在三维肝模型中研究人肝细胞癌细胞系HepG2再增殖的病毒载体

摘要

脱细胞大鼠肝脏的再细胞化细胞外基质可作为人源化的三维ex vivo模型，用于研究病毒或病毒载体的分布及其转基因表达。

摘要

本方案描述了一种三维（3D）模型的构建方法 离体 肝脏模型及其在病毒载体系统研究与开发中的应用。该模型通过将去细胞化大鼠肝脏的细胞外基质重新接种人肝细胞系获得。该模型可在血管化的三维细胞系统中开展研究，替代可能对活体动物造成伤害的实验。另一优势在于该模型具有人源化特性，相较于动物模型更接近人体生理状态。

在本研究中，我们展示了利用腺相关病毒（AAV 载体）衍生的病毒载体对这一肝脏模型进行转导。为三维肝脏模型提供培养基的灌注回路可便捷地施加该载体。该系统允许监测肝脏的主要代谢参数。在最终分析时，可采集组织样本，通过组织学技术评估再细胞化的程度。病毒载体的分布情况以及所递送的外源基因的表达水平可通过定量 PCR（qPCR）、Western 印迹和免疫组织化学进行分析。该载体模型在基础研究及基因治疗应用开发中具有广泛的应用前景，包括新型抗病毒药物的研发、癌症研究以及病毒载体及其潜在副作用的研究。

引言

目前大多数生物医学研究依赖于两种方法之一：二维（2D）细胞培养实验或本质上为三维（3D）的动物模型。然而，这些方法存在一些严重缺陷。在2D培养条件下生长的细胞，其基因表达模式和细胞生理特性已被证明与在3D条件下培养的细胞存在差异¹。动物模型除了涉及伦理问题外，通常也不能很好地模拟人体生理。尽管在首次进行人体给药前，必须通过动物模型确认化合物无明显毒性作用，但已有多个案例记录显示，在临床试验中出现了严重的、有时甚至是致命的不良反应²。

为了克服这些局限性，人源化的三维ex vivo器官模型已成为重要的研究工具。在适宜条件下培养时，细胞会自组装形成称为球状体的三维结构。然而，这些球状体缺乏血管系统，从而限制了小分子化合物、大分子生物制剂以及病毒载体的分布。例如，腺病毒载体仅能转导由人胶质母细胞瘤制备的球状体的外层细胞。³ 解决这一问题的方法是使用包含血管系统的器官模型。为此，可将目标器官从动物体内取出，并用人类细胞替代动物细胞。已有多种通过去污剂或牛磺胆酸钠处理来脱细胞化动物肝脏的方法被报道。^4-6 所获得的细胞外基质（ECM）含有调控多种细胞过程的细胞因子和生长因子。⁷ 该基质可作为支架，用于接种人类细胞以重建细胞，从而获得功能性的器官模型。

在最近的一项研究中，我们使用人源化的三维肝脏模型来研究腺相关病毒（AAV）载体的分布及其外源基因的表达。⁸ AAV载体是目前基因治疗应用中最有前景的病毒载体之一。⁹ 在西方世界，首个且迄今为止唯一获批的基因治疗干预手段即采用AAV载体来递送脂蛋白脂酶基因。¹⁰

方案

注意：R.L. 已获得Landesamt für Gesundheit und Soziales（LaGeSo）关于器官离体的伦理批准。肝脏取自Wister大鼠。使用22 G套管插管肝脏的下腔静脉和门静脉。既往已有文献描述离体肝脏脱细胞的方法^4,5。本研究所用的细胞外基质通过用1%脱氧胆酸钠对大鼠肝脏进行大量灌注获得。

1. 大鼠肝脏细胞外基质（ECM）的再细胞化

1. 肝细胞系 HepG2 的扩增
   1. 在添加了10%胎牛血清、2 mM 谷氨酰胺以及各2 mM 青霉素和链霉素的 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 培养基中培养肝细胞癌细胞系 HepG2。
   2. 将 1.5 × 10⁷ 个细胞接种于 T175 培养瓶中，在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养。4 天后，在 37 °C、5% CO₂ 条件下用胰酶消化 5 分钟收集细胞。
   3. 以 300 × g 离心细胞，弃上清，用 4 ml PBS 重悬细胞，并在显微镜下使用血细胞计数板（Neubauer 计数室）进行细胞计数。一个 T175 培养瓶可获得约 4.5 × 10⁷ 个细胞。
      注意：确保细胞培养数量足够，以满足每个大鼠肝脏 ECM 的再细胞化需求（每个 ECM 需要 6 × 10⁸ 个 HepG2 细胞；共需 10 个 175 cm² 培养瓶，每瓶含 4–5 × 10⁸ 个细胞）。

