从星状海葵 Nematostella vectensis 的反口端息肉诱导完整息肉再生

摘要

本文演示了如何在刺胞动物门珊瑚纲的模式生物星状海葵Nematostella vectensis中诱导并监测其再生过程。我们展示了如何通过形态学分期系统进行截肢操作并对再生过程进行分类，并利用该系统揭示了自噬在水螅体结构再生过程中的必要性。

摘要

刺胞动物，特别是 水螅是首批被发现能够再生受损或截断结构的动物，事实上，超过250年前，Trembley 的研究工作正是通过此类研究开启了现代生物学探索的先河。目前，再生研究借助多种方法重新兴起 "经典" 再生生物，例如 水螅，涡虫和有尾目动物，以及跨越后生动物范围的越来越多物种，从海绵动物到哺乳动物。除了作为生物学现象本身具有内在研究价值外，了解多种物种中再生机制的工作原理，将有助于揭示再生过程是否具有共同特征，以及是否存在物种或情境特异性的细胞与分子机制。星刺海葵 Nematostella vectensis是一种新兴的再生研究模式生物。与 水螅, Nematostella 属于古老的刺胞动物门，但位于珊瑚纲中，是水螅纲的一个姐妹类群，在进化上更为基础。因此，其再生过程的某些方面在 Nematostella 将与……的进行比较和对照会很有趣 水螅 以及其他刺胞动物。本文介绍了一种对海葵成体反口端（称为足盘，physa）进行切分、观察和再生分类的方法。足盘在自然条件下可通过分裂进行无性繁殖，无论是自然分裂还是人工截除足盘，均可触发复杂形态结构的再生与重建。本文对这些简单的形态变化进行了系统化归纳 Nematostella 再生分期系统（NRSS）。我们利用NRSS检测氯喹（一种溶酶体功能抑制剂，可阻断自噬）对再生过程的影响。结果显示，当自噬被抑制时，水螅体结构特别是隔膜的再生出现异常。

引言

对单个水螅再生现象的观察是生物学成为一门实验科学的开创性事件^1,2。再生现象至今仍对生物学家和普通大众具有极为广泛的吸引力。发育生物学家、临床医生、生物医学科学家和组织工程师若能理解并克服人类再生能力的局限，将使再生生物学的意义远超其本身固有的研究价值。

如今，随着基因组测序以及基因功能获得与缺失工具等新兴技术的应用，该领域已具备条件深入解析再生机制，并最终理解为何某些物种能够再生，而其他物种则不能。在分子、细胞和形态学水平上的反应共性仍有待阐明，但迄今为止的证据表明，能够再生的动物之间的基本反应比十年前所设想的更为相似³。

刺胞动物尤其擅长在广泛的形态多样性背景下再生几乎所有的身体部位。从 solitary 淡水水螅（Hydra），到构建巨大珊瑚礁的微小海洋水螅体，再到复杂的群体性管水母（如葡萄牙战舰水母，Portuguese Man-O-War），再生不仅是修复或重建因损伤和捕食而受损或丢失身体部位的机制，也常常是一种繁殖方式。不同种类的刺胞动物在再生过程中是采用相似还是不同的机制，是一个具有根本性科学意义的问题^4-6。

我们及其他研究者一直在将刺胞动物Nematostella vectensis开发为再生研究的模式生物^7-17。我们近期建立了一个分期系统，用于描述从水螅体反口端横切所得形态均一的组织片段重新再生出完整个体的过程¹⁰。尽管Nematostella水螅体在任意位置横切后均具备再生能力，但我们选择在成体反口端形态最简单的区域——即膨大的基盘（physa）处进行切割，部分原因是该位置接近其自然无性裂殖的典型平面¹⁸，同时也因为这一切割方式有助于观察并开展分子分析，以研究完整个体如何从最简单的形态组分重新组装而成。

《海葵再生分期系统》（Nematostella Regeneration Staging System, NRSS）提供了一套相对简单的形态学基准，可用于评估在正常培养条件或经实验干预（如小分子处理、基因操作或环境改变）情况下，离体基盘再生过程的各个阶段进展。正如预期，NRSS 正逐渐被采纳为一个形态学框架，用以定位和描述再生过程中发生的细胞与分子事件¹⁰。

