方法文章

体内小鼠基质凝胶栓塞实验研究人源内皮细胞-周细胞相互作用

9.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/54617

⸱

2016年12月19日

 ,  ,  , 
1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, School of Medicine, Stanford University, 2Stanford Cardiovascular Institute, School of Medicine, Stanford University, 3VA Palo Alto Health Care System, Department of Cardiothoracic Surgery, School of Medicine, Stanford University

本文内容

摘要

我们介绍了一种利用基质凝胶栓塞血管生成实验的改良方法，在小鼠体内研究人源内皮细胞与周细胞相互作用的实验方案。

摘要

血管生成是指由现有血管形成新血管的过程。新生血管的生长需要内皮细胞的增殖、迁移和排列协调进行，以形成管状结构，随后募集周细胞以提供壁层支持并促进血管成熟。目前 体外 细胞培养方法无法完全重现内皮细胞与周细胞相互作用形成功能性血管的复杂生物学环境。我们提出了一种新型的应用方案 体内 基质凝胶栓塞实验用于研究内皮细胞与周细胞的相互作用以及功能性血管的形成，采用重度联合免疫缺陷突变型（SCID）小鼠。简言之，将基质凝胶与含有内皮细胞（可选择性加入周细胞）的溶液混合，随后注射至麻醉状态下的SCID小鼠背部。14天后，取出基质凝胶栓，固定并切片进行组织学分析。可通过商用统计平台对各实验组之间成熟血管（以管腔内存在红细胞为定义标准）的长度、数量、大小以及周细胞覆盖程度进行量化和比较。除作为血管生成实验手段外，该基质凝胶栓塞实验还可用于遗传学研究及作为药物发现的平台。综上所述，本方案将使研究人员能够补充现有 体外 用于研究内皮细胞-周细胞相互作用及其在全身性或肺部血管生成中相关性的检测方法。

引言

血管生成是指从已有的血管网络形成新血管的过程1，是当前从正常发育到疾病等多个研究领域关注的重点。这一动态过程包括内皮细胞（ECs）的增殖与迁移，以及周细胞的募集，从而构建出朝向需要氧气和营养供应部位的血管管腔2。研究这一过程需要一种同样具有动态性的检测方法，最重要的是能够重现血管管腔形成的三维特性。体外三维基质检测技术已被开发以满足这一需求，并已成功帮助研究人员明确血管生成在时空上的各个独立步骤3,4,5,6。然而，这些体外三维基质模型仅限于研究非灌注性血管，因此缺少与血管生成过程相关的关键组分（例如，循环中的促生长和抑制因子、血管床所受的非生理性张力/作用力），且无法模拟活体组织中存在的复杂环境。为克服这一局限，已开发出多种体内血管生成检测方法7，其中包括基质凝胶栓塞检测法，这将是本报告的重点8,9。

基质凝胶栓塞实验是一种成熟的体内血管生成检测方法，因其能够提供一个可靠的平台来评估不同细胞和物质在血管生成中的作用，而受到研究人员的青睐。基质凝胶是一种市售的基底膜溶液，由Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤细胞系分泌，在37 °C下可固化为凝胶状物质。该基质凝胶可与细胞和/或生长因子等物质混合后皮下注射至小鼠体内。在14天内，宿主的内皮细胞（ECs）将侵入凝胶栓，形成血管网络，并被宿主血液灌注。迄今为止，基质凝胶栓塞实验主要集中于研究血管生成过程中内皮细胞的行为；然而，据我们所知，目前尚未有研究尝试利用该实验共培养内皮细胞和周细胞，以探讨这两种细胞类型在血管生成过程中的相互作用。具体而言，深入理解ECs与周细胞之间的关系，对于研究以血管丢失为病理特征的疾病具有重要意义，包括微血管缺血和外周血管疾病10,11,12。