图1. 生物反应器系统。 A) 该生物反应器系统为定制装置，可维持器官模型处于37 °C和5% CO₂环境中。蠕动泵的流速可单独调节。B) 肝脏置于生长室中，并连接至灌注回路，该回路由蠕动泵、培养基储液器、气泡捕获器和压力传感器组成。请点击此处查看此图的放大版本。

2. 细胞外基质的再细胞化
   1. 设置生物反应器系统，包括肝脏灌注室、灌注系统、培养基储液器和气泡捕获装置。对生物反应器系统进行灭菌处理（121 °C，15 分钟）。
   2. 将生物反应器系统与蠕动泵连接，并置于提供适宜条件的培养箱中（37 °C，5% CO₂）。将去细胞化的大鼠肝脏支架⁸放置于生物反应器系统的肝脏灌注室内（图 1）。
   3. 使用管夹将插管的门静脉和下腔静脉连接至灌注系统。以 1.25 ml/min 的流速，用 150 ml RPMI 培养基（如步骤 1.1 所述）对支架进行 5 天的平衡灌注。
   4. 将肝脏支架从培养基回路中断开，通过门静脉使用 5 ml 注射器接种 3 × 10⁸ 个 HepG2 细胞（溶于 5 ml 培养基中），避免产生气泡，并在关闭泵的情况下孵育 1 小时，使细胞在支架内重新定植于细胞外基质中。
   5. 通过调节泵逐步增加流速：先以 1.25 ml/min 运行 10 分钟，再以 2.5 ml/min 运行 20 分钟，最后以 3.75 ml/min 运行 30 分钟。
   6. 重复步骤 1.2.4–1.2.5，使总细胞数达到 6 × 10⁸。
   7. 以 3.75 ml/min 的流速持续运行生物反应器系统，对再细胞化的大鼠肝脏进行为期 2 周的培养。
      注意：每隔一天更换三分之一的新鲜培养基（50 ml）。取样培养基以检测生理参数，如乳酸脱氢酶活性、培养基样品的 pH 值以及葡萄糖和乳酸的浓度。

2. 大鼠再细胞化肝脏的转导

1. 腺相关病毒载体的大规模生产
   1. 按照先前所述方法生产、纯化并定量腺相关病毒载体：¹¹
      1. 简言之，在旋转瓶中生产腺相关病毒载体，并通过碘克沙醇梯度离心法进行纯化。使用PD10凝胶过滤柱过滤以去除残留的碘克沙醇。以基因组腺相关病毒DNA作为标准品，通过qPCR测定腺相关病毒载体浓度。
         注意：本研究中使用的自互补假型AAV2/6载体编码EmGFP作为报告基因以展示转导效率，同时包含一个shRNA表达盒用于敲低内源性表达的基因（人亲环素B（hCycB），图2）。确保获得足量的6型假型自互补腺相关病毒载体（每肝模型2.7 × 10¹³ 腺相关病毒载体）。

图2. 本研究中使用的自互补假型AAV2/6载体的图谱。 该基因组包含AAV2的反向末端重复序列（ITR），并在CMV启动子控制下编码EmGFP，同时在U6启动子控制下编码一段shRNA。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 肝脏模型的转导
   1. 通过加入相应体积的 PBS，将 AAV 载体溶液调整至最终浓度为 5 ml 中含 2.7 x 10¹³ 个载体基因组。
   2. 移除插管上的管路，将肝脏与培养基循环系统断开。将一个 5 ml 注射器连接至门静脉插管，并注入全部 AAV 载体溶液（5 ml）。
      注意：可选择性加入酚红（5 µg/ml），以追踪 AAV 载体溶液在肝脏中的分布情况。
   3. 在无泵流条件下孵育 1 小时。随后逐步增加流速：先以 1.25 ml/min 持续 10 分钟，再以 2.5 ml/min 持续 20 分钟，最后以 3.75 ml/min 持续 30 分钟。将重新接种细胞的大鼠肝脏继续培养 6 天。
      注意：参照步骤 1.2.7 中的注意事项，更换三分之一的培养基。

