建立了一种低成本、易于使用且功能强大的系统，用于评估可能改善组胺诱导的血-视网膜屏障损伤的治疗方法。通过血管渗漏、Müller细胞活化以及神经元突起连续性的变化，来评估损伤反应及其在潜在药物脂氧素A4作用下的逆转情况。
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摘要
摘要
建立了一种低成本、易于使用且功能强大的模型系统，用于评估可能改善血-视网膜屏障破坏的潜在治疗方法。通过血管外免疫球蛋白G（IgG）的阳性染色证明，炎症因子组胺可在培养的视网膜中损害血管完整性。组胺本身的作用以及潜在治疗药物（如脂氧素A4）的效果通过三个参数进行评估：通过IgG免疫染色检测血管渗漏、通过GFAP染色检测Müller细胞活化、以及通过MAP2染色检测神经元树突的变化。此外，视网膜的分层结构使得能够对Müller细胞和节细胞等细胞的结构过程（如宽度和连续性的变化）进行详细分析。尽管所展示的数据基于猪视网膜培养，但该系统适用于多种物种。因此，该模型为研究视网膜血管完整性受损早期对不同类型细胞的影响，以及评估潜在治疗药物提供了可靠的工具。
引言
越来越多的证据支持血-视网膜屏障（BRB）的存在1-5 及其与血脑屏障（BBB）的相似性6,7血脑屏障（BBB）的损伤已被紧密地作为因果因素或诊断标志物与阿尔茨海默病（AD）等慢性神经退行性疾病相关联。8,9 以及谵妄等急性病症10. 这些疾病的发病机制研究以及潜在药物靶点的发现通常受限于大脑的有限可及性和神经网络的复杂性。替代方法如 体内 成像11，脑类器官培养12原代细胞培养13,14 共培养系统15 已构建出多种模型。然而，这些模型大多需要特殊仪器、较长的实验周期或多种标记物来识别细胞。已有研究论述了血脑屏障（BBB）与血视网膜屏障（BRB）在功能和结构上的相似性，以及两者功能障碍之间的相关性。16-19此外，由于视网膜具有更易获取、细胞类型明确以及分层结构清晰等优势，已成为研究脑部的窗口。血脑屏障（BBB）与血视网膜屏障（BRB）在结构和功能上的特性仍有待详细比较。然而，视网膜病理变化，尤其是血视网膜屏障的破坏，已与多种疾病（包括糖尿病）的进展密切相关18-19 和 AD21,22因此，建立血-视网膜屏障功能障碍系统不仅有助于阐明其机制，还可用于潜在药物的筛选。本报告中开发并介绍了一种利用简单急性视网膜培养方法诱导血-视网膜屏障功能障碍的实验方案。
已有研究证实，在含有组胺（一种促炎介质）的脑类器官培养体系中，血脑屏障（BBB）通透性增加，并出现类似阿尔茨海默病（AD）的病理改变12。因此，在本实验系统中，将组胺应用于离体（ex vivo）视网膜培养，以诱导血-视网膜屏障（BRB）功能障碍。研究人员已测试了多种物种的视网膜，例如小鼠（Mus musculus）和牛（Bos Taurus）。由于猪眼球易于获取且其组织结构与人类相似，本研究所报告的数据均来自新鲜的猪眼球。在与组胺和/或其它药物共孵育后，视网膜组织通过免疫染色检测多种蛋白的表达12，包括血液主要成分之一的免疫球蛋白G（IgG）；胶质纤维酸性蛋白（GFAP），一种公认的胶质细胞活化标志物；以及微管相关蛋白2（MAP2），一种神经元特异性的细胞骨架蛋白，对微管组装至关重要。此外，视网膜的分层结构使得能够详细分析Müller细胞和节细胞的形态变化，例如其宽度和连续性的改变。因此，该体系还可提供多个额外参数，用于早期评估BRB破坏的后果，并同时评价潜在治疗手段的修复效果。
在本实验方案中，从三个方面评估筛选药物的潜在逆转效应：血管（BVs）渗漏、胶质细胞活化以及神经元细胞的损伤应答。采用多种定量方法，例如通过免疫染色强度反映的表达水平、通过增强滤波器显示的神经突宽度测量及其连续性分析。为了更清晰地展示该方法并帮助解读实验结果，选用脂氧素A4（LXA4）作为示范化合物，该物质在炎症损伤后体内合成，可减轻内皮功能障碍23。
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方案
所有实验方案均在适用情况下遵循了机构动物护理和使用委员会的政策。
1. 准备
- 用75%的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）和25%的亨克氏平衡盐溶液（HBSS）配制稳定化培养基。充分混匀后分装，于-20 °C保存备用。
- 配制磷酸盐缓冲盐水（PBS），经高压灭菌后室温保存。实验前将PBS预热至37 °C（每孔5 ml）。
- 用PBS分别配制10%、20%和30%的蔗糖溶液。每种溶液分别通过独立的0.22 μm滤器过滤除菌。4 °C保存备用。
- 用PBS配制组胺储备液，浓度为90 mM。使用0.22 µm滤器过滤除菌。分装后于-80 °C保存。避免反复冻融。
- 实验前新鲜配制4%多聚甲醛（PFA）PBS溶液，并置于冰上。
注意：操作PFA时应在通风橱中进行，并穿戴适当的防护装备。 - 解冻稳定化培养基（每视网膜20 ml），加入青霉素-链霉素至终浓度为100 U/ml。实验前将部分培养基（每视网膜15 ml）置于培养箱中预热至37 °C，其余培养基保持在冰上。
- 将HBSS（每视网膜10 ml）置于冰上冷却。
2. 视网膜类器官培养
- 将样品转移至组织培养操作台。围绕晶状体剪开眼杯，使用毛笔轻轻去除玻璃体，避免牵拉视网膜。用毛笔从切口边缘轻柔分离视网膜，暴露视盘。用刀片切断视神经，释放视网膜。
- 将视网膜转移至培养皿中，使用冷的HBSS小心冲洗一次。将样品置于冰上的HBSS中。通过重复步骤2.1及本步骤，解剖所需数量的视网膜。
- 用刀片将视网膜对称地切成两半。将样品轻柔转移至6孔板中，每孔加入3 ml稳定化培养基。在37 °C、含5% CO2的培养箱中平衡30分钟。
- 在步骤2.3孵育期间配制以下试剂：将组胺储备液用温培养基稀释至所需浓度（450 μM）。将储存于氩气环境中的LXA4溶解于培养基中，终浓度为250 ng/ml。
注意：在检测LXA4作用时，单个视网膜的一半用于组胺处理，另一半用于组胺联合LXA4处理。 - 小心吸除稳定化培养基，向每孔加入已配制的处理培养基（每孔3 ml）。在37 °C、含5% CO2的培养箱中孵育1小时。
- 用温热的无菌PBS冲洗样品一次。
3. 准备免疫染色样品
- 从培养板中吸除 PBS。每孔加入 4% PFA（3 ml），室温孵育 15 分钟。
- 迅速吸除 PFA，用 PBS 清洗样品一次。将样品转移至 10% 蔗糖溶液（每孔 5 ml），4 °C 条件下孵育 2 至 4 小时。
- 将样品转移至 30% 蔗糖溶液（每孔 5 ml），4 °C 条件下过夜孵育。按 1 份商品化冷冻介质与 2 份 20% 蔗糖混合，配制工作用冷冻介质。置于 4 °C 过夜或更长时间，直至气泡完全消失。
