从星状海葵 Nematostella vectensis 的反口端息肉诱导完整息肉再生

摘要

本文演示了如何在刺胞动物门珊瑚纲的模式生物星状海葵Nematostella vectensis中诱导并监测其再生过程。我们展示了如何通过形态学分期系统进行截肢操作并对再生过程进行分类，并利用该系统揭示了自噬在水螅体结构再生过程中的必要性。

摘要

刺胞动物，特别是 水螅是首批被发现能够再生受损或截断结构的动物，事实上，超过250年前，Trembley 的研究工作正是通过此类研究开启了现代生物学探索的先河。目前，再生研究借助多种方法重新兴起 "经典" 再生生物，例如 水螅，涡虫和有尾目动物，以及跨越后生动物范围的越来越多物种，从海绵动物到哺乳动物。除了作为生物学现象本身具有内在研究价值外，了解多种物种中再生机制的工作原理，将有助于揭示再生过程是否具有共同特征，以及是否存在物种或情境特异性的细胞与分子机制。星刺海葵 Nematostella vectensis是一种新兴的再生研究模式生物。与 水螅, Nematostella 属于古老的刺胞动物门，但位于珊瑚纲中，是水螅纲的一个姐妹类群，在进化上更为基础。因此，其再生过程的某些方面在 Nematostella 将与……的进行比较和对照会很有趣 水螅 以及其他刺胞动物。本文介绍了一种对海葵成体反口端（称为足盘，physa）进行切分、观察和再生分类的方法。足盘在自然条件下可通过分裂进行无性繁殖，无论是自然分裂还是人工截除足盘，均可触发复杂形态结构的再生与重建。本文对这些简单的形态变化进行了系统化归纳 Nematostella 再生分期系统（NRSS）。我们利用NRSS检测氯喹（一种溶酶体功能抑制剂，可阻断自噬）对再生过程的影响。结果显示，当自噬被抑制时，水螅体结构特别是隔膜的再生出现异常。

引言

对单个水螅再生现象的观察是生物学成为一门实验科学的开创性事件^1,2。再生现象至今仍对生物学家和普通大众具有极为广泛的吸引力。发育生物学家、临床医生、生物医学科学家和组织工程师若能理解并克服人类再生能力的局限，将使再生生物学的意义远超其本身固有的研究价值。

如今，随着基因组测序以及基因功能获得与缺失工具等新兴技术的应用，该领域已具备条件深入解析再生机制，并最终理解为何某些物种能够再生，而其他物种则不能。在分子、细胞和形态学水平上的反应共性仍有待阐明，但迄今为止的证据表明，能够再生的动物之间的基本反应比十年前所设想的更为相似³。

刺胞动物尤其擅长在广泛的形态多样性背景下再生几乎所有的身体部位。从 solitary 淡水水螅（Hydra），到构建巨大珊瑚礁的微小海洋水螅体，再到复杂的群体性管水母（如葡萄牙战舰水母，Portuguese Man-O-War），再生不仅是修复或重建因损伤和捕食而受损或丢失身体部位的机制，也常常是一种繁殖方式。不同种类的刺胞动物在再生过程中是采用相似还是不同的机制，是一个具有根本性科学意义的问题^4-6。

我们及其他研究者一直在将刺胞动物Nematostella vectensis开发为再生研究的模式生物^7-17。我们近期建....

方案

1. 动物的温度、营养和光/暗周期适应

1. 获取 Nematostella vectensis 来自众多的成虫之一 Nematostella 全球各地的实验室，或非营利性供应商（表1)
2. 维持 Nematostella 在恒定温度（通常为 18 至 21 °C）下避光保存，置于 "1/3x" 人工海水（ASW），盐度为12‰（ppt）。将培养物维持在普通的钠钙玻璃培养皿中，通常为250 mL 或 1.5 L 容量¹¹.
   注意：这些简单的培养条件在研究中被多个实验室广泛采用 Nematostella，但培养护理也可实现自动化¹⁹.
3. 喂养 Nematostella 新孵化的 卤虫 无节幼体 2 - 4倍 每周。孵化 卤虫 在30 °C条件下，将休眠卵置于全浓度（36 ppt）或1/3倍人工海水（ASW）的浅矩形玻璃培养皿中²⁰ 或在多种小型商业或自制的卤虫孵化装置中进行。若无恒温培养箱，卤虫也可在室温下孵化，但孵化速度较慢。
   注意：此过程通常需要超过24小时才能完成。
4. 每周至少更换一次海葵培养水。为确保成体健康，建议每周彻底清洗培养容器一次（不可使用肥皂），清除容器内壁积聚....