本文描述了一种实验方案，即将人源周细胞与人内皮细胞（ECs）及成纤维细胞生长因子（bFGF）一同加入基质凝胶混合物中。该混合物可皮下注射至SCID小鼠背部，以促进形成具有周细胞包被的完全功能性杂合血管。本方案详细说明了如何制备含有或不含人周细胞的人内皮细胞基质凝胶栓，将其植入SCID小鼠体内，并对组织学切片进行分析，以评估关键的血管生成终点指标。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

伦理声明：涉及动物受试者的实验程序已获得斯坦福大学医学院机构动物护理和使用委员会的批准。

注意：动物使用 3% 气化异氟烷和 3% 氧气供应进行麻醉2 气体。使用兽用眼膏可能有助于防止麻醉期间眼睛干涩。

1. 细胞准备

  1. 在100 mm培养皿中，使用10 ml适当的培养基培养人内皮细胞和周细胞。每2-3天更换10 ml新鲜培养基，直至细胞达到80%融合度。
    1. 将内皮细胞（ECs）培养于完全内皮细胞培养基（ECM）中，该培养基需添加厂家提供的5%胎牛血清（FBS）、10%青霉素/链霉素和10%内皮细胞生长补充剂。
    2. 将周细胞培养于完全周细胞培养基（PM）中，该培养基需添加厂家提供的2% FBS、10%青霉素/链霉素和10%周细胞生长补充剂。
  2. 制备细胞混合物
    1. 计算实验组和对照组所需的细胞数量。
      注：实验组每个凝胶栓包含一百万个（1 × 106）人内皮细胞和二十万个（2 × 105）周细胞。对照组每个凝胶栓仅包含120万个内皮细胞。阴性对照组仅含基质凝胶。每组应至少包含四个凝胶栓，因此需要两只小鼠，因为每只小鼠的下背部两侧均可注射凝胶栓。三个凝胶栓用于实验的三重复，第四个可作为备用以防失败。额外准备25%的细胞以匹配凝胶的额外体积。
    2. 从培养皿中收集细胞并进行计数。
      1. 为使细胞脱落，移除培养基，用室温的1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次，弃去PBS，加入1 ml 0.25%胰蛋白酶/2.21 mM EDTA，孵育1分钟，再加入2 ml培养基将细胞从培养皿上冲洗下来，并收集至15 ml离心管中。
      2. 按照制造商说明书，使用血细胞计数板对细胞进行计数。
      3. 将所需数量的细胞在400 × g离心5分钟，形成细胞沉淀。对于实验组，将内皮细胞和周细胞一同离心，形成单一沉淀。

2. 基质胶制备

  1. 在 4 °C 下完全解冻基质胶 4 小时或过夜，以获得均一溶液。无需混合。
  2. 将基质胶分装至 1.5 ml 离心管中，并在 4 °C 下保存。
  3. 将无菌 1.5 ml 离心管和 28 G 1 cc 胰岛素注射器预冷至 4 °C。注意：基质胶必须始终置于冰上。
  4. 将冷的基质胶与 bFGF 按体积比 1:100 混合（bFGF 终浓度 = 0.5 μg/ml；bFGF 储存液浓度 = 50 μg/ml）。用移液器反复吹打数次使基质胶溶液混匀后，在进行步骤 3.1 与细胞混合前，于冰上孵育 30–60 分钟。
    注意：混合前需先解冻 bFGF 储存液。计算注射所需的凝胶块数量。例如，每个凝胶块需要 200 μl 基质胶，因此应额外准备 25% 的量。

3. 将基质胶与细胞混合

  1. 对于每组，用含有 bFGF 的计算体积基质凝胶重悬细胞沉淀（含适当数量的细胞）。轻轻混匀以避免产生气泡，并将混合物置于冰上的 15 ml 离心管中，直至小鼠准备好进行注射。

