本文介绍了一种用于检测TMEV感染小鼠进行性神经功能障碍的优化型Rotarod性能测试方案。
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摘要
摘要
在通过脑内感染Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus（TMEV）后，易感的SJL小鼠会发展为一种慢性进行性脱髓鞘疾病，其临床特征与多发性硬化症（MS）的进行性类型相似。小鼠表现出进行性功能障碍，伴随运动和感觉功能的丧失，可通过多种仪器和方案进行评估。其中，转棒实验（Rotarod performance test）是一种非常常见的行为学检测方法，其优势在于能够提供客观的测量结果，但该实验常被误认为操作简单直接。与某些MS模型中使用的一些高度主观的视觉评分系统相比，转棒实验可产生客观、可量化、连续的变量（即持续时间），从而实现近乎完美的评分者间一致性。然而，只有在各实验室之间复制相同的测试参数时，才能实现跨实验室的可靠性。本文针对转棒实验，提出了关于具体测试参数的建议，包括转棒的尺寸、转速和加速度；对动物的训练次数；以及数据处理方法。
引言
鼠脑心肌炎病毒（Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus, TMEV）是一种嗜神经性的单链RNA病毒，可在小鼠中枢神经系统（CNS）中持续感染。在易感小鼠中，TMEV感染会引发一种由免疫介导的慢性进行性脱髓鞘疾病，称为TMEV诱导的脱髓鞘疾病（TMEV-IDD）。小鼠的实验性感染病程与多发性硬化症（MS）的进行性类型相似。TMEV-IDD具有两个明显不同的阶段：急性期和慢性期。急性期表现为轻度、通常为亚临床的脑炎1,2。第二个阶段即慢性期，通常在感染后约一个月开始，其特征是缓慢进展的功能障碍，伴随脱髓鞘、炎症和轴突损伤1,2。小鼠表现出的虚弱常伴有痉挛，偶尔还会出现严重的强直性痉挛。
由于目前尚无药物能够改善患者的进行性残疾，研究人员对TMEV-IDD尤为关注，该模型是监测疾病修饰药物对疾病进展影响的理想动物模型。然而，无论是在小鼠还是多发性硬化症患者中，残疾进展的监测都需要长期持续的临床观察。在小鼠中，可通过转棒性能测试实现对残疾进展的长期监测。
转棒实验是一种标准的行为学测试，用于评估啮齿类动物与运动相关的功能，如协调性、平衡能力和疲劳程度。小鼠需在一根持续加速旋转的转棒上保持平衡，记录其从转棒上掉落的时间潜伏期。神经系统功能障碍的动物无法像对照组动物一样长时间停留在转棒上，当转速超过其运动能力时，通常会提前掉落。动物的神经功能损伤越严重，掉落得越早，时间潜伏期也越短。
与传统的视觉评分系统相比，转棒实验的优势在于其能够产生一个客观且可测量的变量——时间潜伏期——该变量最终可用于统计分析，以量化治疗和实验操作的效果3。
在达特茅斯学院的神经免疫学实验室（LONI）中，小鼠需接受适应性训练方案，在感染TMEV之前进行测试，以使其熟悉仪器操作，并评估其正常的"基线"平衡协调能力与运动控制能力4,5。在确定基线值后，小鼠被感染TMEV，并在随后数月内每周测试一至两次。实际测试方案平均持续150天，从而可在整个脱髓鞘疾病病程中系统评估平衡能力、协调能力及运动控制能力的进行性下降情况。
迄今为止，在达特茅斯已有数百只TMEV-IDD模型小鼠和假手术处理的小鼠接受了神经功能障碍检测。这些小鼠曾接受过多种免疫调节治疗，但尚未发现任何药物能够有效缓解其残疾的进展6,7。本文及相关实验方案描述了如何表征TMEV-IDD小鼠所表现出的进行性神经功能损害。特别是，该方案提供了特定测试参数的建议，这些参数被认为通常适用于利用转棒实验研究TMEV-IDD小鼠的神经功能障碍。此方法可为评估以下两方面提供基线依据：（1）该小鼠模型与进行性多发性硬化症（MS）的相关性；（2）其在测试针对MS等进行性神经疾病疗法中的应用价值。显然，转棒实验以及当前优化的测试参数和操作流程不仅有助于检测TMEV-IDD小鼠模型中的进行性神经功能障碍，还可用于发现其他病毒诱导和/或遗传性神经退行性疾病小鼠模型中的功能损害。
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方案
所有动物实验均采用达特茅斯盖泽尔医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）审查并批准的方案。
1. 小鼠模型
- 诱导TMEV致脱髓鞘疾病
- 将饲养4至6周龄雌性SJL/JHan小鼠的笼子从架子转移到便于操作的工作区域。对小鼠进行标记（例如，使用耳标或耳缘穿孔），以便对每只小鼠的临床表现和组织病理学病变进行个体化评估。
- 用29号胰岛素注射器和针头吸取30 μl TMEV感染原液（2 × 106 空斑形成单位；PFU），溶于PBS中。
- 准备麻醉气体设备：检查系统，确保在整个操作过程中有足够的氧气和异氟烷供应。
- 打开流量计至1 L/min。将动物放入诱导室并密封顶部。开启蒸发器至3.5%，持续观察动物直至其呈侧卧状态。
- 将动物从诱导室中取出，通过轻捏足垫测试麻醉深度。若对强烈刺激无反应，则表明麻醉充分。
- 用70%异丙醇清洁注射部位。
- 通过徒手注射法将30 μl TMEV感染原液注入右侧大脑半球（图1）。注射位点位于眼与耳连线中点附近，稍偏离中线。
- 待小鼠完全清醒并能够自主活动后（通常为3–5分钟），将其放回饲养笼中。
- 根据疾病发展速度，在TMEV感染后3至6个月通过放血法或心脏灌注法处死小鼠。
2. 转棒分析
- 转棒仪装置
- 在感染TMEV之前对小鼠进行测试，以使其熟悉仪器，并评估其正常的基线平衡协调能力和运动控制。
- 从感染后第-5天（dpi）开始适应性方案； 即， TMEV感染前5天
- 让小鼠在转棒实验前至少在测试室内适应30分钟，以使其适应环境。
- 确保转棒仪主机和计算机均已接通电源并相互连接（图2).