- 将样品转移至工作用冷冻介质中，室温平衡 5 分钟。将每片视网膜修剪成矩形（约 3 mm × 5 mm）。
- 小心将样品转移至铝箔制成的圆柱形容器（直径约 1 cm，高约 2 cm）中，容器内盛有工作用冷冻介质。确保视网膜切片呈垂直方向（以便切片时获得视网膜的横截面），然后在液氮中速冻。将组织块保存于 -80 °C，待用。
- 使用冷冻切片机将每个组织块切成 14 μm 厚的切片，并将切片贴附于载玻片上。载玻片储存于 -80 °C，待用。
4. 免疫染色
- 用5%蔗糖磷酸盐缓冲液（SPB，含5%蔗糖的PBS，pH 7.4）洗涤切片一次。在室温下用封闭液（5% SPB 加10%正常山羊血清和0.5% Triton X-100）孵育切片1小时，以封闭非特异性结合位点。
- 将切片（置于载玻片上）与适当的一抗（GFAP 或 MAP2，用封闭缓冲液按 1:500 稀释）孵育 1 小时。吸去溶液。用 5% SPB 洗涤三次。如需染色内源性 IgG，则跳过此步骤。
- 将切片与相应的二抗（Cy3/FITC标记的驴抗小鼠/兔IgG，用封闭缓冲液按1:800稀释）在室温下孵育1小时。
- 用5% SPB彻底清洗切片三次。将样品置于含DAPI的封片剂中封片，盖上盖玻片，以备显微镜观察。
- 使用激光共聚焦显微镜，通过20X物镜在相同的参数下采集图像，例如激光强度、增益值、停留时间 等等。 在各组之间保持一致。将蓝色通道（用于检测 DAPI）的激发/发射波长设置为 408/447 nm，红色通道（用于检测 Cyanine3）设置为 561/785 nm，绿色通道（用于检测 FITC）设置为 488/525 nm。
5. 图像分析
- 根据以下标准量化渗漏血管的百分比12：仅将内皮细胞核位于切片平面内的血管计入统计；若血管周围出现免疫染色梯度，则视为渗漏血管。
- 为确定表达水平，选择感兴趣区域，并使用图像分析软件测量平均灰度值。
- 为测量突起的宽度，选择切片中突起结构清晰的区域（例如外核层，ONL）。然后选择一个此类突起可见且连续的光学视野。根据显微镜设置设定比例尺，在突起上横跨画线并进行测量。
- 为分析突起的连续性，选择感兴趣区域，应用名为“方差”的滤波器（该滤波器通过将每个像素替换为其邻域的方差值来增强图像边缘），自动调整对比度和亮度，计数线条数量，并按面积对计数值进行归一化处理。
- 采用双尾 Student's t-检验计算统计学显著性。*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001。结果以均值 ± 标准误（SEM）形式绘图表示。
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结果
我们提出了一种低成本、高效且易于使用的方法，用于评估可能保护血-视网膜屏障（BRB）免受组胺诱导损伤的治疗手段。在对照组视网膜中，IgG 被限制在血管内（图1A），而在组胺刺激后，IgG 从血管中渗出（图1B），证实该模型已成功建立。
选择LXA4以演示在本系统中针对血-视网膜屏障（BRB）破坏的药物筛选。LXA4处理可减轻BRB功能障碍（图1D），而LXA4本身无显著影响（图1C）。通过渗漏血管所占百分比对恢复效果进行定量，结果具有显著性（图1E）。此外还进一步评估了另外两种视网膜细胞类型：Müller胶质细胞（图2）和神经节细胞（图3）。LXA4处理可逆转Müller胶质细胞突起宽度的减小（图2E<...
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讨论
在本报告中，我们介绍了一种利用猪视网膜建立的强大的ex vivo急性血-视网膜屏障（BRB）功能障碍模型。该模型系统无需特殊仪器，可在大多数实验室条件下轻松实施。然而，为获得成功的结果，若干步骤需格外注意。获取眼球后，必须将其保存在4 °C或冰上，并尽快进行处理。在分析某种处理效应时，应使用同一视网膜的两半部分——其中一半用于检测仅由实验操作引起的改变（基线值），另一半用于检测处理的效应。该方法还可校正个体动物间的差异，如年龄、性别和健康状况。
该方案可成功应用于多种物种的视网膜，例如 M. musculus 和 B. Taurus （数据未显示）。使用商用猪眼球相比维持活体动物具有显著的成本节约优势。此外，本研究中组胺孵育时间仅为60分钟，这一较短的孵育时间有助于分离出早期反应。需指出的是，本研究在不同时间（20分钟至120分钟）和不同组胺浓度（最高达700 μM）下进行了实验。在30分钟和225 μM组胺条件下即可观察到效应。为便于说明，本文展示了在450 μM组胺孵育60分钟所获得的结果。就目前形式而言，该模型存在以下局限...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢柏林（新泽西州）的布林格沃斯特肉类公司（Bringhurst Meats）为提供猪眼球所给予的真诚帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| HBSS | Life Technologies | 14170-112 | |
| 蔗糖 | J.T.Baker | 4072-05 | |
| 组胺 | Sigma | H7125-1G | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | ||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 冷冻保存液 | Triangle Biomedical Sciences | TFM-5 | |
| 正常山羊血清 | Rockland | D104-00-0050 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| GFAP 抗体 | Millipore | AB5804 | |
| MAP2 抗体 | EMD Millipore | MAB3418 | |
| 异硫氰酸荧光素标记的驴抗兔 IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
| Cy3 标记的驴抗小鼠 IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
| 含 DAPI 的封片剂 | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| 激光共聚焦显微镜 | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 | 1.45s |