最终，我们的切割方法所产生的创口面积比近期一项研究中使用的针尖穿刺¹⁷大数个数量级，然而两种伤口均在约6小时内愈合。记录伤口闭合过程中显著且不同的可视化阶段，有助于提出实验方法，以解释伤口大小与其闭合时间之间看似无关的现象。因此，本方案所提供的对反口端截肢过程更深入的视觉理解，将有助于进一步研究这一再生模型系统，并拓展以Nematostella vectensis为基础的分期系统的应用范围。

方案

1. 动物的温度、营养和光/暗周期适应

1. 获取 Nematostella vectensis 来自众多的成虫之一 Nematostella 全球各地的实验室，或非营利性供应商（表1)
2. 维持 Nematostella 在恒定温度（通常为 18 至 21 °C）下避光保存，置于 "1/3x" 人工海水（ASW），盐度为12‰（ppt）。将培养物维持在普通的钠钙玻璃培养皿中，通常为250 mL 或 1.5 L 容量¹¹.
   注意：这些简单的培养条件在研究中被多个实验室广泛采用 Nematostella，但培养护理也可实现自动化¹⁹.
3. 喂养 Nematostella 新孵化的 卤虫 无节幼体 2 - 4倍 每周。孵化 卤虫 在30 °C条件下，将休眠卵置于全浓度（36 ppt）或1/3倍人工海水（ASW）的浅矩形玻璃培养皿中²⁰ 或在多种小型商业或自制的卤虫孵化装置中进行。若无恒温培养箱，卤虫也可在室温下孵化，但孵化速度较慢。
   注意：此过程通常需要超过24小时才能完成。
4. 每周至少更换一次海葵培养水。为确保成体健康，建议每周彻底清洗培养容器一次（不可使用肥皂），清除容器内壁积聚的黏液分泌物。这些黏液会覆盖容器表面，容易滞留未摄食的饵料和代谢废物，并可能缠绕动物个体。

2. 营养条件化动物的选择与恢复

1. 选择大小匹配的水螅体，其长度大致相同（自然松弛状态下约为 3 - 5 cm），并在截肢前三天将其从群体中分离并置于培养皿中。
   注意：用于切割的动物数量取决于具体实验设计，但通常建议每个采样点至少使用五只动物，设六个重复。因此，在典型实验中，至少需预先选定 30 只动物。一般建议选择超过最低数量（30 只）的动物，因为不规则的截肢操作（见下文）可能会影响后续评分结果。
2. 在截肢前至少一小时，将装有选定动物的培养皿从培养箱中取出，置于室内光线下。
   注意：暴露于室内光线及操作过程中的振动可能导致动物收缩，因此需要在实验台面上孵育一段时间使其适应或"松弛"。当动物对触碰和光照刺激不再反应时，即可通过轻柔移液操作转移。
3. 可选步骤：通过加入 7.5% MgCl₂（溶于 1/3x ASW）对动物进行麻醉。使用标准塑料 5 mL 移液器轻轻将 MgCl₂ 溶液加入培养皿中。
   注意：尽管动物最终会对光照和物理操作产生适应性，但在其伸长后，麻醉有助于维持或"固定"其松弛状态^16,21,22。
4. 使用大口径（>0.5 cm）塑料移液器，将五只待截肢的动物（用 1/3x ASW）从群体中转移至直径为 100 mm、内含 12 ppt ASW 的无菌玻璃切割皿底部。将该培养皿置于体视显微镜载物台上，显微镜放大倍数设为 10 - 40X 可调。
   ​注意：若动物未经过麻醉和松弛处理，则仍可能对触碰和体视显微镜照明产生反应，因此可能需要数分钟时间再次达到松弛状态。