3. 转导大鼠肝脏再细胞化的评估

1. 苏木精-伊红（HE）染色与免疫组织化学分析
   1. 使用手术刀从每个肝叶取样（0.5 × 0.5 × 1.5–2 cm）。
   2. 将样品（来自3.1.1）在4%多聚甲醛（PFA）+ 4%蔗糖溶液中4 °C孵育1.5小时。（注意：PFA具有毒性且为致癌物。操作时务必在通风橱内进行，并穿戴适当的防护服。）用PBS洗涤三次（每次洗涤1分钟），然后在4%蔗糖溶液中4 °C过夜孵育。
   3. 将固定液倒入塑料冷冻模具中，将样品置于无气泡的固定液中，加入足够固定液完全覆盖样品。将包埋的样品储存于-80 °C，待后续使用。
   4. 使用冷冻切片机¹²制备冷冻切片（10 µm）。通过苏木精+伊红染色⁸评估再细胞化情况。通过针对目的基因（此处为EmGFP）的免疫组织化学染色评估转导效率。
2. 分子生物学取样
   1. 使用活检打孔器（直径4 mm）对每个肝叶取样。根据试剂盒说明书提取总RNA、DNA和蛋白质，用于检测EmGFP转基因表达及hCycB基因的敲低效果⁸。

结果

为了评估再细胞化的程度，从每个再细胞化肝脏模型的每个叶制备了冷冻切片。随后通过苏木精和伊红染色对切片进行分析。如图3所示，三个肝脏模型的每个叶（分别标记为TLM1、TLM2（转导肝脏模型1和2）以及Ctrl（再细胞化但未转导的对照肝脏模型））均已被HepG2细胞重新定植。该肝细胞癌细胞系源自一名15岁阿根廷男孩的肿瘤组织。部分区域的再细胞化程度较其他区域更为密集。这些差异产生的原因仍有待确定。

图 3. 三种分析肝脏模型各叶的苏木精-伊红染色结果。 TLM1+2：转导的肝脏模型1和2；Ctrl.：重新细胞化的对照肝脏模型，但未进行转导。比例尺：200 µm。（经参考文献8许可重印。） 请点击此处查看该图的放大版本。

下一步评估了肝模型的转导效果。为此，从每种肝模型的28个穿孔活检样本中提取DNA，并通过qPCR定量载体滴度。两种转导肝模型平均每细胞分别检测到55和90个内化载体基因组（VG/细胞）。二维细胞培养实验表明，每细胞30个载体基因组已足以实现高效的外源基因表达及RNA干扰介导的基因沉默。通过RT-PCR和Western印迹分析EmGFP的产生情况。事实上，在mRNA和蛋白质水平上，分别在80%–90%的活检样本中检测到报告基因的表达⁸。为全面评估转导效率，对冷冻切片进行了免疫组织化学分析。如图4所示，经DAPI染色显示成功再细胞化的肝模型区域，在EmGFP表达的免疫组织化学分析中也呈现出强烈的荧光信号。正如预期，未经AAV载体处理的对照肝模型未显示任何EmGFP表达。

图4. EmGFP表达的免疫组织化学分析。 通过DAPI染色（蓝色）观察定植于肝脏模型中的细胞；EmGFP表达通过免疫化学染色（红色）观察。TLM1+2：转导的肝脏模型1和2；Ctrl.：重新接种细胞但未进行转导的对照肝脏模型。比例尺：200 µm。（经参考文献8许可重印。） 请点击此处查看该图的放大版本。

在最终测试中，通过qRT-PCR分析了AAV介导的hCycB基因敲低效果。在两个转导的肝脏模型的所有叶中，hCycB基因的敲低效率介于70%至90%之间，平均值如（图5）所示。

图5. RNAi介导的基因敲低 hCycB 在AAV转导的三维肝模型中。 基因沉默 hCycB 通过qRT-PCR测定。对每种转导的三维肝模型（TLM1和TLM2）的所有样本计算均值和标准差（SD），并以未转导对照组（Ctrl.）的均值为基准进行归一化。（转载自参考文献8，经许可。） 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

本文所述的重建三维肝脏为在人源化系统中研究病毒载体提供了一种模型。利用人肝细胞癌细胞系重建造大鼠肝脏的细胞外基质，可生成具有血管化的系统，从而允许对大分子生物制剂进行研究。这些结果证明了该重建肝脏模型可被病毒载体高效转导的概念可行性。

在本实验中，肝脏的每个叶均被AAV载体转导。然而，在一些初步实验中，发现单个肝叶未被细胞充分占据。因此，防止细胞碎片或其他成分阻塞血管系统至关重要。为检测所有肝叶是否均可灌注，可通过肝脏模型灌注酚红等无毒染料进行验证。