结果

断离的水螅在再生过程中形态变化的进展如图1A所示，其中包括每个NRSS阶段水螅的代表性图像。成体上典型的切割位置已标出（箭头所示）。图1A中的照片展示了从新近切割的水螅到完全成形的水螅体，其口部和体部结构逐步再生的过程。图1B、C分别显示了第4阶段和第5阶段的内部隔膜（即隔膜组织）的排列情况。请注意，第4阶段的部分隔膜可能尚未形成“褶皱”，但要达到第5阶段，大多数隔膜必须已发育出褶皱。图1D显示一个被黏液膜包裹的水螅，该膜可用镊子去除（图1E）。虽然该膜通常不会影响再生过程（除非异常地困住动物），但它可能妨碍对水螅的观察评分以及实验操作，例如显微观察、样品固定或用于分子/生物化学分析的样品采集。该黏液膜最好在第1阶段之后去除，若其重新形成，则可在后期再次去除。

图2

讨论

使用海葵 Nematostella 作为伤口愈合与再生研究的模型正变得越来越普遍。因此，在开展有效的细胞和分子分析并进行比较之前，能够可视化特定实验方案的形态学模式显得尤为重要。Nematostella 在后浮浪幼虫阶段具有高度的再生"灵活性"，能够重新形成在任何位置被截除的几乎所有缺失结构。因此，已有多个研究团队在不同年龄和大小的息肉上，针对不同部位的截肢或损伤所引发的再生过程进行了研究^7-18。

本文所述的分期系统描述了从成体反口端截取的一段形态均一的水螅体（physa）组织，逐步转变为一个解剖结构完整但仅缺乏生殖组织的幼体水螅体的过程（目前尚未确定这些再生幼体何时达到性成熟）。该方法研究了从简单的组织原基再生为接近最复杂结构的个体的过程。建议至少使用五个水螅体作为实验组的最小数量，以消除个体间潜在的变异性及存活率差异的影响。当然，该数量可根据具体实验目的进行调整，但NRSS方案要求每个水螅体提供2 mL培养基，以避免可能影响水螅再生的“体积效应”²³。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Nematostella vectensis，成体	海洋生物实验室（MBL）		非营利性供应商
玻璃培养皿，250 mL	Carolina Biological Supply	741004	250 mL
玻璃培养皿，1,500 mL	Carolina Biological Supply	741006	1,500 mL
聚乙烯移液管，5 mL	USA Scientific	1022-2500	细孔，带刻度
锥形聚乙烯移液管	Samco	202-205	剪去管尖1英寸以形成宽孔
一次性手术刀	Feather Safety Razor Co. Ltd	no. 10	刀片应为弧形
#5 Dumont 精细镊子	Roboz	RS5045	可使用其他供应商产品
Pyrex 培养皿，直径100 mm	Corning	3160	可替换为其他玻璃培养皿
无菌6孔板	Corning Falcon	353046	或其他厂商类似产品
无菌12孔板	Nunc	150628	或其他厂商类似产品
无菌24孔板	Cellstar, Greiner bio-one	662-160	或其他厂商类似产品
卤虫孵化试剂盒	San Francisco Bay；drsfostersmith.com	CD-154005	用于培养卤虫的可选方案
Pyrex 烤盘	常见于杂货店		用于培养卤虫的可选方案
人工海水混合盐，50加仑或以上	Instant Ocean；drsfoster-smith.com	CD-116528	其他品牌亦可使用
用于配制人工海水储备液的塑料桶	多种可选		常见的25加仑塑料垃圾桶即可使用
聚丙烯大肚瓶	Carolina Biological Supply	716391	用于盛装12 ppt工作浓度人工海水
量筒，4,000 mL	PhytoTechnology Laboratories	B199	用于将36 ppt人工海水稀释至12 ppt
体视显微镜及光源	多种可选		具备连续1–40倍放大功能