3. 截肢

1. 使用无菌手术刀，从每个水螅体上截除口道部（aboral physa），目标是获得一段长度与宽度大致相等且不含隔膜组织的口道部组织。
   注意：理想的切割位置位于隔膜终止处的口道侧。在切割平面上，可观察到从真正的隔膜组织过渡为对应每个隔膜插入点的细线结构（见图1，箭头所示）。必须确保无隔膜组织残留，因其会分泌黏液，可能导致伤口“堵塞”^17,30。
   1. 将手术刀片置于动物体上预定截除位置。操作时可徒手进行（自由操作），或用#5镊子（Dumont型或类似型号）轻轻夹住动物身体以辅助固定。
   2. 通过手术刀的弧形刀刃在身体表面做“ rocking”（ rocking 动作）杠杆运动，切穿组织。
      注意：当手术刀做 rocking 动作时，组织应被干净地切断，使目标口道部组织从供体上分离。然而，若仍有小片组织连接身体与口道部，则需用手术刀将其切断。切勿通过拉扯方式分离相连组织，以免损伤口道部。
2. 将每只被截除的“供体”水螅体从培养皿中移出，并放回标记为“汇集的截除个体”的独立容器中；标注日期后将其放回种群培养体系。
   注意：截除后的水螅体可在一天内愈合口道部伤口，并恢复正常喂养。通常在两周内可再生出形态正常的口道部，此后如需可再次进行截除操作。
3. 用12 ppt人工海水（ASW）冲洗切割皿中剩余的切除口道部组织，然后将每个口道部转移至多孔细胞培养板中的独立无菌孔内，每孔预先加入10 mL的12 ppt ASW。
   注意：本示例使用六孔板，每孔容纳10 mL海水和五个切除的口道部。一般情况下，海水应充分覆盖口道部，以防操作移动或潜在蒸发导致组织暴露于空气中。培养板或各孔应配有盖子。
4. 重复步骤3.1–3.3，为每种实验处理组收集至少5 个口道部放入指定孔中。
5. 将口道部置于适宜温度下孵育，以满足计划实验所需的再生速率。将含有口道部的培养板放入温度可控的培养箱中，设定固定温度以调控再生速度。
   ​注意：当孵育温度在15 至27 °C之间时，口道部可再生缺失组织并发育成完整水螅体。除前两个阶段外，再生速率具有温度依赖性。在所有温度条件下，达到第4阶段的平均时间为切割后7 d，该时间点也恰好对应21 °C下的再生进程。在27 °C时，第4阶段提前约3天达到；而在15 °C时，则比21 °C延迟约3天（另见参考文献10）。

4. 利用以下方法评估再生能力 Nematostella 再生分期系统（NRSS）

1. 使用具有可变放大倍数（10 - 80X）的体视复合显微镜对水螅体（physa）进行评分。将刚切割的 Nematostella 水螅体记为 0 期，并在截肢后每天同一时间使用 NRSS¹⁰ 继续评分（dpa）。
   注：关键分期标准和详细信息请参见参考文献10。
   1. 若刚切割的水螅体呈杯状、类似松弛的气球，且可见开放性伤口，则将其记为 0 期（开放性伤口）。
      ​注：伤口边缘可能从一开始就粘连在一起，但组织仍处于塌陷状态且缺乏刚性。可观察到开放性伤口的边缘在愈合过程中发生径向收缩。
   2. 若截肢伤口已闭合，则将水螅体记为 1 期（伤口闭合）。
      注：伤口位置将对应未来的口极。未来口极周围的外表面可能开始出现明显的弓形结构，对应于下方辐射对称的内胚层隔膜插入点。
   3. 若口极表面膨胀，显示出八个呈辐射对称排列并由沟槽分隔的隆起弓形结构，且在弓形顶端可见小的半球状突起，则将水螅体记为 2 期（辐射弓形结构）。这些突起的高度与宽度相近，可能为暂时性结构，最初由单层外胚层细胞构成。
      注：在某些情况下，双层突起可能趋于稳定。注：在此期或后续阶段，可能有一层黏液包裹水螅体（图2），形成膜状“鞘”。应去除该包裹物以利于评分。
   4. 若至少部分辐射弓形结构的口端已稳定形成包含内胚层和外胚层组织层的触手芽，则将水螅体记为 3 期（触手形成）。
      注：触手长度大于宽度，具有轻微运动能力。水螅体膨胀程度增加但存在变异，隔膜原基可能变得可见，从体壁的隔膜插入点延伸至体腔（腔肠）内。
   5. 若水螅体包含八条清晰可见的隔膜，这些隔膜从体壁插入点延伸至腔肠内，其口-反口轴长度超过从反口端（肠口）连接咽部处测得的径向宽度的两倍以上，则记为 4 期（线性隔膜）。
      注：四条或更少的隔膜具有"褶皱"的游离内缘。咽部可见。可见超过八条触手，具有运动性，有时会收缩进入体内。
   6. 若水螅体具有超过四条具褶皱结构的隔膜，且褶皱比 4 期更明显、更弯曲，动物几乎呈现"正常"成体形态，但未见性腺细胞，则记为 5 期（以褶皱隔膜为主）。

