定义脂肪酶和磷脂酶候选物的底物特异性

摘要

许多预测的（磷酸）脂酶在底物特异性和生理功能方面表征尚不充分。本文提供了一种优化酶活性、寻找天然底物并推断这些酶生理功能的实验方案。

摘要

微生物产生多种多样的（磷）脂酶，这些酶被分泌到胞外，以使外部底物能够被生物体利用。此外，其他一些（磷）脂酶可能与产生它们的生物体在物理上相关联，导致内源性脂质的转化，并常常引发细胞膜的重塑。尽管在已知基因/蛋白质序列的情况下，可通过多种算法预测潜在的（磷）脂酶，但这些酶的活性、底物特异性以及可能的生理功能往往尚未通过实验验证。本文描述了针对底物特异性未知的候选（磷）脂酶优化酶活性检测条件的方法，并介绍了如何利用这些优化后的条件来寻找特定（磷）脂酶的天然底物。使用人工显色底物（如p-硝基苯基衍生物）可能有助于在标准条件下检测预测的（磷）脂酶是否存在微弱的酶活性。一旦发现此类微弱酶活性，便可系统地调整酶反应体系中的各项参数，以提高对人工底物的水解效率。在确定酶高效作用的反应条件后，应检测多种潜在天然底物是否可被降解，该过程可通过不同的色谱方法进行监测。明确新酶的底物特异性通常可为推测其潜在的生理功能提供假说，随后可通过实验加以验证。遵循这些方法，我们成功鉴定出一种磷脂酶C（SMc00171），该酶可在磷缺乏的生长条件下，介导根瘤菌Sinorhizobium meliloti细胞膜重塑过程中的关键步骤，即将磷脂酰胆碱降解为磷酸胆碱和二酰甘油。对于同一种生物体内另外两种预测的类patatin磷脂酶（SMc00930和SMc01003），我们重新定义了它们的底物特异性，并证实SMc01003是一种二酰甘油脂酶。

引言

甘油酯类脂质，如三酰甘油和（甘油）磷脂，是重要且可能是最为人熟知的脂质类别¹。三酰甘油（TAGs）是脂肪或油类，通常作为储存型脂质，发挥潜在的能量和碳源作用。TAGs 可被脂肪酶降解，而脂肪酶通常由产生该酶的生物体分泌，用于消化外源性 TAGs，使其可作为碳源利用。此外，由于脂肪酶具有重要的生物技术应用价值，多年来已得到广泛研究²。

由于其两亲性以及近似圆柱形的结构，（甘油）磷脂具有形成膜的特性，通常构成双层膜的主要脂质成分³在简单的微生物中，例如细菌 大肠杆菌，仅存在三种主要的头部基团变体：磷脂酰甘油（PG）、心磷脂（CL）和磷脂酰乙醇胺（PE），尽管需要注意的是，每种头部基团在甘油骨架上均可连接大量不同的脂肪酰链 sn-1 或 sn-2 位产生大量不同的分子种类⁴其他细菌可能含有其他磷脂，或以其他磷脂替代。例如， Sinorhizobium meliloti一种土壤细菌，能够与豆科植物苜蓿形成固氮根瘤共生关系（Medicago sativa)，除PE外还含有第二种两性离子磷脂磷脂酰胆碱（PC）⁵此外，不含磷或甘油的脂质也可能具有两亲性，并构成细胞膜的一部分。例如，在磷限制的生长条件下， S. meliloti，（甘油）磷脂在很大程度上被不含磷的膜脂所取代， ....

方案

1. 克隆并过表达预测脂肪酶的结构基因

1. 使用聚合酶链式反应（PCR）¹⁴ 以及特异性寡核苷酸（表1)¹⁵，扩增目的基因（smc01003, smc00930，或 smc00171），预计编码一种脂肪酶或磷脂酶，源自该宿主生物体的基因组DNA（即， S. meliloti).
   1. 引入特定的限制性酶切位点（根据设计的寡核苷酸序列）。用相应的限制性内切酶消化扩增的DNA片段，并将其克隆至表达载体中，例如pET系列质粒。¹⁶.
   2. 在确认克隆基因的正确DNA序列后，将载体转化至表达菌株，例如 大肠杆菌 BL21(DE3) pLysS¹⁶.
2. 制备表达宿主的过夜预培养物 E. coli BL21(DE3) pLysS，携带含克隆基因的相应pET载体或空载体，在含有20 ml LB液体培养基（Luria Bertani broth）的100 ml培养瓶中¹⁷ 以及所需的抗生素。将细胞在30℃下培养 °C（或脂肪酶来源细菌的通常生长温度）。
   1. 使用过夜预培养物，将500 ml预热的LB培养基（含所需抗生素）接种于2 L培养瓶中，使初....

结果

PC特异性磷脂酶C SMc00171与双-p-硝基苯基磷酸酯的活性

从无细胞提取物中获得 E. coli BL21(DE3) x pLysS，其已 smc00171 表达的酶被研究了其水解双-p-硝基苯基磷酸酯，采用分光光度法酶学检测，测定其水解产物 p-NP 形成。从无细胞提取物中未检测到水解活性 E. coli BL21(DE3) x pLysS 携带空 pET9a 载体（数据未显示）时的双-p以对硝基苯磷酸作为底物。

时间进程 p-NP 的形成表明，其产量对无细胞提取物的用量具有显著依.......

