建立了一种低成本、易于使用且功能强大的系统，用于评估可能改善组胺诱导的血-视网膜屏障损伤的治疗方法。通过血管渗漏、Müller细胞活化以及神经元突起连续性的变化，来评估损伤反应及其在潜在药物脂氧素A4作用下的逆转情况。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
建立了一种低成本、易于使用且功能强大的模型系统，用于评估可能改善血-视网膜屏障破坏的潜在治疗方法。通过血管外免疫球蛋白G（IgG）的阳性染色证明，炎症因子组胺可在培养的视网膜中损害血管完整性。组胺本身的作用以及潜在治疗药物（如脂氧素A4）的效果通过三个参数进行评估：通过IgG免疫染色检测血管渗漏、通过GFAP染色检测Müller细胞活化、以及通过MAP2染色检测神经元树突的变化。此外，视网膜的分层结构使得能够对Müller细胞和节细胞等细胞的结构过程（如宽度和连续性的变化）进行详细分析。尽管所展示的数据基于猪视网膜培养，但该系统适用于多种物种。因此，该模型为研究视网膜血管完整性受损早期对不同类型细胞的影响，以及评估潜在治疗药物提供了可靠的工具。
引言
越来越多的证据支持血-视网膜屏障（BRB）的存在1-5 及其与血脑屏障（BBB）的相似性6,7血脑屏障（BBB）的损伤已被紧密地作为因果因素或诊断标志物与阿尔茨海默病（AD）等慢性神经退行性疾病相关联。8,9 以及谵妄等急性病症10. 这些疾病的发病机制研究以及潜在药物靶点的发现通常受限于大脑的有限可及性和神经网络的复杂性。替代方法如 体内 成像11，脑类器官培养12原代细胞培养13,14 共培养系统15 已构建出多种模型。然而，这些模型大多需要特殊仪器、较长的实验周期或多种标记物来识别细胞。已有研究论述了血脑屏障（BBB）与血视网膜屏障（BRB）在功能和结构上的相似性，以及两者功能障碍之间的相关性。16-19此外，由于视网膜具有更易获取、细胞类型明确以及分层结构清晰等优势，已成为研究脑部的窗口。血脑屏障（BBB）与血视网膜屏障（BRB）在结构和功能上的特性仍有待详细比较。然而，视网膜病理变化，尤其是血视网膜屏障的破坏，已与多种疾病（包括糖尿病）的进展密切相关18-19 和 AD21,22因此，建立血-视网膜屏障功能障碍系统不仅有助于阐明其机制，还可用于潜在药物的筛选。本报告中开发并介绍了一种利用简单急性视网膜培养方法诱导血-视网膜屏障功能障碍的实验方案。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有实验方案均在适用情况下遵循了机构动物护理和使用委员会的政策。
1. 准备
- 用75%的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）和25%的亨克氏平衡盐溶液（HBSS）配制稳定化培养基。充分混匀后分装，于-20 °C保存备用。
- 配制磷酸盐缓冲盐水（PBS），经高压灭菌后室温保存。实验前将PBS预热至37 °C（每孔5 ml）。
- 用PBS分别配制10%、20%和30%的蔗糖溶液。每种溶液分别通过独立的0.22 μm滤器过滤除菌。4 °C保存备用。
- 用PBS配制组胺储备液，浓度为90 mM。使用0.22 µm滤器过滤除菌。分装后于-80 °C保存。避免反复冻融。
- 实验前新鲜配制4%多聚甲醛（PFA）PBS溶液，并置于冰上。
注意：操作PFA时应在通风橱中进行，并穿戴适当的防护装备。 - 解冻稳定化培养基（每视网膜20 ml），加入青霉素-链霉素至终浓度为100 U/ml。实验前将部分培养基（每视网膜15 ml）置于培养箱中预热至37 °C，其余培养基保持在冰上。
- 将HBSS（每视网膜10 ml）置于冰上冷却。
2. 视网膜类器官培养
- 将样品转移至组织培养操作台。围绕晶状体剪开眼杯，使用毛笔轻轻去除玻璃体，避免牵拉视网膜。用毛笔从切口边缘轻柔分离视....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
我们提出了一种低成本、高效且易于使用的方法，用于评估可能保护血-视网膜屏障（BRB）免受组胺诱导损伤的治疗手段。在对照组视网膜中，IgG 被限制在血管内（图1A），而在组胺刺激后，IgG 从血管中渗出（图1B），证实该模型已成功建立。
选择LXA4以演示在本系统中针对血-视网膜屏障（BRB）破坏的药物筛选。LXA4处理可减轻BRB功能障碍（图1D），而LXA4本身无显著影响（图1C）。通过渗漏血管所占百分比对恢复效果进行定量，结果具有显著性（图1E）。此外还进一步评估了另外两种视网膜细胞类型：Müller胶质细胞（图2）和神经节细胞（图3）。LXA4处理可逆转Müller胶质细胞突起宽度的减小（图2E<.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在本报告中，我们介绍了一种利用猪视网膜建立的强大的ex vivo急性血-视网膜屏障（BRB）功能障碍模型。该模型系统无需特殊仪器，可在大多数实验室条件下轻松实施。然而，为获得成功的结果，若干步骤需格外注意。获取眼球后，必须将其保存在4 °C或冰上，并尽快进行处理。在分析某种处理效应时，应使用同一视网膜的两半部分——其中一半用于检测仅由实验操作引起的改变（基线值），另一半用于检测处理的效应。该方法还可校正个体动物间的差异，如年龄、性别和健康状况。
该方案可成功应用于多种物种的视网膜，例如 M. musculus 和 B. Taurus （数据未显示）。使用商用猪眼球相比维持活体动物具有显著的成本节约优势。此外，本研究中组胺孵育时间仅为60分钟，这一较短的孵育时间有助于分离出早期反应。需指出的是，本研究在不同时间（20分钟至120分钟）和不同组胺浓度（最高达700 μM）下进行了实验。在30分钟和225 μM组胺条件下即可观察到效应。为便于说明，本文展示了在450 μM组胺孵育60分钟所获得的结果。就目前形式而言，该模型存在以下局限.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢柏林（新泽西州）的布林格沃斯特肉类公司（Bringhurst Meats）为提供猪眼球所给予的真诚帮助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| HBSS | Life Technologies | 14170-112 | |
| 蔗糖 | J.T.Baker | 4072-05 | |
| 组胺 | Sigma | H7125-1G | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | ||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 冷冻保存液 | Triangle Biomedical Sciences | TFM-5 | |
| 正常山羊血清 | Rockland | D104-00-0050 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| GFAP 抗体 | Millipore | AB5804 | |
| MAP2 抗体 | EMD Millipore | MAB3418 | |
| 异硫氰酸荧光素标记的驴抗兔 IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
| Cy3 标记的驴抗小鼠 IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
| 含 DAPI 的封片剂 | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| 激光共聚焦显微镜 | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 | 1.45s |
参考文献
- Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. Blood-retinal barrier. J Ophthalmol. 21, 3(2011).
- Kim, J. H., et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface. J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).
- Kumagai, A. K.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