4. 小鼠准备

  1. 麻醉 1 在3%异氟烷加3%氧气中麻醉SCID小鼠5分钟2 在诱导室中。每次集中处理一个实验组，或两只小鼠。
  2. 移除 将小鼠从诱导室中取出，腹侧朝下置于加热垫上，并通过非重复呼吸系统迅速将鼻罩连接至小鼠面部，以在整个注射过程中持续供给麻醉气体。将气流从诱导室切换至非重复呼吸系统，并将气体浓度调低至1.5%异氟烷和1.5%氧气。2.
  3. 用剃须刀或脱毛膏去除两侧后肢区域的毛发（直径约1 cm）。
  4. 用70%酒精棉片擦拭皮肤区域。
  5. 将小鼠放回诱导室，并对第二只小鼠重复步骤 4.2 - 4.4。

5. 基质凝胶注射

  1. 将一只小鼠连接至非再呼吸系统，腹侧朝下放置于加热垫上，以备注射。
  2. 将基质胶加载到预冷的28 G 1 cc胰岛素注射器中，每只小鼠一份 一次。
    1. 加载完整的 500 μl 两种基质凝胶的体积 将凝胶塞（每塞200 μl，另加25%额外量）吸入注射器中。
    2. 确保在将细胞加入注射器后3分钟内将基质凝胶注射到小鼠体内，以防止细胞沉降到注射器侧壁以及基质凝胶在注射器内凝固。
  3. 提起背部皮肤以暴露皮下间隙，然后将200 μl基质凝胶缓慢且均匀地注射至肋骨后方背部的皮下间隙中。
  4. 缓慢取出注射针，注意防止基质胶从注射部位渗出。注射部位将形成一个小隆起。用酒精棉片擦拭注射部位。
  5. 在小鼠背部另一侧重复步骤 5.2–5.5，然后将小鼠仰卧放置于加热垫上 1 分钟，使基质胶完成凝胶化。
  6. 用永久性记号笔标出两个隆起部位的轮廓，以便在14天后识别隆起部位。待部分毛发重新生长后，将更容易找到该隆起区域。

6. 基质凝胶栓塞物的分离：注射后14天

  1. 以人道方式处死小鼠，将动物暴露于 >吸入5分钟二氧化碳后行颈椎脱位以确保死亡。
  2. 从小鼠背部取出基质凝胶塞。
    1. 轻轻重复步骤 4.3，去除注射部位周围重新生长的毛发，该区域即为塞子所在位置。标记线指示皮下原始隆起的大小。
    2. 沿柱塞周围切下其上下两侧附着的皮肤和肌肉层。
      1. 使用精细的手术剪，在栓塞标记边界处垂直于皮肤做一切口，并切割至栓塞下方的肌肉层。随后，沿标记边界仔细环切栓塞周围边缘。
      2. 移除插栓，保持其夹在皮肤与肌肉层之间。立即用含有1x PBS的小烧杯冲洗，以去除多余的血液。插栓现可进行固定处理（下一步，6.3）。
  3. 用4%多聚甲醛固定塞子。
    1. 将包含皮肤和肌肉层的整个组织块放入含有25 ml 4%多聚甲醛的50 ml离心管中，室温静置固定24小时，不摇动。次日，将组织块转移至25 ml 70%乙醇中，继续室温放置24小时，随后进行石蜡包埋。
      注意：操作多聚甲醛时需谨慎，应佩戴手套。

7. 对基质凝胶塞进行石蜡处理

  1. 准备用于石蜡包埋的组织块。
    1. 按照图1a所示方向放置组织块；将组织块放入组织包埋盒中，使组织块的侧面朝上，确保在切片时首先被切割的组织块表面能同时显示皮肤层和肌肉层。
  2. 根据标准石蜡包埋方案进行石蜡包埋13。
  3. 按照标准石蜡切片方案，从组织块上切下厚度为8 - 10 μm的切片，并将其贴附于显微镜载玻片上13。
  4. 将载玻片存放于阴凉干燥的室温环境中，待染色时取出使用。