- 预先将转棒仪设置为 -5 dpi 训练方案参数，具体如所述 表1.
- 使用日期和标识信息保存工作文件。
- 将装有待测小鼠组的笼子从架子上移至旋转棒仪旁边的桌子。通常每组4只小鼠进行测试。
- 用镊子夹住小鼠尾巴，将其放置于转棒上，使小鼠背对操作者。对第二至第四只小鼠重复此操作。若某只小鼠掉落或跳下，应将其重新放回转棒上的原位置，直至所有小鼠均处于正确位置。若小鼠转身面向操作者，可忽略此行为。
- 加载完所有小鼠后，按下 "进入" 点击按钮开始实验。观察各通道的计时器自动启动，并显示每分钟转数（rpm）。
- 当每只动物从转棒上跌落时，记录其跌落时刻转棒的转速以及动物在转棒上停留的持续时间。转棒将持续旋转，直至最后一只动物从转棒装置上跌落。
- 所有小鼠跌落后，使用纸巾清除转棒上的粪便和尿液。尿液和粪便的存在可能影响小鼠对转棒的抓握能力。
- 休息3分钟后，给予小鼠第二次试验，随后进行第三次试验。每次试验最长持续时间为240秒。每次测试日共进行3次试验。
- 将小鼠放回其饲养笼，并将其放回笼架。实验结束后，用肥皂和水清洁旋转棒仪器，以清除设备上的所有粪便残留物。
- 用70%乙醇擦拭基板以清洁。用二氧化氯喷洒整个设备进行消毒。
- 在感染后第 -4、-3、-2 和 -1 天，按照所述方法将旋转杆仪预设为相应的训练程序参数 表1，重复步骤 2.1.2 至 2.1.12。
- 在获得基线测量值后，用TMEV感染小鼠，并给予6天的感染后恢复期。
| 实验方案 | 测试日期 | 频率 | 起始速度 (rpm) | 最大速度 (rpm) | 加速度 | 试验次数 | ITI |
| (rpm/sec) | (N × sec) | (min) | |||||
| 训练阶段 | -5 天（d.p.i） | 每日 1 次 | 1 | 12 | 01/03 | 3 × 240 秒 | 3 |
| -4 天（d.p.i） | 每日 1 次 | 1 | 13 | 01/03 | 3 × 240 秒 | 3 | |
| -3 天（d.p.i） | 每日 1 次 | 1 | 14 | 01/03 | 3 × 240 秒 | 3 | |
| -2 天；-1 天（d.p.i） | 每日 1 次 | 5 | 40 | 01/03 | 3 × 240 秒 | 3 | |
| 实验阶段 | +7 至 +50 天（d.p.i） | 每周 2 次 | 5 | 40 | 05/30 | 3 × 240 秒 | 3 |
| +51 至 +150 天（d.p.i） | 每周 1 次 | 5 | 40 | 05/30 | 3 × 240 秒 | 3 |
表1：训练和实验方案中的转棒参数。
- 转棒实验方案
- 在接种后第7天（+7 dpi），按照表1中所述设置转棒仪的实验参数。重复执行步骤2.1.2至2.1.10。
- 第3次试验结束后，称量每只小鼠的体重，并在数据表中记录体重数值。按照步骤2.1.11和2.1.12清洁并消毒转棒仪。
- 在接下来的6周内，每周测试小鼠两次，方法如上所述。6周后（此时小鼠可能已进入平台期）8,9，改为每周使用相同的实验方案测试一次。整个实际测试过程平均持续150天，具体时长取决于疾病进程。
- 神经功能指数
- 将原始数据导出至电子表格文件，并分析结果。
- 以跑步时间表示数据（图3A）：即正常跑步时间加上被动旋转时间，减去旋转延迟时间（表2）10。计算每天三次试验的平均跑步时间。
- 以神经功能指数（NFI；图3B）表示数据。
- 计算每只小鼠的基线性能阈值。基线性能阈值定义为接种后第15天至第45天（pi）所有跑步时间的平均值6,7。
- 将NFI计算为最近三次平均跑步时间的均值除以该小鼠的基线性能阈值6,7。
注：若某小鼠在接种后第72、76和79天的测试跑步时间分别为55秒、45秒和50秒，且该小鼠的基线时间为135秒，则该小鼠在+79 dpi时的NFI为[(45+50+55)/3]/135，即0.37。
- 以校正后的NFI（adjNFI；图3C）表示数据：通过单次实验的群体值对NFI数据进行校正。
- 通过将NFI值除以假手术组在特定日期获得的平均NFI来计算adjNFI。
| 术语 | 定义 |
