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方法文章

实证、宏基因组学与计算技术揭示杀菌剂损害蜜蜂健康的作用机制

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DOI：

10.3791/54631

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2017年10月9日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Vegetable Crop Research Unit, USDA-ARS, 2Department of Entomology, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Horticulture, University of Wisconsin-Madison, 4Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agricolas y Pecuarias, 5Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison, 6Laboratory of Genetics, Genome Center of Wisconsin, 7DOE Great Lakes Bioenergy Research Center, Wisconsin Energy Institute, 8J.F. Crow Institute for the Study of Evolution, University of Wisconsin-Madison

本文内容

摘要

熊蜂蜂巢内的微生物群落可富集并保存花粉，以供蜂幼虫食用。本文通过高通量测序技术，结合实验室和野外实验，描述了用于验证以下假设的实验方案：杀菌剂残留会改变花粉微生物组结构和蜂群种群特征，最终导致蜂群衰退。

摘要

种植者常在开花期喷洒杀菌剂以保护作物免受病害侵袭，但这会使蜜蜂暴露于杀菌剂残留物中。尽管杀菌剂通常被认为"对蜜蜂安全"，但越来越多的证据表明，花粉中的杀菌剂残留与蜜蜂种群衰退有关（包括蜜蜂和熊蜂物种）。虽然其作用机制尚不明确，但研究人员推测蜜蜂与微生物之间的共生关系可能参与其中。微生物在花粉的保存和/或加工过程中发挥关键作用，而花粉是蜂类幼虫的重要营养来源。通过改变微生物群落，杀菌剂很可能破坏这些由微生物介导的生态功能，从而损害蜜蜂健康。本文描述了用于研究杀菌剂导致蜂群衰退间接机制的实验方案。笼养实验中让蜜蜂接触经杀菌剂处理的花朵，已首次证明杀菌剂会导致本地熊蜂（Bombus impatiens）出现严重蜂群损失。采用与田间实际暴露水平相当的杀菌剂剂量，研究人员设计了一系列实验，以更细致地描述暴露于杀菌剂后花粉中微生物群落的动态变化。通过高通量测序和宏基因组分析，研究花粉微生物组内真菌和细菌群落结构组成的变化。本文所开发的实验旨在揭示杀菌剂如何影响花粉储粮中微生物组的内在机制。最终，这些研究结果将有助于阐明杀菌剂导致蜂群衰退的间接途径。

引言

无论是人工管理的蜜蜂还是野生蜂种，其种群数量都在广泛下降，这对自然生态系统和农业系统均产生了重大影响1。尽管人们已努力试图理解这一问题的成因，但导致蜜蜂种群衰退的关键因素仍不明确2,3,4。对于某些野生本土蜂种而言，现状已十分严峻5,6。如果蜂类种群在与工业化农业交叠的环境中无法维持，其数量将持续下降，而依赖传粉者的农作物（占全球产量的35%7）将面临减产。

尽管已有许多潜在因素被认为与蜜蜂数量下降有关，例如杀虫剂暴露、疾病和栖息地丧失1,4,8,9,10，但对于这些胁迫因子在农业系统内部或周边对本土蜜蜂健康产生的交互影响，目前仍知之甚少。当前许多研究工作仍集中于杀虫剂（例如，新烟碱类杀虫剂11,12），然而以往研究表明，杀菌剂也可能通过损害记忆形成、嗅觉感知13、巢穴识别14、酶活性及代谢功能15,16,17，而在蜜蜂衰退中发挥作用。全球范围内，杀菌剂仍持续在开花作物的花期施用。近期研究已记录到蜜蜂常将杀菌剂残留物带回蜂巢18；事实上，已有研究显示，大量被检测的蜂巢中均含有杀菌剂残留物19,20。进一步研究发现，杀菌剂残留与蜜蜂幼虫高死亡率21,22,23以及蜂群内出现"封存花粉"现象相关；这种花粉虽无毒性，但缺乏微生物活性，营养状况受损24。尽管长期以来杀菌剂一直被认为是"对蜜蜂安全"，但现有证据表明，仅暴露于杀菌剂即可导致一种本土熊蜂物种Bombus impatiens出现严重的蜂群损失25。