8. 使用苏木精和伊红染色剂（H&E）对切片进行染色13

  1. 将切片依次浸入二甲苯（100%）两次、100% 乙醇、95% 乙醇、70% 乙醇，最后放入 1× PBS 中，每步各 5 分钟，室温操作。随后将切片置于 1× PBS 中，等待下一步处理。
  2. 向组织切片上滴加 100 μl 苏木精-伊红（H&E）染液，孵育 1–5 分钟，或直至在 10 倍光学显微镜下观察到细胞核呈蓝色、细胞质呈粉红色，且对比清晰为止。注意避免 H&E 染液接触物镜。
  3. 将切片浸入盛有自来水的大烧杯中，洗去 H&E 染液，随后将切片置于烧杯内的支架上，用流水冲洗 2 分钟。
  4. 转入步骤 9.8 进行封片。

9. 对其他人毛细血管和周细胞玻片进行染色

  1. 将切片依次浸入二甲苯（100%）两次、100% 乙醇、95% 乙醇、70% 乙醇，最后放入 1× PBS 中，每步均在室温下进行 5 分钟。将切片留在 1× PBS 中，直至进行下一步。
  2. 在抗原修复液中煮沸切片。
    1. 在 2 L 烧杯中，使用 1× 枸橼酸盐缓冲液（pH 7.0）在加热板上加热至 95 °C，制备沸腾的抗原修复液。
    2. 待溶液沸腾后，将切片置于金属架上，并浸入沸腾的抗原修复液中，持续 20 分钟。
    3. 小心将烧杯（连同仍浸没的切片）从加热板上取下，使溶液缓慢冷却至室温，约需 30 分钟。
    4. 将切片转移至 1× PBS 中，直至进行下一步。
  3. 用封闭缓冲液（1× PBS、5% 山羊血清、0.3% Triton X-100）封闭切片。
    1. 使用 PAP 笔在每个切片边缘画出疏水圈。
    2. 将切片置于底部盛有蒸馏水的湿盒中。
    3. 用移液器将 100 μl 封闭缓冲液滴加至切片上，确保组织完全被液体覆盖（可能需要超过 100 μl）。
    4. 用封闭缓冲液孵育切片 1 小时。
  4. 用一抗孵育切片。
    1. 配制一种含两种一抗的混合溶液，用于在同一张切片上分别检测 CD31（内皮细胞）和平滑肌肌动蛋白（周细胞），将抗体用稀释缓冲液（1× PBS、1% BSA、0.3% Triton X-100）稀释。
      注意：此处抗 CD31 抗体稀释比例为 1:50，抗平滑肌肌动蛋白抗体稀释比例为 1:300。
    2. 在含有蒸馏水的湿盒中，用 100 μl 一抗溶液于 4 °C 过夜孵育切片。
  5. 用 1× PBST（1× PBS + 0.1% Tween20）洗涤切片三次，每次 5 分钟。
  6. 用二抗孵育切片。
    1. 配制一种含荧光素标记的山羊抗兔二抗的溶液，用于识别抗 CD31 兔一抗，用稀释缓冲液进行稀释。
      1. 注意：平滑肌肌动蛋白一抗已与 CY3 荧光素偶联，因此无需进行二抗染色。山羊抗兔二抗的稀释比例为 1:250。
    2. 在含有蒸馏水的湿盒中，用 100 μl 二抗溶液孵育切片 1 小时。
  7. 用 1× PBST 洗涤切片三次，每次 5 分钟。
  8. 封片。
    1. 在每个切片上滴加 2–3 滴（约 40–60 μl）含 DAPI 核染色的抗荧光淬灭封片液。
    2. 轻轻将 1.5 号盖玻片覆盖在切片及封片液上，使液体均匀展开至切片及盖玻片边缘。用手指轻轻按压，去除可能位于切片上方的气泡。
    3. 切片在操作前至少干燥 1 小时。