讨论

在过去的20年中，许多生物体的基因组已被测序，尽管已产生了大量的基因组序列数据，但功能注释却相对滞后，从而阻碍了我们对基因组功能的理解。基因组中基因的功能通常基于与已知功能基因的相似性或保守基序的存在来推断。然而，特定基因的精确功能往往仍不清楚。特别是对于预测为编码酶的结构基因，由于大多数酶催化的反应涉及两种底物和两种产物，因此难以通过组学技术进行有效研究。目前，更可行的方法是研究那些至少有一种底物固定、而另一种底物可变的酶类群的底物特异性。例如，在真核生物中，大多数蛋白质的磷酸化基序已被明确，已将激酶的共识肽段固定在固相载体上以制备肽阵列。利用此类阵列和放射性标记的ATP，可测定某生物体中不同激酶的底物特异性和活性水平，从而建立激酶组谱型并确定其底物特异性²⁴。水解酶是另一大类酶，其一种底物（水）是固定的，但被水解的（另一种）底物的具体性质通常尚不明确。此外，对于一种新酶而言，其最适检测条件往往也未知，这使得新酶活性的检测成为一个多变量问题。因此，若能将被水解的底物固定下来，将有助于确定该酶在何种条件下发挥最佳活性。

在本论文中，我们描述了针对底物特异性未知.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯仿	JT Baker	9180-03	薄层色谱分析 &脂质提取
甲醇	JT Baker	9070-03	薄层色谱分析 &和脂质提取
乙酸	JT Baker	9507-05	薄层色谱分析 &和脂质提取
己烷	JT Baker	9309-02	薄层色谱分析 &和脂质提取
乙醚	Sigma	32203	酶学检测
双蒸水	任意	NA	酶学测定
Tris碱	Sigma	T-1503	酶学测定
HCl	贝克	9535-02	酶学检测
NaCl	贝克	3624-01	酶活性测定
Triton X-100	Sigma	X-100	酶学检测
LB肉汤	任意	NA	细菌生长，每升双蒸水中加入10 g胰蛋白胨 + 5 g酵母提取物 + 10 g NaCl
胰蛋白胨	贝克顿·迪金森公司	211705	细菌生长
酵母提取物	贝克顿·迪金森公司	212750	细菌生长
TY肉汤	任意	NA	细菌生长，8 g 胀蛋白胨 + 3 g 酵母提取物 + 66 mg CaCl₂2·2H2每升双蒸水
CaCl2·2H2O	贝克	1332-01	酶学检测
异丙基-β异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）	Invitrogen	15529-019	细菌生长
二乙醇胺	Sigma	D-8885	酶学检测
MnCl2	Sigma	221279	酶学检测
磷脂酶A2 蛇毒	Sigma	P0790	酶学测定
磷脂酶C 产气荚膜梭菌	Sigma	P7633	酶学检测
双-p硝基苯磷酸盐	Sigma	07422AH	酶学检测
p对硝基苯基硬脂酸酯	Sigma	N3627	酶学测定
p对硝基苯十二酸酯	Sigma	61716	酶学检测
p对硝基苯基癸酸酯	Sigma	N0252	酶学检测
p对硝基苯基棕榈酸酯	Sigma	N2752	酶学检测
p对硝基苯丁酸酯	Sigma	N9876	酶活性测定
p对硝基苯基辛酸酯	Sigma	21742	酶学检测
乙酸，[1-标记]钠盐14C]	Perkin Elmer	NEC084	细菌生长
二甲基亚砜（DMSO）	JT Baker	9224-01	酶学测定
铝箔背衬高效薄层色谱硅胶60板。硅胶高效薄层色谱板，规格20 cm × 20 cm，25片/盒。	默克	105547	薄层色谱分析 &和脂质提取
紫外/可见分光光度计 Lambda 35	Perkin Elmer	NA	酶学检测
Storm 820 磷光成像仪	分子动力学	NA	光激励发光扫描仪
多功能闪烁计数器	贝克曼库尔特	NA	放射性定量
French压滤细胞器	ThermoSpectronic	NA	细胞破碎
3MM Chr 层析纸	Whatman	3030917	薄层色谱分析
Sinorhizobium meliloti 1021小时	参考文献11		研究菌株
大肠杆菌 BL21 (DE3) pLysS 感受态细胞	Novagen	69451	蛋白表达菌株
pET9a 载体	Novagen	69431	蛋白表达载体
pET17b 载体	Novagen	69663	蛋白表达载体
无菌聚苯乙烯圆底试管（14 ml）Falcon	Becton Dickinson	352057	细菌培养物的放射性标记
聚丙烯微量离心管（1.5 ml）	Eppendorf	30125.15	酶学检测
1,2-二棕榈酰-sn-甘油	Sigma	D9135	脂质标准品
L-α-磷脂酰胆碱，二棕榈酰	Sigma	P6267	脂质标准品
DL-α单棕榈酸甘油酯	Sigma	M1640	脂质标准品
棕榈酸	Sigma	P0500	脂质标准品