为了确定杀菌剂暴露与蜂群死亡之间的因果关系， 运作方式 这些化学品的含量需要测定。如在土壤中所证实的那样26，沉积物27以及水生环境28通过靶向真菌，杀菌剂很可能改变花粉储粮中的真菌丰度和多样性，从而引发群落结构的重大变化，这种变化可能显著有利于细菌的生长。在缺乏真菌竞争者或拮抗微生物的情况下，某些致病性细菌可相对不受限制地增殖，进而加速花粉储粮的腐败。以往研究表明，微生物尤其是酵母菌和丝状真菌，可作为蜜蜂的营养共生体29,30,31，抵御寄生虫和病原体32,33，并长期保存花粉储备。因此，杀菌剂可能通过破坏提供这些功能所必需的微生物群落和/或增加对机会性病原体和寄生生物的易感性，间接危害未成熟蜜蜂。12随着全球对粮食生产需求的不断增加，每年在作物开花期间都会施用杀菌剂，这凸显了了解此类杀菌剂诱导效应程度的重要性。

迄今为止，关于本土蜜蜂微生物生态学的主要知识空白可归结为以下问题：杀菌剂在多大程度上改变了蜜蜂花粉储备中的微生物群落？摄取微生物群落发生显著改变的花粉会对蜜蜂产生哪些后续影响？ 针对这些具有重要生态意义的问题，研究人员设计了实验，主要目标是揭示：1）仅杀菌剂残留即可导致本土蜜蜂种群严重衰退；2）杀菌剂对花粉储备中微生物群落的改变程度；以及 3）严重改变的微生物群落如何影响蜜蜂健康。本研究通过结合实验室与野外实验的方法，明确实验目标以回答上述问题。通过结合使用先进的宏基因组学和分子技术以及传统的野外观察方法，该研究旨在系统解析杀菌剂对蜜蜂健康可能产生的影响。

本研究的首要目标是证明仅凭杀菌剂暴露即可导致本土蜂类物种出现显著的蜂群损失。通过使用大型田间笼具的研究方法，探讨了杀菌剂暴露对蜂群生长的影响。 Bombus impatiens，美国一种广泛分布且数量丰富的本土蜜蜂（图1, 图2, 图3推测与未暴露蜂群相比，经杀菌剂处理的蜂群会表现出较低的适应度和异常的种群特征。本实验获得的数据支持了这一假设，表明花粉中的杀菌剂残留物可能是导致一种本土大黄蜂物种蜂群严重损失的唯一原因。25本研究的第二个目标是探究花粉微生物组对杀菌剂暴露的响应。我们假设，暴露于杀菌剂的花粉储备物中的微生物群落组成将与未经处理的花粉不同。虽然真菌的丰度和多样性预计会显著下降，但在缺乏其他竞争性真菌的情况下，细菌和/或某一单一优势真菌物种可能不受限制地增殖。通过一系列 体内 在这些试验中，将利用宏基因组学分析微生物群落组成的变化。

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方案

1. 利用田间围笼实验研究杀菌剂暴露对熊蜂蜂群成功率的影响

  1. 在种植燕麦的田地中设置十个网笼。在每个笼子周围挖一条沟槽，并将网笼的四边全部埋入地下，以确保蜜蜂无法逃逸。在笼内放置已知对蜜蜂具有吸引力的盆栽开花植物例如 荞麦、琉璃苣、庭荠、秋英和向日葵）图2).
  2. 在笼内添加一个三叶草开花托盘（36 cm × 42 cm）。将花卉资源集中布置在笼子的一角，占据约2.5 m × 1 m的区域。笼内其余区域种植燕麦进行植被覆盖。
  3. 随机分配每个包含工蜂和一只蜂后的熊蜂蜂群接受处理（存在/不存在杀真菌剂）， N 每处理组5个菌落，共10个菌落，然后将其放入田间笼中（N = 1/笼）饲养29天（2014年6月23日 - 7月21日）。
  4. 将蜂群箱朝向调整为巢口朝南，以提供蜜蜂最佳的导航条件。在蜂箱内放置糖水袋，对蜂群进行饲喂，以补充花蜜的不足。
  5. 在研究期间（第0天和第13天），使用手持式农药喷雾器，向五个杀菌剂处理组蜂箱中的开花植物施用基于百菌清的杀菌剂，浓度为田间实际使用水平（20 g/L），共施用两次。均匀喷洒花朵，直至花部表面不再有液滴附着为止。图3).
  6. 在野外笼室研究结束时，移除 B. impatiens 手工从蜂箱中取出蜂群，将蜂箱置于 -20 °C 冰箱中冷冻 20 分钟以降温。
  7. 使用无菌镊子移除蜜蜂，并记录幼虫、蛹、成年雌性个体的数量（i.e工蚁）、成年雄蚁。使用分析天平记录蚁后、幼虫、蛹、成年雌蚁（即 采集蜂）和成年雄蜂。