10. 定量毛细血管密度和结构14

  1. 计数H中的毛细血管数量&E染色切片中的数量，表示为#/mm2.
    1. 在正置光学显微镜下以40倍放大倍数拍摄四个不同视野的照片。
      注意：毛细血管被识别为充满红细胞的管道。
    2. 或者，可以不进行毛细血管的人工计数，而使用图像分析软件（例如， Wimasis 图像分析）用于量化多种血管生成参数，如血管数量、平均血管长度和直径，以及分支点。
  2. 分析免疫荧光染色切片中的毛细血管结构。
    1. 在倒置荧光显微镜下使用FITC和TxRed滤光片立方体，拍摄四个不同视野的照片。
      1. 使用FITC滤光片组在488 nm波长激发下成像内皮细胞，使用TxRed滤光片组在594 nm波长激发下成像周细胞。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

代表性 H&E 和基质凝胶塞切片的免疫荧光染色结果如图所示 图2. 仅来自EC的组织块切片显示一些血管，这些血管大多未被血液灌注（图2 左上角，黑色箭头）而包含内皮细胞和周细胞的凝胶块则显示出多条灌注良好、管径较大的血管，且周细胞覆盖完整，表现为SMA阳性信号紧邻CD31阳性内皮细胞。这些结果表明，周细胞在新生血管形成过程中发挥重要作用，且该动态过程可在体外被有效重现并易于分析 体内 模型

figure-results-1
图1. 组织包埋于组织包埋盒中的方向。 在分离出基质凝胶栓（黄色）后，其位于小鼠肌肉（紫色）与皮肤（绿色）层之间。将凝胶栓按图示方式放入组织包埋盒中，以便在切片时首先切割的表面能够同时显示这三层结构。...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

基质凝胶栓塞实验已被证明是一种便捷而有效的方法，可用于评估血管生成过程中基因的调控作用、促血管生成和抗血管生成化合物的体内活性，并可作为体外实验的补充。本文中，我们详细描述了一种新型的人源血管生成基质凝胶栓塞实验方法，用于研究血管形成过程中内皮细胞与周细胞之间的相互作用。

本方案中包含若干新颖且关键的步骤。建议使用低代次（第1至第4代）的细胞，因为较年轻的细胞在为期14天的实验过程中具有更高的存活率。内皮细胞的使用数量至少为一百万个，内皮细胞与周细胞的比例为5:1；然而，增加周细胞的数量可增强其在毛细血管上的覆盖程度。对于仅注射内皮细胞的实验组，注射的细胞总数应等于内皮细胞与周细胞数量之和，即120万个，以确保每个基质胶栓的总细胞数保持一致。准确计算细胞数量与基质胶体积的配比至关重要。基本配比公式为：200 μl基质胶中加入120万个细胞。此外，在注射前，应始终将移液枪头、注射器、基质胶及细胞沉淀置于冰上。由于基质胶具有较高黏度，为避免在细胞悬液中产生气泡，可将1 ml移液枪头尖端剪去约1 cm，以改善液体流动性能。在小鼠准备就绪进行注射前，切勿...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