另一个关键问题是保持肝脏支架的无菌状态。虽然使用乙醇或抗生素处理对血管系统具有不利影响，但采用γ射线照射细胞外基质可有效保存血管结构并实现样本的灭菌。

此外，移植肝脏的大小会存在差异，因此可能需要调整用于再细胞化过程的细胞数量和再殖时间，以获得可重复的实验结果。

本研究中使用的大鼠肝脏相对较大，需要大量的细胞和检测试剂（例如，AAV 载体）。此外，再殖过程耗时超过两周，这限制了在合理工作量下可完成的重复实验次数。我们目前正在建立小鼠肝脏模型，其体积仅为大鼠肝脏的约五分之一，因而可减少细胞和检测试剂的使用量。尽管按比例减少细胞数量似乎是合理的，但确切的用量仍需通过进一步实验来确定。

当前模型的另一个不足之处在于使用了肝细胞 HepG2 细胞系。目前正在进行实验，以开发使用由诱导性多能干细胞分化而来的肝细胞，这将提供一个在生理上更具相关性的模型。此外，肝脏除了肝细胞外，还包含多种其他细胞类型，e.g.，库普弗细胞和肝窦。我们假设，当向细胞外基质（ECM）重新接种多种细胞类型时，不同类型的细胞将定植于其天然的微环境中。

3D 肝脏模型结合了多种优势。传统 in vivo 模型的一个主要缺点是动物生理学与人类生理学存在显著差异。因此，治疗人类患者时可能出现的毒性副作用可能无法被检测到。通过使用更接近人类患者生物学特征的人源细胞重建 3D 肝脏模型，可以克服这一不足。

肝脏模型的第二个优势在于其对动物福利的贡献。尽管重建实验需要使用动物组分，但该方法仍然遵循3R原则（替代、减少、优化）的目标，可利用因其他动物实验而被处死的多余动物。 即，无需额外使用动物，且该方法完全避免了常与动物实验相关的动物痛苦 体内 实验。类球体是研究三维体系中细胞过程的替代工具。然而，类球体不具备血管化结构，因此大分子物质和生物制剂无法深入渗透至其内部区域。这些问题已通过血管化的三维肝模型得以解决。

在本研究所描述的实验中，腺相关病毒（AAV）载体被作为研究对象，因为它们是基因治疗应用中最具有前景的候选载体之一。由于大量基因治疗策略旨在靶向肝脏， 例如， 用于治疗乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染，或α-1-抗胰蛋白酶缺乏症时，该3D肝脏模型可用于这些腺相关病毒（AAV）载体的开发过程。当然，它也适用于其他嗜肝病毒载体的研究。 例如腺病毒载体。此外，该模型还可用于研究感染性肝炎病毒，如乙型或丙型肝炎病毒，并可用于设计新的抗病毒策略。再者，三维器官模型是开发新型抗癌细胞毒药物及开展毒理学研究的有力工具。从长远来看，人工肝脏有望作为移植材料应用于再生医学。综上所述，三维肝脏模型在感染生物学及其他生物医学研究领域具有广泛的应用前景。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养箱	Fraunhofer	/
蠕动泵	Fraunhofer	/
带凹槽法兰	Duran	2439454	经gaffer修改
透明O型圈	Duran	2922551
快速夹钳	Duran	2907151
平法兰盖	Duran	2429857	经gaffer修改
螺纹管	Duran	2483802	经gaffer修改
螺纹管	Duran	2483602	经gaffer修改
硅胶密封圈	Duran	2862012
螺口盖	Duran	2924013
螺口盖	Duran	2924008
带孔螺口盖	Duran	2922709
带孔螺口盖	Duran	2922705
滤器	Sarstedt	831,826,001
硅胶管	VWR	228-1500
管路连接头	Ismatec	ISM556A
生物相容性管路	Ismatec	SC0736
T175培养瓶	Greiner bio-one	660 160
RPMI 1640	BioWest SAS (Th. Geyer)	L0501-500
谷氨酰胺	BioWest SAS (Th. Geyer)	X0551-100
胰蛋白酶	BioWest SAS (Th. Geyer)	L0940-100
青霉素/链霉素	BioWest SAS (Th. Geyer)	L0022-100
胎牛血清	cc pro	S-10-M
Tissue-Tek O.C.T.	Weckert-Labortechnik	600001
HepG2	DSMZ	ACC 180
冷冻模具 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566
4 mm活检打孔器	pfm medical	48401
Nucleospin miRNA	Macherey & Nagel	740971.10
Nucleospin RNA/DNA缓冲液套装	Macherey & Nagel	740944