2. 利用基于实验室的方法检测杀菌剂暴露对大黄蜂蜂巢花粉储备中微生物群落的影响 体内 试验

  1. 使用标准实验室球磨机将市售花粉研磨成细粉。将花粉粉末浸入70%乙醇中进行灭菌，并在紫外光下过夜使其完全挥发。通过将约0.5 mg花粉接种于通用型琼脂培养基上，验证花粉的无菌性。
    1. 向无菌干燥的花粉中，使用无菌移液管加入田间有效剂量的杀菌剂：丙环唑（14.3%）和嘧菌酯（22.9%）处理组分别为每群蜂每天0.74 µL和0.65 µL。用无菌木棒充分混匀。
  2. 将6个实验蜂箱（对照组和处理组各3个）放置在保持室温的洁净、卫生的实验台面上。每天称取4.27 g花粉34,35 在超净工作台内，使用标准无菌技术将样品与杀菌剂（处理组）或无菌水（对照组）混合。
    1. 利用蜂箱周围纸箱侧面的活门，将花粉引入蜂箱内。每周为蜂箱补充灭菌糖溶液。持续饲喂方案四周。
  3. 实验室内研究结束后，将蜂巢置于 -20 °C 冰箱中冷却 20 分钟。使用灭菌镊子和刮刀刮出育雏室内的花粉储备物，放入无菌储存管中，于 -80 °C 保存。记录实验开始和结束时（步骤 1.7）工蜂及蜂王的数量并称重。
  4. 使用市售DNA提取试剂盒（详见材料表）从花粉供给样品中提取DNA。
    1. 加入0.25 g花粉饲料至提取管中，短暂涡旋混匀。
    2. 在去离子蒸馏水中配制 200 mg/mL 的溶菌酶溶液，每份样品使用 50 µL。剧烈振荡，直至完全溶解。
    3. 向含有样本的提取管中加入50 µL溶菌酶溶液，通过反复倒置充分混匀。将试管置于37 °C水浴中孵育10分钟。若出现沉淀，使用前将溶液加热至60 °C至完全溶解。
    4. 向提取管中加入70 µL水相裂解液，用胶带将管子水平固定在平板涡旋振荡器上，涡旋振荡10 min。在室温下以10,000 x g离心30 s。
    5. 将上清液转移至一个洁净的2 mL收集管中。加入250 µL蛋白质沉淀溶液，涡旋混匀5秒。在冰浴中于4 °C孵育5分钟。
      注意：预计上清液体积为 400 µL 至 500 µL。上清液中可能仍含有少量颗粒。
    6. 在室温下以10,000 × g离心试管1分钟，将最多600 µL上清液转移至一支洁净的2 mL收集管中。加入200 µL水相抑制剂去除液，短暂涡旋混匀，于4 °C孵育5分钟。在室温下以10,000 × g再次离心试管1分钟。将最多750 µL上清液转移至另一支洁净的2 mL收集管中。
    7. 向上清液中加入 1200 µL 水相结合溶液，涡旋振荡 5 秒。取约 675 µL 上清液加入离心过滤柱中，在室温下于 10,000 x g 离心 1 分钟。弃去滤过液。
    8. 重复步骤 2.4.7 两次。
      注意：每份处理的样品总共需要上样三次。
    9. 加入500 µL乙醇，在室温下以10,000 x g离心30秒。弃去滤液，再次在室温下以10,000 x g离心1分钟。将离心滤膜置于干净的2 mL收集管中。
    10. 向滤膜中心加入 100 µL 洗脱缓冲液。在室温下以 10,000 × g 离心 30 秒。弃去离心滤柱。将收集的 DNA 储存于 -20 °C 至 -80 °C。
  5. 使用分离的DNA进行测序。
    1. 通过荧光分析法对分离的DNA进行定量，并归一化至2 ng/µL。
      1. 为每个提取的样品设置三个重复反应，以比较各样品中28S（植物）、ITS（真菌）和16S（细菌）组分的相对含量36确保每个反应体系包含10 ng总DNA、2×基于不对称花青染料的预混液，以及2.5 µL的正向和反向引物对28KJ/28B37 用于植物和真菌DNA的ITS1/ITS5.8R38.
    2. 使用以下参数扩增DNA：50 °C预变性2分钟，95 °C初始变性2分钟，40个循环（98 °C 15秒，58 °C 15秒，72 °C 60秒），随后进行熔解曲线分析。