| 正常跑步时间 | 小鼠在旋转杆上主动奔跑的总时间，i.e.，跌落潜伏期。 |
| 被动旋转时间 | 小鼠在被动旋转模式下停留在杆上的时间长度。 |
| 旋转延迟时间 | 小鼠在被动旋转模式下停留在杆上的时间长度。 |
| 被动旋转模式 | 当小鼠抓住旋转杆并随其转动而无需主动行走时的状态。 |
| 总实验时长 | 在实验过程中，小鼠停留在旋转杆上的总时间。 |
| 基线表现 | 损伤前评估的运动功能，用于确定最低表现阈值。 |
| 神经功能指数 (NFI) | 临床指数，用于将每只小鼠在任意时间点的运动表现（i.e., 跑步时间）与其峰值表现进行比较。 |
| 校正神经功能指数 (adjNFI) | 通过将单次实验的 NFI 数据以群体值进行标准化处理后得到的调整值。 |
| 群体值 | 假手术组在特定时间点获得的平均 NFI 值。 |
表2：用于量化神经功能障碍的旋转棒参数定义。
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结果
本代表性实验的目的是比较由TMEV的Daniels（DA）株和BeAn株所诱导的神经功能障碍。为本研究目的，将32只雌性SJL小鼠分为两组，分别经颅内接种TMEV的DA株（n = 16）或BeAn株（n = 16），并随时间监测其临床症状。另设一组20只小鼠进行假处理（即， 生理盐水通过颅内注射）作为健康对照组。
采用转棒性能测试评估TMEV感染小鼠及假手术对照组的慢性疾病进展。小鼠经个体耳标标记后，在注射TMEV前一周内每日进行适应性训练，随后进入持续125天的实际测试阶段。在每次测试日，记录每只小鼠在转棒上的停留时间（定义为单次测试中保持在棒上的时长），并以当日3次试验的平均值单独保存。转棒数据还以NFI及假手术组归一化的adjNFI形式表示。
如图所示 图3A，TMEV感染对...
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讨论
尽管存在一些局限性，转棒性能测试仍是评估TMEV-IDD中运动功能及功能障碍的重要工具，也可用于评估药物干预对小鼠残疾进展的影响。
Rotarod 实验最早于1957年被描述为一种用于测量啮齿类动物神经功能缺损的工具11。实验中，啮齿类动物需在一根旋转杆上行走，旋转速度逐渐增加，并尽力避免跌落至地面。记录动物从杆上跌落的潜伏期，并将其作为运动功能的定量终点指标：动物的神经功能损害越严重，其跌落时间越早。与传统的视觉评分系统相比，该实验的明显优势在于能够产生一个可用于统计分析的客观变量，从而量化治疗手段和实验操作对功能障碍进展的影响3。诸如翻正反射测试等视觉评分系统可能因其操作更简单、检测更快速而在评估小鼠运动能力时被优先选用。然而，这些系统缺乏 Rotarod 性能测试等定量方法所具备的精确性，因此不适用于监测具有轻度且进行性神经功能损害的小鼠的自然病程或表型变化。另一方面，像翻正反射测试这样的视觉检测方法特别适用于年龄过小或病情过重而无法在 Rotarod 上进行测试的小鼠。
为了...
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披露
作者无任何利益冲突披露。
致谢
作者感谢达特茅斯比较医学与研究中心（CCMR）工作人员在本研究中对小鼠的精心护理。作者还感谢 Emily Clough 提供出色的行政支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4至6周龄SJL/JCrHsd小鼠 | Envigo | #052 | |
| TMEV病毒原液 | |||
| 异氟烷蒸发器 | Harvard Apparatus | #340471 | |
| 胰岛素注射器 U-100 29G × 0.5 cc | BD | #328203 | |
| Rotamex-5 四通道小鼠转棒仪，带RS-232接口和软件 | Columbus Instruments | #0890M |
参考文献
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