结果

断离的水螅在再生过程中形态变化的进展如图1A所示，其中包括每个NRSS阶段水螅的代表性图像。成体上典型的切割位置已标出（箭头所示）。图1A中的照片展示了从新近切割的水螅到完全成形的水螅体，其口部和体部结构逐步再生的过程。图1B、C分别显示了第4阶段和第5阶段的内部隔膜（即隔膜组织）的排列情况。请注意，第4阶段的部分隔膜可能尚未形成“褶皱”，但要达到第5阶段，大多数隔膜必须已发育出褶皱。图1D显示一个被黏液膜包裹的水螅，该膜可用镊子去除（图1E）。虽然该膜通常不会影响再生过程（除非异常地困住动物），但它可能妨碍对水螅的观察评分以及实验操作，例如显微观察、样品固定或用于分子/生物化学分析的样品采集。该黏液膜最好在第1阶段之后去除，若其重新形成，则可在后期再次去除。

图2

讨论

使用海葵 Nematostella 作为伤口愈合与再生研究的模型正变得越来越普遍。因此，在开展有效的细胞和分子分析并进行比较之前，能够可视化特定实验方案的形态学模式显得尤为重要。Nematostella 在后浮浪幼虫阶段具有高度的再生"灵活性"，能够重新形成在任何位置被截除的几乎所有缺失结构。因此，已有多个研究团队在不同年龄和大小的息肉上，针对不同部位的截肢或损伤所引发的再生过程进行了研究^7-18。

本文所述的分期系统描述了从成体反口端截取的一段形态均一的水螅体（physa）组织，逐步转变为一个解剖结构完整但仅缺乏生殖组织的幼体水螅体的过程（目前尚未确定这些再生幼体何时达到性成熟）。该方法研究了从简单的组织原基再生为接近最复杂结构的个体的过程。建议至少使用五个水螅体作为实验组的最小数量，以消除个体间潜在的变异性及存活率差异的影响。当然，该数量可根据具体实验目的进行调整，但NRSS方案要求每个水螅体提供2 mL培养基，以避免可能影响水螅再生的“体积效应”²³。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Nematostella vectensis，成体	海洋生物实验室（MBL）		非营利性供应商
玻璃培养皿，250 mL	Carolina Biological Supply	741004	250 mL
玻璃培养皿，1,500 mL	Carolina Biological Supply	741006	1,500 mL
聚乙烯移液管，5 mL	USA Scientific	1022-2500	细孔，带刻度
锥形聚乙烯移液管	Samco	202-205	剪去管尖1英寸以形成宽孔
一次性手术刀	Feather Safety Razor Co. Ltd	no. 10	刀片应为弧形
#5 Dumont 精细镊子	Roboz	RS5045	可使用其他供应商产品
Pyrex 培养皿，直径100 mm	Corning	3160	可替换为其他玻璃培养皿
无菌6孔板	Corning Falcon	353046	或其他厂商类似产品
无菌12孔板	Nunc	150628	或其他厂商类似产品
无菌24孔板	Cellstar, Greiner bio-one	662-160	或其他厂商类似产品
卤虫孵化试剂盒	San Francisco Bay；drsfostersmith.com	CD-154005	用于培养卤虫的可选方案
Pyrex 烤盘	常见于杂货店		用于培养卤虫的可选方案
人工海水混合盐，50加仑或以上	Instant Ocean；drsfoster-smith.com	CD-116528	其他品牌亦可使用
用于配制人工海水储备液的塑料桶	多种可选		常见的25加仑塑料垃圾桶即可使用
聚丙烯大肚瓶	Carolina Biological Supply	716391	用于盛装12 ppt工作浓度人工海水
量筒，4,000 mL	PhytoTechnology Laboratories	B199	用于将36 ppt人工海水稀释至12 ppt
体视显微镜及光源	多种可选		具备连续1–40倍放大功能