不存在竞争性财务利益。

致谢

袁博士获得了美国心脏协会科学家发展基金（15SDG25710448）以及肺动脉高压协会概念验证奖（SPO121940）的支持。V. de Jesus Perez 博士获得了罗伯特·伍德·约翰逊基金会职业发展奖、美国国立卫生研究院资助项目 K08 HL105884-01、肺动脉高压协会奖、美国肺脏协会生物医学研究奖以及斯坦福大学转化研究与应用医学奖的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
磷酸盐缓冲液（PBS）Corning21-031-CV
0.25% 胰蛋白酶/0.53 mM EDTACorning25-053-CI
内皮细胞培养基（ECM）试剂盒Sciencell1001包含培养基、内皮细胞生长添加剂和青霉素/链霉素，每种组分均按适当体积提供，便于混合
周细胞培养基（PM）试剂盒Sciencell1201包含培养基、周细胞生长添加剂和青霉素/链霉素，每种组分均按适当体积提供，便于混合
原代人肺微血管内皮细胞Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative此类细胞也可商业获取。使用第1至第4代细胞
原代人肺周细胞Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative此类细胞无法商业获取，但脑周细胞可以。  使用第1至第4代细胞
bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）Peprotech100-18B储存液浓度为50 μg/ml，溶于含0.1% BSA的PBS中，分装为50 μl每份，保存于-20°C
Matrigel基底膜基质BD356237
28G 1 cc 胰岛素注射器BD329410
SCID（重度联合免疫缺陷）小鼠The Jackson Laboratory5557NOD.SCID IL2R gamma基因敲除品系为最佳品系；使用4-6周龄小鼠
1.5 ml 无菌微量离心管Thermo Fisher Scientific05-408-129
15 ml 螺口离心管，无菌BD Biosciences352096
PAP笔Life Technologies8899
血细胞计数板ThermoFisher Scientific02-671-6
Nair脱毛膏Walmart
抗人CD31一抗LifeSpan BiosciencesLS-B4737工作液稀释比例为1:50
抗人平滑肌肌动蛋白CY3荧光一抗SigmaC6198工作液稀释比例为1:300
山羊抗兔二抗；488/绿色ThermoFisher ScientificA-11008工作液稀释比例为1:250
Prolong Gold DAPI封片液Cell Signaling8961S
显微镜载玻片VWR48300-047
1.5号盖玻片Thermo Fisher Scientific12-544-D
10倍柠檬酸盐缓冲液Millipore21545
超精细手术剪刀Fine Science Tools14084-08
甲醛（多聚甲醛）Thermo Fisher Scientific245-685
组织包埋盒SimportM492-12
山羊血清DakoX0907

参考文献

  1. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
  2. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The role of pericytes in angiogenesis. Int J Dev Biol. 55 (3), 261-268 (2011).
  3. Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 83-101 (2008).
  4. Liu, Y., Senger, D. R. Matrix-specific activation of Src and Rho initiates capillary morphogenesis of endothelial cells. FASEB J. 18 (3), 457-468 (2004).
  5. Grant, D. S., et al. Interaction of endothelial cells with a laminin A chain peptide (SIKVAV) in vitro and induction of angiogenic behavior in vivo. J Cell Physiol. 153 (3), 614-625 (1992).
  6. Madri, J. A., Pratt, B. M., Tucker, A. M. Phenotypic modulation of endothelial cells by transforming growth factor-beta depends upon the composition and organization of the extracellular matrix. J Cell Biol. 106 (4), 1375-1384 (1988).
  7. Brooks, P. C., Montgomery, A. M., Cheresh, D. A. Use of the 10-day-old chick embryo model for studying angiogenesis. Methods Mol Biol. 129, 257-269 (1999).
  8. Yuan, K., et al. Activation of the Wnt/planar cell polarity pathway is required for pericyte recruitment during pulmonary angiogenesis. Am J Pathol. 185 (1), 69-84 (2015).
  9. Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice. Endocrinology. 137 (10), 4511-4513 (1996).
  10. Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem Cells. 31 (2), 305-316 (2013).
  11. Richards, O. C., Raines, S. M., Attie, A. D. The role of blood vessels, endothelial cells, and vascular pericytes in insulin secretion and peripheral insulin action. Endocr Rev. 31 (3), 343-363 (2010).
  12. Ricard, N., et al. Increased pericyte coverage mediated by endothelial-derived fibroblast growth factor-2 and interleukin-6 is a source of smooth muscle-like cells in pulmonary hypertension. Circulation. 129 (15), 1586-1597 (2014).
  13. Buchwalow, I. B., Bocker, W. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 1-153 (2010).
  14. Tata, D. A., Anderson, B. J. A new method for the investigation of capillary structure. J Neurosci Methods. 113 (2), 199-206 (2002).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

SCID

相关文章