    3. 使用靶向16S rRNA V3/V4可变区和ITS/5.8S rRNA间隔区的下一代测序文库，建立两步法巢式PCR方案。
      1. 将12.5 µL DNA加入含5 pmol每种引物和2x预混液的反应体系中。每个区域（16S或ITS；参见 表1）。按先前所述方法修饰区域特异性引物39,40 为基因特异性序列添加测序仪特异性接头悬垂核苷酸序列。
      2. 使用以下参数进行初始扩增：95 °C 预变性 3 分钟，25 个循环（95 °C 30 秒，55 °C 30 秒，72 °C 30 秒），72 °C 最终延伸 5 分钟。
      3. 初始扩增后，通过电泳迁移率检测文库大小和浓度，并使用1倍体积的固相可逆固定化磁珠进行纯化，以去除残留引物和反应试剂。将16S和ITS扩增子定量混合，为每个样本构建单一的扩增子文库。
      4. 使用以下引物添加测序仪特异性接头和样本特异性双端索引（参见 表1加入2.5 µL扩增DNA、每种引物各5 pmol以及2×预混液。文库扩增反应程序如下：95 °C预变性3 min；进行8个循环，每个循环包括95 °C变性30 s、55 °C退火30 s、72 °C延伸30 s；最后72 °C延伸5 min。
    4. PCR完成后，使用1倍体积的固相可逆固定化磁珠纯化文库。分别通过电泳迁移率和荧光测定法评估文库的质量和浓度。将文库标准化至2 µM，测序前进行混合。
    5. 在与二次PCR中添加的接头相似的测序平台上进行下一代测序，选择适当的读长以覆盖整个扩增子41.
  6. 序列注释与微生物组成分析
    1. 将所有测序文库的成对末端测序数据（R1 和 R2）合并为单条重叠群。在合并 R1 和 R2 文件后，每个文库生成一个单独的 fasta 文件。
      注意：此步骤及以下所述操作（除非另有说明）均在 Mothur 1.38.0 版本中进行38.
    2. 对每个fasta文件进行筛选，以去除含有模糊碱基、意外长序列以及长同聚物的序列。
      注意：两个基因的筛选和序列去除参数均为 maxambig = 0、maxlength = 600 和 maxhomop = 8。去除完全相同的序列，但为所有文库单独保留一个计数表（即 Mothur 中的 count table）。
    3. 将16S基因文库的独特序列比对至SILVA数据库版本123，将ITS基因文库的独特游戏副本比对至UNITE ITS数据库42.
      注意：序列必须从界级到属级进行注释。
      1. 随后，使用 pre.cluster 函数对序列进行聚类比对（diff=5），并去除嵌合体。
    4. 使用 Wang 方法对序列进行分类43 基于 SILVA（针对 16S 基因）和 UNITE ITS（针对 ITS 基因）分类文件（阈值为 80%）。
    5. 载入 R44 在Mothur分类过程中生成的列联表（每个基因一张表）。在每个分类学层级上，获取每个文库的相对丰度，以用于进一步分析微生物群落的变化。
      注意：在每个分类学层级上，当所有实验重复中的相对丰度均低于2%时，将这些分类学类群合并。

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结果

田间笼室试验：

来自蜂群实验的数据表明，熊蜂群体对杀菌剂暴露有显著反应。与对照蜂群（43.2 ± 11.2，均值 ± 标准误）相比，经杀菌剂处理的蜂群产生的工蜂数量显著更少（12.2 ± 3.8，均值 ± 标准误；F1,9= 6.8，p = 0.03）（图4）。此外，杀菌剂处理蜂群的蜂体生物量（0.91 g ± 0.15）也显著低于对照蜂群（2.36 g ± 0.55；F1,9 = 8.3，p = 0.02）。在蜂后个体中也观察到杀菌剂处理蜂群生物量降低的趋势。杀菌剂处理蜂群的蜂后生物量（0.14 g ± 0.04）显著低于对照蜂群的蜂后（0.27 g ± 0.01；Z = 2.5，p = 0.01）。然而，杀菌剂暴露对各处理组中幼...