参考文献
- Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. Blood-retinal barrier. J Ophthalmol. 21, 3(2011).
- Kim, J. H., et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface. J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).
- Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).
- Runkle, E. A., Antonetti, D. A. The blood-retinal barrier: structure and functional significance. Methods Molec Biol. 686, Clifton, N.J. 133-148 (2011).
- Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. Transport of glucose across the blood-tissue barriers. Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).
- Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states. Tissue Barriers. 1, 24782(2013).
- Patton, N., et al. Retinal image analysis: concepts, applications and potential. Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).
- Di Marco, L. Y., et al. Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles. Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).
- Nagele, R. G., et al. Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition. J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).
- Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders. J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10(2015).
- Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nat Photonics. 7, (2013).
- Sedeyn, J. C., et al. Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures. Biomed Res Int. 2015, 937148(2015).
- Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W. Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs. Di, L., Kerns, E. H. , John Wiley & Sons, Inc. Ch. 10 188(2014).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10, 33(2013).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
- Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging. Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).
- Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability. Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).
- Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes. Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).
- Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202(2011).
- Kolb, H. How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits. Am Sci. 91, 28-35 (2003).
- Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).
- Tan, Z., Ge, J. Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease. Am J Pathol. 176, 2055(2010).
- Serhan, C. N. Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology. Nature. 510, 92-101 (2014).
- Bucolo, C., et al. Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation. J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).
- Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown. Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).
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