定义底物特异性的脂肪酶和磷脂酶考生

摘要

许多预测的（磷酸化）脂肪酶在其底物特异性和生理功能方面的表征不佳。在这里，我们提供了一个方案来优化酶活性，寻找天然底物，并提出这些酶的生理功能。

摘要

微生物产生的那些，以使可用于生物体外部基板分泌（磷）的脂酶广泛光谱。另外，其他（磷酸）脂肪酶可以在物理上与生产菌引起的内在脂质的营业额，并经常引起细胞膜的重塑有关。虽然势（磷）的脂肪酶可以用数目的算法时该基因/蛋白质序列可用来预测，经常没有获得的酶的活性，底物特异性，和潜在的生理功能的实验证据。这个手稿描述的测定条件与未知底物特异性，以及如何利用这些优化条件下在搜索用于相应（磷）的脂肪酶的天然底物准（磷）的脂肪酶的最优化。采用人工发色底物，如对硝基苯衍生物，可有助于检测小为在标准条件下的预测（磷）的脂肪酶的酶活性。具有遇到这样的次要的酶活性，酶测定法的不同参数可以在为了获得人造基底的更有效的水解而变化。已确定在其下的酶工作良好的条件之后，各种潜在天然底物应测定其降解，其可以采用不同的层析方法进行随后的处理。底物特异性为新酶的定义，通常提供假设这些酶，然后可通过实验测试的潜在生理作用。遵循这些指导原则，我们能够确定降解磷脂酰胆碱磷酸胆碱到甘油二酯和，在膜中生长时的磷限制条件细菌根瘤菌重塑的关键一步磷脂酶C（SMc00171）。两个预测patatin-就像有机体一样的磷脂酶（SMc00930和SMc01003），我们可以重新确定自己的底物特异性和澄清SMc01003是甘油二酯脂肪酶。

引言

基于甘油脂质，如三酰甘油和（甘油）磷脂构成了重要的可能是最知名的类脂质^1。三酰基甘油（变量）的脂肪或油，其通常用作存储脂类，因此作为潜在的能量和碳的来源。标签可以通过脂肪酶，这是经常被生产菌分泌的消化外部变量并使它们可作为碳源退化。另外，脂肪酶已经被广泛地研究，多年来，由于其重要的生物技术应用^2。

由于它们的两亲性质及其近圆筒状的形状，（甘油）磷脂展览成膜性，通常构成了双层膜³的主要类脂组分。在简单的微生物，如细菌大肠杆菌中，只有三个主要头组的变体，磷脂酰甘油（PG），心磷脂（CL），和phosphatidylethanolamine（PE）遇到，尽管人们应该知道，他们中的每一个都可以用在sn相当数量的不同脂肪酰基链的-1或SN -2位置引起大量不同分子种类⁴的被取代。其他细菌可能具有除了或代替其他磷脂。例如， 苜蓿中华根瘤菌 ，土壤细菌，其能够形成与豆科苜蓿（ 紫花苜蓿 ）一个固氮根瘤共生，包含除了PE的第二两性离子磷脂，磷脂酰胆碱^{（PC），5。}另外，不含有脂质磷或甘油可能是细胞膜的两亲性并形成部分。例如，在磷限制生长条件下，在S根瘤菌 ，（甘油）磷脂主要由膜脂质不包含磷， 即，硫脂，鸟氨酸脂质和diacylglyceryl trimethy....

方案

1.克隆和过度表达结构基因的脂肪酶预测

1. 使用聚合酶链反应^（PCR）14和特异性寡核苷酸（ 表^1）15，扩增感兴趣（smc01003，smc00930或smc00171）的基因，预测为脂肪酶编码或磷脂酶，从宿主生物的基因组DNA（ 即， 苜蓿根瘤菌 ）。
   1. 引入特定的限制性位点（有寡核苷酸的设计的序列）。消化与相应的限制性内切酶的扩增的DNA片段，并将其克隆到表达载体中，如PET系列¹⁶的质粒。
   2. 验证为克隆基因的正确DNA序列后，转化载体至表达菌株如大肠杆菌 BL21（DE3）pLysS中^16。
2. 准备表达宿主大肠杆菌的过夜预培养大肠杆菌 BL21（DE3）PLYSS，窝藏与克隆基因或空载体的各个pET载体，在含有20ml的Luria BERTANI肉汤^（LB）17 100毫升培养瓶中加所需的抗生素。培养细胞在30℃（或在从该脂肪酶源自细菌的通常生长温度）。
   1. 使用过夜预培养物，接种在2L培养瓶中500毫升预热的LB培养基（加所需抗生素）在620nm（OD _620）= 0.05，以获得一个初始光密度。跟随在的O....

结果

PC专用磷脂酶C SMc00171的活性的双- 对 硝基苯磷酸酯

从大肠杆菌获得的无细胞提取物大肠杆菌 BL21（DE3）×pLysS中，其中有smc00171表达，进行了研究它们对水解二- 对硝基苯基磷酸酯的能力，使用分光光度酶促测定法中，测量形成p -NP。没有水解活性是存在于从大肠杆菌获得的无细胞提取物大肠杆菌 BL21（DE3）×pLysS中携带一个空pET9a矢量双- 对硝基苯磷酸盐作为底物时（数据未显示）。

为形成p -NP时间的课程表明存在.......