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讨论

关于杀菌剂对蜜蜂健康影响的研究在害虫管理策略中仍是一个研究不足的领域。本研究旨在通过一系列互补的技术手段，明确分离导致蜜蜂种群衰退的潜在因素，从而填补这一知识空白。以下详细介绍了这些实验的设计、原理和实施方法。

必须确保蜂群实验的网罩中没有蜜蜂逃逸，否则会影响种群动态分析。人工蜂巢应具备足够的隔热性能，以防止雨水浸入和阳光直射。应注意避免将杀菌剂直接喷洒在蜂巢上。应为蜂群提供糖水囊，以补充采集的花蜜并防止脱水。

在实验室喂养试验中，制备花粉饲料时应严格保持无菌条件，以防止污染。 commercially purchased pollen 在使用前必须研磨成粉末并进行紫外线灭菌。必须保持蜂巢卫生，以防止 pantry moths 和蟑螂等外来寄生虫的侵扰。应为流体囊补充灭菌的糖溶液，以防止蜜蜂脱水。在进行预处理普查时，应注意避免因过度操作或长时间将蜜蜂置于蜂巢外而使其受到应激。

由于DNA产量取决于起始材料的年龄和类型，因此DNA提取与扩增必须使用新鲜或保存良好的冷冻样品。...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢威斯康星大学生物技术中心DNA测序设施提供的扩增和测序设备与服务，感谢Caitlin Carlson、Jennifer Knack、Jake Otto和Max Haase在分子分析方面提供的技术支持。本研究得到了美国农业部农业研究局拨款资金（当前研究信息系统编号 #3655-21220-001）的支持。额外支持来自美国国家科学基金会（资助号 DEB-1442148）、美国能源部大湖生物能源研究中心（美国能源部科学办公室 BER DE-FC02-07ER64494）以及美国农业部国家食品与农业研究所（Hatch项目 1003258）。C.T.H. 是生物医学科学Pew学者及Alfred Toepfer教师研究员，分别由Pew慈善信托基金和亚历山大·冯·洪堡基金会资助。作者感谢Hannah Gaines-Day和Olivia Bernauer对我们早期已发表的田间工作的贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Natupol 蜂箱KoppertUSRESM116 个蜂箱
丙环唑 14.3Quali-Ppro60207-90-1丙环唑 14.3%
阿米西达（Abound）先正达（Syngenta）4033540嘧菌酯 22.9%
百菌清（Chlorothalonil）先正达（Syngenta）3452用于试验的杀菌剂
花粉颗粒Bee rescuedB004D5650C3 瓶 16 盎司，用于试验的花粉
用于接种的细菌菌株Currie 实验室
用于接种的酵母菌株Hittinger 实验室
引物对威斯康星大学生物技术中心（UW Biotech Center）
DNA 提取试剂盒Mo Bio12830-50商用 DNA 提取试剂盒
Qubit dsDNA HS 定量试剂盒赛默飞世尔科技（Thermo Fisher）Q32851DNA 定量工具
CFX 用 Select Master Mix赛默飞世尔科技（Thermo Fisher）4472952用于使用 SYBR GreenER 染料进行实时 PCR
实时荧光定量 PCR 检测系统Bio Rad1855196用于 PCR 扩增的仪器
PCR 产物纯化试剂盒Axygen10159-696用于高效去除未掺入的 dNTP、盐类和酶
DNA 1000 试剂盒安捷伦（Agilent）5067-1504用于 DNA 片段的大小测定与分析
MiSeq 测序仪Illumina用于高通量测序
各种玻璃器皿（烧杯、烧瓶、移液管、试管、多通道移液器）VWR

参考文献

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实证、宏基因组学与计算技术揭示杀菌剂损害蜜蜂健康的作用机制
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