. | W6-1 | Milli-Q 水（18.2 MΩ·cm）也可接受 |
| 15 ml 玻璃管 / 聚四氟乙烯衬垫盖 | Fisher Inc. | 14-93331A | |
| Parafilm M 封口膜 | Fisher Inc. | 13-374-12 | |
| CElixirOA 检测试剂盒 pH 5.4 | MicroSolv | 06100-5.4 | |
| BD Safety-Lok 安全型注射器 | Fisher Inc. | 14-829-32 | |
| 17 mm Target 注射器滤器，PTFE 材质 | Fisher Inc. | 3377154 | |
| 32 Karat，V. 8.0 控制软件 | Beckman Coulter | 285512 | |
| 毛细管电泳（CE）样品瓶 | Beckman Coulter | 144980 | |
| CE 样品瓶盖 | Beckman Coulter | 144648 | |
| 液氮 | N/A | N/A | 液氮可从大多数设施服务部门获得 |
参考文献
- Araújo, W. L., Nunes-Nesi, A., Nikoloski, Z., Sweetlove, L. J., Fernie, A. R. Metabolic Control and Regulation of the Tricarboxylic Acid Cycle in Photosynthetic and Heterotrophic Plant Tissues: TCA Control and Regulation in Plant Tissues. Plant Cell Environ. 35 (1), 1-21 (2012).
- Finkemeier, I., Konig, A. C., et al.
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重印与许可
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