讨论

在过去的20年中，许多生物基因组研究已经被测序，虽然丰富的基因组序列数据已经产生，功能解释相对滞后，因此阻碍了我们的基因组功能的认识。在基因组中的基因功能的基础上相似已知功能或保守的基序的发生基因经常被分配。然而，给定基因的精确功能往往不是公知的。尤其，预计酶的结构基因不能由组学技术容易地探索由于这样的事实，大部分酶催化涉及两个基板和两个产品的复杂的反应。目前，似乎更可行，其中至少一个基底是固定的，其中，其他的都可以改变，以探索对酶的基团的底物特异性。例如，在真核生物中的蛋白质大部分磷酸化基序是公知的并用于激酶共识肽已被以生成肽芳发现在固体载体射线。使用这样的阵列和放射性标记的ATP，底物特异性和生物体的不同激酶的活性水平可以测定允许建立一个激酶组轮廓和限定底物特异性^24。水解酶构成的另一大组酶对其中一个基板，水，是固定的，但对于其中待水解的其它底物的确切性质往往是未知的。对于一个新的酶的最佳测定条件没有或者是已知的事实，转换在一个多变量问题的新的酶活性的检测。因此，它可以帮助，以便能够固定衬底，以便限定在什么条件下酶的效果最好待水解。

在本手稿中，我们描述的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯仿	JT Baker	9180-03	TLC 分析 &脂质提取
甲醇	JT Baker	9070-03	TLC 分析和脂质提取
乙酸	JT Baker	9507-05	TLC 分析 &脂质提取
己烷	JT Baker	9309-02	TLC 分析和脂质提取
Diethylether	Sigma	32203	酶法测定
双蒸水	安&	nbsp;NA	酶法测定
Tris 碱	基 Sigma	T-1503	酶法测定
HCl	Baker	9535-02	酶法测定
NaCl	Baker	3624-01	酶法测定
Triton X-100	Sigma	X-100	酶法测定
LB 肉汤	任何	NA	细菌生长，每 10 克胰蛋白胨 + 5 克酵母提取物 + 10 克氯化钠升双蒸水
胰蛋白胨	Becton Dickinson and Company	211705	细菌生长
酵母提取物	Becton Dickinson and Company	212750	细菌生长
TY 肉汤	ANY	NA	细菌生长，8 克胰蛋白胨 + 3 克酵母提取物 + 66 毫克 CaCl2·每升双蒸水 2H2O
CaCl2·2H2O	Baker	1332-01	酶法测定
异丙基-β;-D-硫代半乳糖苷 （IPTG）	Invitrogen	15529-019	细菌生长
二乙醇胺	Sigma	D-8885	酶测定
MnCl2	Sigma	221279	酶测定
磷脂酶 A2 蛇毒液	Sigma	P0790	酶测定
磷脂酶 C 产气荚膜梭菌	Sigma	P7633	酶测定
Bis-p-硝基苯磷酸酯	Sigma	07422AH	酶测定
p-硝基苯硬脂酸	Sigma	N3627	酶测定
p-硝基苯酯	Sigma	61716	酶法测定
p-癸酸硝基苯酯	Sigma	N0252	酶法测定
p-棕榈酸硝基苯	Sigma	N2752	酶法测定
p-丁酸硝基苯酯	Sigma	N9876	酶法测定
p-硝基苯基辛酸酯	Sigma	21742	酶法测定
乙酸钠 [1-14C]	Perkin Elmer	NEC084	细菌生长
二甲基亚砜 （DMSO）	JT Baker	9224-01	酶法测定
铝 HPTLC 硅胶 60 板。硅胶 HPTLC 板尺寸为 20 x 20 cm，25 张。	默克	105547	TLC 分析 &脂质提取
光谱仪 紫外可见分光光度计 Lambda 35	Perkin Elmer	NA	酶法测定
Storm 820 磷光成像仪	分子动力学	NA	光刺激发光扫描仪
多用途闪烁计数器	Beckman Coulter	NA	放射性定量
法国压力单元	ThermoSpectronic	NA	细胞破裂
色谱试纸 3MM Chr	Whatman	3030917	TLC 分析
Sinorhizobium meliloti1021我们的	参考文献 11		研究的菌株
大肠杆菌 BL21 （DE3） pLysS 感受态细胞	Novagen	69451	蛋白表达菌株
pET9a 载体	Novagen	69431	蛋白表达载体
pET17b 载体	Novagen	69663	蛋白表达载体
无菌聚苯乙烯圆底管 （14 ml） Falcon	Becton Dickinson	352057	细菌培养物的放射性标记
聚丙烯微量离心管 （1.5 ml）	Eppendorf	30125.15	酶测定
1,2-二棕榈酰-sn-甘油	Sigma	D9135	脂质标准品
L-&α;-磷脂酰胆碱、二棕榈酰	Sigma	P6267	脂质标准品
DL-&α;-单棕榈酸	Sigma	M1640	脂质标准品
棕榈酸	Sigma	P0500	脂质标准